云南烟草丛枝症病害研究Ⅹ病原研究：植原体问题

 云南烟草丛枝症病害四环素治疗无效,可经汁液摩擦和蚜虫传染,病程表现为潜伏期、过敏反应期、缩顶期和丛枝期等4个阶段,细胞内产生质膜体和细胞质泡囊等膜系统畸形病变,病株总核酸中存在特殊的超稳定低分子量RNA,Nested-PCR在病株总核酸中(引物:R16mR1/R16mF2,R16R2/R16F2)未检测到植原体16sRNA基因。说明云南烟草丛枝症病害和烟草丛枝病是不同的病害,病原不是植原体,该病表现出病毒侵染的特征,可能由病毒或类似于病毒的病原引起。依据病害的症状和侵染特征,建议将"云南烟草丛枝症病害"称呼为"烟草簇矮病(Tobacco bushy dwarf)"。     

云南烟草丛枝症病害研究Ⅷ验证与烟草丛枝症病害相关的稳定RNA

 来自云南省22个县市的烟草丛枝症标本均检测到与云南烟草丛枝症病害相关的稳定RNA,大小相当于800bp左右的DNA;病株的根、茎、叶、花和枯叶中含有此RNA,种子中未检测到此RNA;此RNA的最大吸收峰为269nm;能被蛇毒磷酸二酯酶I消化,不具有类病毒结构特征,推测可能是病毒的基因组分;支持莫笑晗等对此RNA的结构推测,即可能是有广泛内部配对、具有类似发叉结构的线性长度为1.61kb的单链RNA。与云南烟草丛枝症病害相关的低分子量RNA目前发现的超稳定RNA。     

云南烟草丛枝症病害研究Ⅻ病原研究：病毒问题

 云南烟草丛枝症病害病程表现为潜伏、过敏反应、缩顶、丛枝等4个阶段,以过敏反应导致叶片严重坏死和枯死为前期特征,以腋芽丛生而表现为黄化丛枝症为后期特征,苗期感染形成僵苗症,大田期感染表现丛枝症;汁液摩擦接种11科32种植物发现其只侵染烟属植物,通过机械传染(嫁接、汁液) 和介体传染(菟丝子、蚜虫、烟盲蝽、叶蝉) 等方式传播,该病害与文献记载的烟草丛枝、丛顶和丛蔟类病害有明显区别,可能是未见记载的病害。在云南烟草丛枝症病株的老叶和带毒蚜虫中抽提到直径约22～24nm的球状病毒,回接烟草发病,病株检测到和云南烟草丛枝症病害相关的低分子量RNA,说明该病毒和云南烟草丛枝症病害有密切的关系,且与SBMV,VTMV,TRSV,ArMV,CarMV,CMV,BCMV,TNV等8种病毒无血清学关系,综合各项研究和文献检索结果,作者推测该病毒可能是未见记载的病毒,建议称为"烟草簇矮病毒(Tobaco bushy dwarf virus)"。     

云南烟草丛枝症病害研究Ⅳ建立标准毒株

 以蚜虫传染发生云南烟草丛枝症病害的烟株为材料进行组织培养,连续培育3代,以第3代组培烟苗为毒源经蚜虫传染健康烟株,提取毒源和各实验烟株的总核酸进行琼脂糖凝胶电泳.结果表明:第3代组培烟苗为毒源经蚜虫传染的烟株发病表现丛枝症,并检测到与云南烟草丛枝症病害相关的低分子量RNA.说明与云南烟草丛枝症病害相关的病原能在寄主离体培养组织中长期保存,成功建立云南烟草丛枝症病害的标准毒株.     

烟草丛顶病毒复制酶基因克隆及序列分析

烟草丛顶病是近年来在云南省西部的保山、大理等各大烟区频繁爆发流行的一类新的烟草病害。关于这类病害的病原 ,一直众说纷纭 ,有人认为这是一种植原体引起的“烟草丛枝病” ,有人认为这是一种病毒引起的病害。本课题组从 1 995年起对这类病害进行立项研究 ,并相继排除了植原体病原的可能 ,认为这应该是一类病毒或病毒类似物引起的病害。Ｍｏ等认为云南发生的这类烟草病害与津巴布韦发生的烟草丛顶病 (Ｔｏｂａｃｃｏｂｕｓｈｙｔｏｐｄｉｓ ｅａｓｅ)是同一种病害 ,并认为暂定为幽影病毒属(Ｕｍｂｒａｖｉｒｕｓ)的烟草丛顶病毒 (Ｔｏｂａ…     

云南烟草丛枝症病害研究Ⅲ细胞的超微病变

 超薄切片观察云南烟草丛枝症病害的病叶组织,并抽提试验材料的总核酸电泳检测,结果表明:病组织中检测到与烟草丛枝症病害相关的低分子量RNA,切片中未观察到病毒粒子,薄壁细胞中发现细胞膜系统的畸变:质膜体(plamalemmasome)和双层膜泡囊(double membranous vesicles).质膜体由细胞质膜或液泡膜伸入空泡形成,直径约1000～2000nm,结构类似于类病毒侵染寄主形成的旁壁体.双层膜泡囊是含纤维状物内含物的泡囊,直径约100～200nm,结构类似于某些病毒侵染寄主形成的细胞质泡囊(cytoplasmic vesicles)和植原体(phytoplasmas),但因其广泛分布于寄主细胞中,不能认为是植原体.文献显示这些病变是类病毒和某些病毒侵染的特征,初步认为云南烟草丛枝症病害可能是病毒病害,发病早期细胞内出现小分子核酸侵染的细胞病变特征,此与莫笑晗等发现病株体内含有大量低分子量RNA可能有密切关系.     

云南烟草丛枝症病害研究 IV建立标准毒株

以蚜虫传染发生云南烟草丛枝症病害的烟株为材料进行组织培养,连续培育３代,以第３代组培烟苗为毒源经蚜虫传染健康烟株,提取毒源和各实验烟株的总核酸进行琼脂糖凝胶电泳．结果表明：第３代组培烟苗为毒源经蚜虫传染的烟株发病表现丛枝症,并检测到与云南烟草丛枝症病害相关的低分子量ＲＮＡ．说明与云南烟草丛枝症病害相关的病原能在寄主离体培养组织中长期保存,成功建立云南烟草丛枝症病害的标准毒株．     

云南烟草丛枝症病害的超微细胞病变研究

超薄切片观察云南烟草丛枝症病害的病叶组织，并抽提试验材料的总核酸电泳检测。病组织中检测到与烟草丛枝症病害相关的低分子量RNA，切片中未观察到病毒粒子和植原体等病原，薄壁细胞中发现细胞膜系统的畸变：质膜体和细胞质泡囊，质膜体(1000～2000nm)结构类似于病毒形成的旁壁体。细胞质泡囊(100-200nm)是含纤维状物的双膜的囊。运用不同盐浓度介质的RNase处理病变细胞组织，发现高盐介质的Rnase(2XSSX)不能消解小囊泡中的纤维状物，而低盐介质的Rnase(O．01XSSC)可以消解小囊泡中的纤维状物。文献显示这些病变是类病毒和某些病毒侵染的特征，初步认为这是云南烟草丛枝症病害发病早期细胞内出现小分子核酸侵染的细胞病变特征。     

云南烟草丛枝症病害研究 Ⅷ 验证与烟草丛枝症病害相关的稳定RNA

来自云南省２２个县市的烟草丛枝症标本均检测到与云南烟草丛枝症病害相关的稳定ＲＮＡ,大小相当于８００ｂｐ左右的ＤＮＡ;病株的根、茎、叶、花和枯叶中含有此ＲＮＡ,种子中未检测到此ＲＮＡ;此ＲＮＡ的最大吸收峰为２６９ｎｍ;能被蛇毒磷酸二酯酶Ｉ消化,不具有类病毒结构特征,推测可能是病毒的基因组分;支持莫笑晗等对此ＲＮＡ的结构推测,即可能是有广泛内部配对、具有类似发叉结构的线性长度为１６１ｋｂ的单链ＲＮＡ．与云南烟草丛枝症病害相关的低分子量ＲＮＡ目前发现的超稳定ＲＮＡ．     

云南烟草丛枝症病害研究 II细胞的超微病变

超薄切片观察云南烟草丛枝症病害的病叶组织,并抽提试验材料的总核酸电泳检测,结果表明：病组织中检测到与烟草丛枝症病害相关的低分子量ＲＮＡ,切片中未观察到病毒粒子,薄壁细胞中发现细胞膜系统的畸变：质膜体（ｐｌａｍａｌｅｍｍａｓｏｍｅ）和双层膜泡囊（ｄｏｕｂｌｅｍｅｍｂｒａｎｏｕｓｖｅｓｉｃｌｅｓ）．质膜体由细胞质膜或液泡膜伸入空泡形成,直径约１０００～２０００ｎｍ,结构类似于类病毒侵染寄主形成的旁壁体．双层膜泡囊是含纤维状物内含物的泡囊,直径约１００～２００ｎｍ,结构类似于某些病毒侵染寄主形成的细胞质泡囊（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｖｅｓｉｃｌｅｓ）和植原体（ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｓ）,但因其广泛分布于寄主细胞中,不能认为是植原体．文献显示这些病变是类病毒和某些病毒侵染的特征,初步认为云南烟草丛枝症病害可能是病毒病害,发病早期细胞内出现小分子核酸侵染的细胞病变特征,此与莫笑晗等发现病株体内含有大量低分子量ＲＮＡ可能有密切关系．