水稻几丁质酶基因的克隆及序列分析

采用ＰＣＲ技术从水稻基因组ＤＮＡ中扩增出２个编码几丁质酶基因片段ＲＣＨ１０和ＲＣＨ８,片段大小分别为１０２３ｂｐ和９７６ｂｐ。将ＰＣＲ产物直接做ＮＤＡ序列分析,证明扩增出的２个片段具有编码Ⅰ类几丁质酶的基本结构,即（１）Ｎ－端信号肽区;（２）ｈｅｖｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ结构区;（３）可变间隙区;（４）催化结构区。其中ＲＣＨ１０的核苷酸序列与文献报道相比同源性为９７％,氨基酸序列同源性为９３％;ＲＣＨ     

大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列抽薹相关基因表达差异的cDNA-AFLP分析

抽薹开花时间是大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)的重要性状,未熟抽薹直接影响大白菜的产量和品质.本研究以添加结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)4号染色体片段的大白菜-结球甘蓝易位系AT4系列为材料,结合抽薹性鉴定,获得了45株耐抽薹和15株易抽薹植株;利用cDNA-扩增片段长度多态性(cDNA-amplified fragment length polymorphism,cDNA-AFLP)技术,对不同春化处理的耐抽薹和易抽薹植株叶片差异表达片段进行分离,获得了126条与抽薹性相关的差异表达条带,这些差异包括条带的有无和表达量的差异;通过差异条带回收、克隆和测序,获得了74条差异表达序列.同源性比对结果表明,61条差异表达序列具有同源序列,其中41条差异表达序列功能预测涉及代谢、能量、细胞物质运输、信号转导、表达调控、DNA修饰、细胞周期等,20条差异表达序列功能未知;13条在NCBI中找不到同源序列,可能是一些新基因.本研究获得了耐抽薹大白菜-结球甘蓝易位系,为耐抽薹大白菜新品种的培育提供新材料;同时获得了耐抽薹和易抽薹材料间的差异表达序列,为获得影响大白菜抽薹性的关键基因,揭示大白菜抽薹开花机制提供支撑.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）BJ—4株全基因组序列测定与分析

在国内首次完成了猪繁殖与呼吸综合征病毒分离毒株的全基因组序列测定。用RT－PCR方法分段扩增出PRRSV北京地区分离株BJ－4株的21条cDNA片段，分别克隆于pGEM-T-easy质粒载体并进行测序，按顺序将这些序列进行拼接得到PRRSV BJ－4株全基因组cDNA序列。测序结果表明PRRSV BJ－4株基因组全长15504b，包含8个开放阅读框，5′端有190nt先导序列；3′端有256ntUTR，其中包括95ntPoly(A)尾。PRRSV BJ－4株与美洲型毒株VR－2332和Nebreska的核苷酸同源率分别为99．5％和98．4％，而与欧洲型代表株LV株的核苷酸同源率为62．5％，与另一国内分离株CH－1a株编码构蛋白基因的核苷酸同源率为93．3％。     

金柑LEAFY同源基因克隆与全序列分析

通过PCR扩增,从融安金柑基因组DNA中克隆出一条2 361 bp的DNA片段,该DNA克隆含有1个2 081 bp的LEAFY同源基因全长序列(FcLFY)。金柑LEAFY同源基因包含2个内含子和3个外显子,编码398个氨基酸。比对结果表明,金柑LEAFY同源基因与甜橙、枳的LEAFY同源基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均为98%。该研究为今后从分子水平上研究金柑开花调控机理打下了坚实的基础。     

大肠杆菌天冬氨酸激酶lysC基因的克隆及定点突变

以大肠杆菌Ｋ１２菌标总ＤＮＡ为模声,利用技术扩增了编码天冬氨酸激酶的ｌｙｓＣ基因,序列分析结果表明,目的含有１３５０个核苷酸（包括起始密码和终止密码）,与文献报道相比,核苷酸序列同源率为９９．６％,推测的氨基酸序列与报道的相比,同源率为９９．３％,利用定点突变方法,将核苷酸序列的第１０５５位的Ｃ变成Ｔ,从而引起第２３５２位的苏氨酸变为异亮氨酸,以改变天冬氨酸激酶对赖氨酸的馈抑制的敏感性。     

棉花纤维起始期基因表达的cDNA-AFLP分析

摘要：利用cDNA-AFLP差异显示技术比较了棉花(Gossypium hirsutum L.)品系徐州142及其无纤维突变体的胚珠在纤维起始期（开花后0和4 d）的基因表达，结果表明，在总共显示的561条带中两种胚珠各有特异带83条。将正常有纤维胚珠的差异片段47个进行反向 Northern blot检验，32个在有纤维胚珠中特异表达。选取18个在有纤维胚珠中特异表达的片段进行序列分析，结果表明，8个分别与polyphosphoinositide结合蛋白、细胞色素氧化酶亚基Ⅱ、β-葡萄糖苷酶、蔗糖合成酶、Ca2+通道蛋白、水稻高渗反应蛋白osr40、类TSO1蛋白序列有相似性；4个与拟南芥(Arabidopsis thiliana )的假拟蛋白相似；另有6个找不到相似序列。     

猪5-HT4b受体基因cDNA克隆和序列分析

利用RT—PCR技术克隆了猪5-HT4bR基因的核苷酸序列，并利用生物信息学手段进行了验证。核苷酸序列测定与分析表明，该基因片段全长1209bp且包含一个完整的开放阅读框，编码402个氨基酸。该序列已在GenBank登录（Accession No．AY566638）。序列分析结果表明，该基因与已报道的人、鼠等5种动物5-HT4bR基因具有较高的核酸序列和氨基酸序列同源性，分别为92．56％和93．63％。该基因编码的蛋白具有7次跨膜结构，属于G蛋白偶联受体超家族。     

家蚕肾脏形卵(ki)的荧光差异显示研究

为了探明家蚕（Bombyx mori)肾脏形卵的胚子不能正常发育的原因。使用FDD（flourescent different display)法对ki(kidney)基因同质型与异质型的母蛾所产未受精卵及受精24h卵的mRNA进行了差异显示研究。通过137组引物组合进行FDD差异显示，结果检出8254条扩增带。其中未受精卵与受精后24h卵之间的差异片段为206条，占总片段数的2．5％，而ki同质型与ki异质型的差异片段为141条，占总片段数的1．7％，其余的95．8％的扩增片段为4方共有，并且约60％的差异带是比较清晰的。回收了较明显的差异片段计199条，占总扩增带数的2．4％，并对其中部分差异片段进行序列分析表明，其中5个克隆序列分析为：small heat shock proteins,proprotein convertase,cancer antigen like protein fusion RNA-binding protein及receptor like protein kinase同源序列，其余5个克隆序列未发现同源性，可能是新基因。     

结球白菜结球前期基因表达序列标签（EST）分析

以结球白菜(Brassica rapa L.ssp．pekinensis)结球前期心叶为材料，构建了结球前期球叶cDNA文库，随机挑选克隆单向单次测序后，共得到1162条峰图良好和插入片段长度大于150bp的可用序列。BLASTX及BLASTN序列比对分析表明，94．8％(1102／1162)的表达序列标签(EST)可在蛋白质或核苷酸水平上找到同源类似物。同源性最大的蛋白质按物种来源分析后发现，大约77％的功能已知蛋白质来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)，另外还有60个EST与已发表的植物基因没有同源性，这一部分EST对于研究结球白菜独特的生理和形态发育途径以及开展基因组分子作图具有重要的意义。同源蛋白质按其功能进行分类表明，参与蛋白质合成过程的酶或蛋白质的EST数量最多，其次是参与能量代谢过程(包括光合作用)的EST序列。在核苷酸水平上，全部EST中只有51％的同源物来自拟南芥。对上述1162条EST进行片段重叠群分析(contig analysis)共获得895个非冗余片段重叠群，其中723个仅由一个EST组成(即singletons)，表明结球白菜结球过程中表达的基因种类繁多。大量EST的获得为进一步了解结球白菜结球机制及获取相关基因提供了重要的序列信息。     

PR—1a蛋白基因的克隆及序列分析

以珊西烟草（Nicotina tabacum cv. Xanthi-nc）的基因组DNA为模板，通过合成一对特异性引物，利用多聚酶链式反应（PCR）扩增获得PR－1a蛋白基因。将其克隆到E.coli质粒上进行序列分析。结果表明：该基因由504个碱基组成，编码168个氨基酸。与已发表序列相比较，核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为99.9%和100％。     

菜心BrAGL24基因mRNA在嫁接体中的长距离运输分析

为研究结球甘蓝/菜心嫁接体中开花调控基因的mRNA是否从砧木向接穗进行了运输,本试验以参与开花调控的菜心AGL24基因为研究对象,构建结球甘蓝菜心异源嫁接体,并从接穗结球甘蓝中鉴定菜心AGL24的序列。结果表明,利用结球甘蓝和菜心的转录组测序数据,拼接获得了结球甘蓝和菜心的AGL24基因序列(BoAGL24和BrAGL24)。利用菜心BrAGL24基因中的种间差异序列(C1~C7),在异源嫁接(结球甘蓝/菜心嫁接)的接穗结球甘蓝茎尖的转录组测序文库(T2)中筛选得到2条来自砧木菜心BrAGL24的reads。利用结球甘蓝BoAGL24的种间差异序列(G1~G7),分析结球甘蓝内源BoAGL24基因的转录表达量,发现异源嫁接的结球甘蓝茎尖中AGL24的表达量总体上高于同源嫁接的结球甘蓝茎尖中AGL24的表达量。异源嫁接使砧木菜心BrAGL24基因的mRNA运输到接穗结球甘蓝中,且增加了接穗结球甘蓝茎尖中内源BoAGL24基因的转录表达水平。本研究鉴定了菜心BrAGL24基因的mRNA运输特性,为进一步研究AGL24基因的mRNA运输与结球甘蓝/菜心嫁接启动接穗结球甘蓝开花机制奠定了一定的理论基础。     

光周期途径植物开花决定关键基因FT

随着分子生物学的快速发展,大量与光周期途径开花相关的基因已经被发现和克隆,FT（FLOWERING LOCUST）是光周期途径植物开花时间决定关键基因,并认为刀基因表达产物可能就是人们长期追寻的开花刺激物质,这种开花刺激物质经过叶片到茎尖的长距离运输,最终引起茎顶端开花起始。目前已在多种植物中分离出刀同源基因,并通过转基因证明刀基因的表达可促进植物提早开花。本文对国内外关于刀基因家族的研究进展进行综述,旨在为进一步深入研究刀基因功能提供参考。     

氮素在果树成花过程中的作用

综述了氮素在果树成花过程中的作用,认为氮及含氮化合物是果树成花过程中重要的物质,其影响到果树从营养生长向生殖生长的转化,影响花粉的可育性和雌雄花的比例,影响花的质量。花芽的生理分化及形态分化期间都伴随氮素及含氮物质的波动,不同形态的含氮物质在成花过程中的作用也不同。花芽诱导措施都强烈地影响果树体内氮素及含氮化合物的水平。     

玉米耐旱自交系在干旱条件下的mRNA差异表达

用16%PEG-6000对玉米耐旱自交系“81565”进行模拟干旱处理,用DD-PCR技术研究干旱与正常浇水对照的mRNA差异表达,发现3个干旱条件下差异表达的特异片段MD1、MD2和MD3。MD1和MD2在干旱条件下减量表达,MD3为干旱诱导表达。序列分析和同源性比对表明,MD1与玉米叶绿体基因组中编码参与RNA转录本Ⅱ型内含子剪切的成熟酶的matK基因有93%的相似性,MD2与极端耐旱的Sporobolus stapfianus的丝氨酸/苏氨酸2C型蛋白磷酸酶基因PP2C的相似性达99%,MD3与属天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶类的水稻metacaspase基因有99%的相似性。根据各自序列相似同源基因的功能推测,MD1、MD2和MD3三个片段可能与“81565”的耐旱机制有关。     

高羊茅FaGI基因在拟南芥中异源表达及蛋白互作分析

为探究高羊茅FaGI基因的生物学功能,本研究利用酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀探究与FaGI互作的蛋白;通过农杆菌介导法将过表达载体p1300-FaGI遗传转化拟南芥,获得转FaGI基因拟南芥株系,以拟南芥野生型Col-0、过表达FaGI基因株系和gi突变体为材料进行转录组学测序并观察其开花表型。结果表明,利用酵母双杂交方法筛选出与FaGI互作的FaCO蛋白,并通过双分子荧光互补和免疫共沉淀证明了FaGI和FaCO在体内和体外存在互作关系;过表达FaGI基因拟南芥植株的开花时间比野生型Col-0提前约1.24 d;将FaGI-OE、gi与野生型比对,分别筛选出1 963和92个差异表达基因（DEGs）,与野生型植株相比,过表达FaGI基因株系的差异基因富集在与生长发育、光周期途径、激素合成和信号传导、碳代谢等相关生物过程和代谢通路。综上,FaGI影响光周期途径相关基因的表达,在长日照条件下过表达FaGI基因促进了拟南芥开花,同时该基因的功能具有多样性与复杂性,可作为高羊茅调控分子育种的目标基因。本研究结果为揭示FaGI基因的功能及其调控网络奠定了基础。     

LRR-RLKs亚家族基因RLK6在拟南芥开花过程中的作用

为研究LRR-RLKs亚家族基因RLK6(AT2G26730)在拟南芥生长发育过程中的作用,本研究构建了植物过表达载体p Super1300-RLK6,获得5个过表达突变体,其中2个独立株系(OE8,OE9)用于表型分析。通过对野生型(WT)、RLK6基因缺失突变体(rlk6-2、rlk6-3和rlk6-6)、过表达株系OE8和OE9生长发育过程的详细观察和分析发现,RLK6基因缺失突变体在整个生长发育过程中的表型与WT差异不明显,而过表达株系OE8和OE9比WT开花早。此外,利用实时定量PCR(qRT-PCR)检测各基因型植株中开花相关基因的表达情况,结果表明,相对于WT,OE8和OE9中的开花促进基因CO、SOC1和LFY的表达量显著升高,而开花抑制基因FLC的表达量显著下降。研究结果说明RLK6过表达促进了拟南芥的开花,这为后续深入研究RLK6的作用机制奠定了基础。     

太空诱变玉米核雄性不育材料的cDNA-AFLP分析

利用cDNA-AFLP技术对太空诱变玉米核雄性不育材料的花药进行差异表达分析,并对差异片段进行回收、克隆和测序,结合半定量RT-PCR方法,分析差异片段在可育株和不育株的表达情况。利用16对引物共回收得到9个差异序列,其中2个为来自不育株的特有片段,7个为来自可育株的特有片段。序列分析发现,来自不育株的 2个EST序列未检测到同源性较高的序列。来自可育株的4个EST序列分别与水稻上推断的查尔酮合成酶、脂酰CoA脱氢酶、蛋白激酶PK12、甘氨酸脱羧酶具有较高的同源性。这些物质可能参与小孢子发育过程中的物质代谢、能量代谢及信号传导等。半定量RT-PCR分析表明,与查尔酮合成酶同源性较高的Z3片断在可育花药发育的早期有较高的表达。而与甘氨酸脱羧酶同源性较高的片断Z8在可育花药发育的中间阶段呈增量表达。这可能与花药发育过程有较高的能量和物质需求有关。     

杨树葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）基因启动子的克隆与分析

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是磷酸戊糖途径的关键性调控限速酶,其主要功能是为脂肪酸合成、氮还原和谷胱甘肽等生物分子合成提供还原力NADPH,也为核酸合成提供戊糖;此外,还参加非生物逆境胁迫应答反应。因此,G6PDH对植物的生长发育起着非常重要的作用。本文利用甜杨G6PDH基因和毛果杨基因组序列,通过PCR获得了甜杨G6PDH基因上游1400bp的序列。序列分析结果表明,该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box。此外,还包含多个胁迫诱导元件,如低温诱导元件LTR,盐诱导元件GT-1,抗冻、缺水、脱落酸、抗寒元件MYB和MYC,以及光响应元件L-box、G-box、3AF-1、TC丰富区等。