辣椒Me3基因介导抗根结线虫相关基因的SSH分析

以辣椒（Capsicum annuum L.）双单倍体HDA149为试验材料,接种南方根结线虫（Meloidogyne incognita）12、24、36 h的根尖材料作为测验方(Tester),相应的未接种根尖材料作为驱动方(Driver),构建一个南方根结线虫诱导Me3 基因表达早期的抑制消减杂交cDNA文库,通过高密度点阵膜杂交差异筛选,获得了309条表达序列标签(EST)。通过测序,除去重复序列共得到259条EST序列,在GenBank上进行BLAST分析,30个EST片段未发现同源性基因,229个为具有同源性的已知基因,其中71个为功能未知的基因。在显微观察和抗性相关EST表达谱分析的基础上,推测在Me3基因介导的不亲和互作中,编码NBS-LRR结构的抗病基因参与了寄主对根结线虫的识别,激发了过敏性坏死反应的信号基因, 同时多种抗性相关的转录因子基因表达, 使以代谢为基础的防御反应和保护机制发挥抗线虫作用。     

辣椒全基因组WRKY转录因子的分析

基于已公布的辣椒全基因组数据,利用生物信息学方法对辣椒WRKY转录因子家族进行全面鉴定和系统命名,并在此基础上对基因分类、染色体定位、系统进化关系和结构域序列保守性进行了研究。结果表明:辣椒CaWRKY家族包含71个基因,根据WRKY结构域的数量及锌指结构的特征可将其分为GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ等3大类,GroupⅡ又可分为Ⅱ(a)、Ⅱ(b)、Ⅱ(c)、Ⅱ(d)和Ⅱ(e)等5个亚类。辣椒12条染色体上均有WRKY转录因子分布,其中第1号染色体上分布最多,共有10个,第4号染色体上分布最少,仅有2个。辣椒每类/亚类WRKY几乎含有相同的保守基序。辣椒WRKY编码的蛋白在132~869个氨基酸范围内,平均氨基酸数量为373个。     

柑橘4个WRKY转录因子基因的克隆及其响应柑橘溃疡病菌侵染的表达分析

以纽荷尔脐橙和四季橘为试验材料,基于溃疡病菌诱导的柑橘转录组数据库,利用PCR方法克隆获得4个WRKY家族基因Cs WRKY22、Cs WRKY50、CsWRKY72-1和CsWRKY72-2的cDNA全长序列。序列分析结果表明,这4个基因的cDNA全长分别为1 123、1 312、1 809和2 208 bp,开放阅读框长度分别为921、480、1 809和1 767 bp,各编码306、159、602和588个氨基酸。氨基酸序列和结构分析显示,这4个基因属于第Ⅱ类WRKY蛋白。进化树分析显示,所克隆的4个柑橘WRKY蛋白与可可、葡萄等WRKY蛋白亲缘关系较近。亚细胞定位显示,所克隆的4个WRKY基因定位于细胞核,与亚细胞定位预测相符。对纽荷尔脐橙和四季橘中4个基因受溃疡病菌诱导的表达分析表明,CsWRKY22参与寄主的感病反应,而CsWRKY50参与抗溃疡病的免疫应答反应。柑橘溃疡病菌能抑制CsWRKY72-1和CsWRKY72-2介导的寄主基础免疫。水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理表明,4个Cs WRKY基因均不参与SA和MeJA介导的寄主抗病和抗逆反应。     

甘蓝中硫氧还蛋白编码基因THL1的分子特性及表达研究

采用PCR和RT2PCR技术, 以‘E1’甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对THL1基因进行扩增克隆, 得到的片段长度分别为732 bp和455 bp。序列分析表明, 克隆的DNA和cDNA序列与甘蓝‘西园四号’THL1的DNA和cDNA同源性分别为97.9%和98.3%, 两条序列内含子的大小不同; 同时, 前者第2内含子不符合典型的GT2AG规则: 即第2个内含子3′端碱基为AT。将THL1基因cDNA序列定向克隆到原核表达载体pET-43.1a ( + ) , 构建融合表达质粒pET43.1a ( + ) -THL1, 在大肠杆菌BL21中表达出分子量为74kD的融合蛋白, 经胰岛素检测, THL1有氧化还原活性, 表明THL1在大肠杆菌中得到了正确表达。     

南方根结线虫辣椒Me3毒性群体适合度代价及专化性分析

 将南方根结线虫自然群体在含有Me3抗线虫基因的辣椒HDA149上连续选择15代,获得了一对针对辣椒（Capsicum annuum L.）抗线虫基因Me3的南方根结线虫毒性和无毒近等基因系。通过将Me3毒性线虫接种在抗病辣椒HDA149、感病辣椒茄门以研究适合度代价,结果显示,南方根结线虫Me3毒性群体在感病辣椒上存在适合度代价,适应值仅为76%。将Me3毒性线虫接种在含有其它抗线虫基因（Mi、Me）的番茄和辣椒上研究南方根结线虫Me3毒性的专化性,结果表明Me3毒性线虫不能在含有Mi抗线虫基因的番茄上产生根结和卵块,但是可以在含有其它Me基因的辣椒上产生卵块。说明南方根结线虫Me3毒性对抗性基因Me 存在专化性。     

广州地区番石榴根结线虫鉴定与14-3-3基因的克隆

【目的】摸清广州地区番石榴根结线虫的种类、分布及致病机制。【方法】观察番石榴根结线虫的雄虫、二龄幼虫、雌虫及其会阴花纹的形态学特征,根据根结线虫的通用引物#C2F3和#1108对线虫mt DNA的COⅡ和lr RNA基因间序列进行PCR扩增,获得750 bp的特异扩增产物,将扩增片段在Gen Bank上进行Blast比对。通过南方根结线虫与北方根结线虫的14-3-3序列设计简并引物,进一步扩增已鉴定的象耳豆根结线虫的14-3-3基因。【结果】广州地区番石榴根结线虫的形态与象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)相似;其扩增片段与象耳豆根结线虫(M.enterolobii)比对,序列相似性在99%以上。扩增了象耳豆根结线虫的14-3-3基因,结果显示该基因的开放阅读框包含783 bp的片段,编码261个氨基酸,命名为Me-14-3-3。【结论】广州地区番石榴根结线虫为象耳豆根结线虫(M.enterolobii),14-3-3蛋白基因被成功克隆,扩增结果为进一步研究14-3-3蛋白基因在象耳豆根结线虫生长发育中的功能、摸清致病机制等方面奠定良好的基础。     

西瓜抗根结线虫相关基因的克隆与表达分析

【目的】筛选西瓜(Citrullus lanatus)抗根结线虫相关基因,克隆其全长CDS序列,检测根结线虫接种后其在抗病材料和感病材料中的表达特征,分析其与西瓜根结线虫抗性的关系。【方法】以抗根结线虫的野生西瓜‘09005’和易感根结线虫的栽培西瓜‘ZDPI0006’为试材,用已知的植物抗线虫基因在葫芦科基因组数据库中比对,从结果中筛选到西瓜的相关基因Cla006580,与甜菜抗孢囊线虫基因Hs1~(pro-1)同源性达到65%,命名为Cla Hs1~(pro-1)。克隆Cla Hs1~(pro-1)基因的CDS区序列并进行生物信息预测分析,在根结线虫接种处理和CK处理72 h内利用q RT-PCR技术检测不同抗性的西瓜根系中Cla Hs1~(pro-1)的表达特征。【结果】从野生抗病西瓜‘09005’和栽培易感西瓜‘ZDPI0006’中均克隆得到Cla Hs1~(pro-1)基因,CDS区序列全长1 434 bp,编码478个氨基酸,含有Hs1pro-1_N和Hs1pro-1_C两个蛋白保守结构域,抗、感材料之间存在4个SNP位点。RT-PCR分析显示‘09005’在接种根结线虫后Cla Hs1~(pro-1)表达趋势呈先抑后扬,而在CK中呈先扬后抑,二者相反;‘ZDPI0006’在接种根结线虫后Cla Hs1~(pro-1)表达趋势呈先上扬后抑制再上扬,与CK中表达趋势一致。【结论】西瓜Cla Hs1~(pro-1)基因在抗病材料中表达特征与根结线虫接种密切相关,而在感病材料中与根结线虫接种无明显相关性,是西瓜抗根结线虫可能的候选基因。     

桃EXPANSIN基因家族序列特征及其在根结线虫侵染后的诱导表达分析

【目的】探索扩张蛋白(EXPANSIN)基因家族在桃抗南方根结线虫过程中的作用。【方法】首先对桃基因组中的EXPANSIN基因家族进行生物信息学分析,然后利用转录组测序对EXPANSIN基因在南方根结线虫侵染免疫型(‘红根甘肃桃1号’)和高感型(‘贝蕾’)桃种质根系后的不同时期的表达丰度进行分析。【结果】桃EXPANSIN基因家族有27个成员,这些成员分布在8条染色体上,以第2和第5号染色体上最多,均为5个。基因结构分析显示,这些基因包含1~5个外显子,大部分EXPANSIN基因包含DPBB_1和Pollen_allerg_1保守结构域,聚类分析将这27个成员分为2大类,其中有8个与拟南芥中已注释的与线虫侵染过程中巨细胞形成有关的蛋白质聚在一起,均属于EXPA亚类。转录组分析表明,这8个EXPANSIN基因在对南方根结线虫免疫和高感2种种质不同时期的表达趋势存在明显差异,其中ppa010314m、ppa010226m在‘贝蕾’中表达量随侵染上调,而在‘红根甘肃桃1号’中上调不明显,这2个基因可能是参与南方根结线虫侵染过程中巨细胞形成的关键基因。【结论】桃EXPANSIN家族成员在结构上高度保守,其中多个成员可能参与调控桃抗南方根结线虫过程。     

辣椒N 基因介导抗根结线虫作用早期表达基因的抑制性消减杂交SSH分析

 以含N 基因的辣椒(Capsicum annuum L. ) 为试验材料, 接种南方根结线虫(Meloidogyne incognita) 12、24、36 h的根尖材料作为测验方( tester) , 相应的未接种根尖材料作为驱动方( driver) , 构建一个南方根结线虫诱导N 基因表达早期的正向抑制消减杂交cDNA文库, 并结合文库高密度点阵膜杂交差异筛选, 获得了237条表达序列标签( EST) 。在GenBank上进行BLASTn与BLASTx分析, 得到148条功能已知的EST序列, 获得已知的上调抗性相关EST 68个。分离出了具有NBS2LRR结构的抗线虫蛋白和类LRR抗性蛋白的基因, 防御作用相关的类萌芽素(GLP) 、HSR203J 蛋白、蜜腺蛋白、蛇毒素肽等基因,抗性相关的WRKY、ERFBP等转录因子基因, 以及G蛋白、142323蛋白等多种信号蛋白基因。通过GeneOntology分析, N 基因介导的早期表达抗病基因涉及病原物的识别、抗性信号传导、过敏性坏死、系统获得性抗性以及植物细胞保护机制等多个方面, 并有许多功能未知的基因有待于进一步的研究。     

野生番茄LA2157中热稳定抗根结线虫基因Mi-9候选基因的分离与过表达载体构建

根结线虫是番茄上的重要土传病害,选育抗根结线虫品种是最有效的防治方法,但是目前转育到栽培番茄中的抗根结线虫基因Mi-1在土温高于28℃时就丧失了抗性。本试验利用热稳定抗根结线虫野生番茄材料LA2157,根据Mi-1基因的序列信息,对其中热稳定抗根结线虫Mi-9基因进行同源克隆,在LA2157中共获得2个候选基因片段;通过In-Fusion克隆技术,将候选基因与过表达载体p BI121进行连接,经电泳检测和测序分析,最终构建Mi-9候选基因的过表达重组载体。     

番茄砧木及品种对南方根结线虫的抗性鉴定

 为了测定3种番茄砧木及7个番茄品种对南方根结线虫的抗病程度, 采用室内盆栽番茄人工接种南方根结线虫法调查番茄植株对根结线虫的抗性指标, 结果表明: 国外引进的5 个番茄抗性品种(Trofeo、Beatrice、1411、Romana、Garry) 及两个番茄砧木( Energy、He-Man) 均为抗性品种; 荷兰的Cairo和国内的耐线虫番茄品种中华一号为感病品种, 番茄砧木Beaufort为中感品种。     

转新疆野生樱桃李psoRPM1 基因烟草抵抗南方根结线虫

 从新疆野生樱桃李（Prunus sogdiana）抗南方根结线虫单株中分离克隆得到一个能响应南方 根结线虫侵染的抗病基因psoRPM1,利用农杆菌介导方法将其导入烟草中,并对其抗性进行了鉴定。结 果显示,构建的pCAMBA1305.1 表达载体能成功地将psoRPM1 基因导入高度感病的烟草‘W38’中,并 获得了9 株转基因单株。对转基因单株进行抗性鉴定,结果显示转入psoRPM1 基因后使烟草‘W38’对 南方根结线虫的抗性由高度感病变为中度抗病。这一结果预示着psoRPM1 基因可能是一个新的与抗根结 线虫相关的基因。     

不同砧木嫁接对番茄产量、品质及南方根结线虫防治效果的影响

以不同番茄砧木为试材,研究了不同砧木嫁接对番茄产量、品质及南方根结线虫防治效果的影响。结果表明：6种砧木嫁接对番茄南方根结线虫的防治效果均在98.6%以上,高抗根结线虫。采用抗性砧木嫁接,番茄产量比自根对照提高15.4%～19.4%|砧木嫁接对接穗番茄果实可溶性蛋白、可溶性固形物和可滴定酸含量没有明显影响,但可溶性糖、VC、番茄红素和硝酸盐含量大多低于自根对照。从综合结果来看,采用抗性砧木果砧1号和特路丝进行嫁接栽培,对南方根结线虫具有很好的防治效果,对番茄品质影响较小,产量较高。     

宁夏永宁葡萄育苗圃根结线虫鉴定

对宁夏永宁县葡萄育苗圃中15个葡萄品种的根结线虫进行形态学和分子生物学鉴定。结果表明:宁夏永宁县葡萄育苗圃根结线虫病危害严重,不同葡萄品种的苗木感病症状表现不同。根据根结线虫雌虫和2龄幼虫的形态特征及雌虫会阴花纹,初步鉴定出该地区葡萄根结线虫的种类是南方根结线虫(Meloidogyne incognita)和花生根结线虫(M.arenaria)。利用根结线虫线粒体DNA(mtDNA)通用引物(C2F3/1108)及序列特异性扩增区(SCAR)特异性引物(MI-F/MI-R和Far F/Far R)对葡萄根结线虫的种类再次鉴定,鉴定结果与形态学鉴定结果一致。另外发现不同葡萄品种上根结线虫的种类与数量存在差异,南方根结线虫(M. incognita)占根结线虫群体的88.57%,为优势种群。     

西瓜种质资源抗根结线虫鉴定及防治研究

1982～1985年对河南郑州地区发生的西瓜根结线虫病作了调查和病原鉴定,结果表明,该病分布十分普遍,西瓜病株率达20％～70％。病原为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)。通过鉴别寄主试验,确认南方根结线虫、花生根结线虫为二号寄主小种;抗病性鉴定表明墨—74抗性最强,克伦生、11253、钢皮、100号、中育1号、伊选次之。並从5种杀虫剂中筛选出可用于大田防治的DD混剂。防治效果达92.1％～100％。     

黄瓜根结RDR酶基因的分离与表达分析

 基于黄瓜（Cucumis sativus L.）自交系9930全基因组序列,采用RT-PCR的方法,分离出根结形成过程中表达的RDR基因,共获得了5个CsRDR基因：CsRDR1a、CsRDR1b、CsRDR1c、CsRDR2和CsRDR6（HQ738485 ~ HQ738489）。qPCR定量分析表明,5个基因在接种根结线虫后的不同时期表达量都有不同程度的增加。CsRDR1a、CsRDR1b、CsRDR2和CsRDR6在接种线虫早期（6 h）相对表达量明显增加;而CsRDR1c在接种36 h时相对表达量达到最高,从而表明CsRDR基因与黄瓜根结的发育相关。