沙2×伦109桑叶片培养及农杆菌侵染培养的技术研究

探讨了广东桑（沙×伦109）叶片培养及农杆菌转染桑叶盘技术,尝试为抗菌肽基因转桑树抗青枯病育种建立技术体系。培养基筛选试验结果表明,GugD（MS,6—BA25mg／L,IAA0．2mg／L）和RegDⅡ（MS,6-BA1.0mg／L,IAA0.5mg／L）适合广东桑叶片预培养生长和叶盘转化后不定芽的诱导。广东桑叶片预培养不定芽分化率低（10％左右）,但创伤感染农杆菌后,不定芽分化率提高到30％～70％：诱导的不定芽可顺利展开,形成小苗,但生根尚有困难;广东桑对卡那霉素（Km）和头孢霉素（Cef）的临界敏感,供试品种间不存在差异。     

影响桑子叶不定芽形成的因素

用正交设计法对影响桑子叶不定芽形成的诸因素进行了比较研究。结果得出：（１）诱导培养基采用ＭＳ无机盐加即维生素、６－苄氨基嘌呤３．０ｍｇ／Ｌ、吲跺乙酸０．３ｍｇ／Ｌ、果糖或葡萄糖３０ｇ／Ｌ、水解乳蛋白５００ｍｇ／Ｌ和琼脂粉６ｇ／Ｌ最为适合，不定芽诱导率达到８０％以上；（２）子叶初期培养中，光照以５００～１０００ｌｘ较为适宜；（３）预培养４～６ｄ的桑种子，其子叶不定芽诱导率较其余子叶为高。不定芽经继代培养后能在生根培养基中形成完整根系，移植到土壤后可成苗。     

苜蓿高效再生体系的建立

以黑龙江主栽苜蓿品种肇东苜蓿、敖汉苜蓿、公农1号苜蓿、公农2号苜蓿为受体材料，分别研究了外植体类型对不定芽分化的影响，基因型、PGRs的不同配比对子叶节不定芽分化的影响，并确定了芽分化、芽伸长及再生植株生根时的最佳培养基。结果表明，当BA浓度为1．0mg／L时最适于子叶节的分化；当BA浓度为0．5mg／L时植株生长最佳。芽分化培养基为：MS＋1．0mg／LBA，30g／L蔗糖，0．8％琼脂，pH5．8；芽伸长培养基为：MS＋0．5mg／LBA，30g／L蔗糖，0．8％琼脂，pH5．8；再生植株生根培养基为：MS＋1.5mg／LIBA，15g／L蔗糖，0．8%琼脂，pH5．8。     

抗生素对桑树外植体生长与分化的影响

试验比较了不同种类抗生素在不同浓度下对桑子叶、不定芽和新梢生长与分化的影响，结果显示：（１）培养基中卡那霉素浓度高于２０ｍｇ／Ｌ时．桑子叶不能形成不定芽；羧苄青霉素或头孢霉累大于４００ｍｇ／Ｌ时，子叶不定芽诱导率明显下降。（２）卡那霉素大于３０ｍｇ／Ｌ，羧苄青霉素或头孢霉累大于４００ｍｇ／Ｌ，不定芽抽茎受到明显抑制。（３）卡那霉素大于１０ｍｇ／Ｌ，羧苄青霉素或头孢霉素大于１００ｍｇ／Ｌ，桑树新梢难以形成根系。     

关于利用不定芽大量繁殖桑苗的研究

本研究应用组织培养技术,以开发桑苗的大量繁殖方法为目的。探讨了从未熟叶诱导不定芽,再行继代培养,从不定芽育成伸长的新幼芽,然后用新幼芽生产稚苗的方法。摘取冬芽内未熟叶接种于含BA(10mg/L)的MS培养基上培养,然后将形成众多不定芽的叶片,移植到添加各种浓度BA的MS培养上,进行继代培养后,从不定芽伸长新幼芽的个数最多者为添加BA 1mg/L区培养基。在不同桑品种中,“疾风盛”诱导的新幼芽最多,其次是盛南,再其次是剑持。并且“疾风盛”中不定芽形成叶片在继代培养中,还形成了不定芽块,一个不定芽块经7个月培养,共计可以获得700个以上新幼芽。这些新幼芽经发根、驯化处理,移植到苗床后,移植个体成活率可达90％以上。于此本研究结果启发我们采用来自未熟叶的不定芽块,应用组织培养技术大量繁殖桑苗将是可能的。     

广东桑叶盘和种子萌发苗茎段的转基因技术研究

广东桑(Morus atropurpurea Roxb)不定芽诱根比较困难,为进行杀菌肽D基因转广东桑培育抗青枯病品系的研究,我们探讨了广东桑杂交种塘10×伦109腋芽的叶盘和种子萌发后茎段的转基因技术。结果表明:(1)作为转基因材料,叶盘优于茎段。(2)适合于叶盘不定芽生长分化的培养基为MS加入6—BA 1.0—2.5mg/L,IAA 0.2—0.5mg/L,不定芽发生率平均为80％。(3)卡那霉素(Km)用于筛选经农杆菌创伤感染对盘后的转基因不定芽,筛选浓度梯度确定为:Km 12.5μg/mL(不定芽高<0.5cm);Km 25.0μg/mL(不定芽高:0.5—1.0cm);Km 50.0μg/mL(不定芽高>1.5cm)。(4)适合于不定芽(>1.5cm)诱根的培养基为1/2MS,IBA 0.5μg/L,其诱根率达到90％以上。     

植物生长调节剂配比对草莓叶片不定芽分化的影响

据《北方园艺》2014年第8期《激素配比对草莓叶片不定芽分化的影响》（作者王婷婷等）报道,以“晶瑶”草莓叶片为试材,研究了不同植物生长调节剂配比、AgNO3浓度和暗培养对草莓叶片不定芽分化的影响。以期为草莓的遗传转化提供理论依据和实践经验。结果表明,当培养基为MS＋噻二唑苯基脲（TDZ）1．0mg／L＋g吲哚丁酸（I-BA）0．4mg／L＋AgN032．0mg／L时,不定芽再生率高达70．3％,每个外植体平均再生芽数为4.2个;AgNO,可以有效抑制晶瑶草莓叶片玻璃化和褐变：暗培养处理促进晶瑶草莓叶片的不定芽诱导,最佳暗培养时间为14天。     

天蓝苜蓿组织培养及再生体系的研究

以野生天蓝苜蓿种子发育5～7d无菌苗的子叶、下胚轴和种子苗叶片为外植体，对其愈伤组织诱导及其分化的基本培齐与外源激素组合和浓度配比进行试验。结果表明：对子叶、下胚轴和叶片愈伤组织诱导最适宜的基础培养基分别是MS、B5和SH；激素的种类及其浓度配比对于愈伤组织的诱导因不同的外植体有很大的差异。其中，子叶、下胚轴以MS＋NAA（0．5～1．0mg／L）＋6-BA（0．7mg／L）效果较好，叶片以SH＋NAA（0.5—1．0mg／L）＋2，4-D（1.5～5mg／L）十6胡A（0．7mg／L）较好，少量下胚轴在MS＋NAA（0．5mg／L）＋6-BA（0．7mg／L）和MS＋NAA（0．5mg／L）＋KT（0．5mg／L）的培养基中直接分化出胚状体，并成功发育成植株。在培养基Whb5上，子叶、下胚轴和叶片的分化都得到了很好的效果，分化率分别为43％、57％、40％，15～30d后都能再生植株。     

蒺藜苜蓿子叶节高频再生系统的建立

通过直接的芽器官发生途径,建立了蒺藜苜蓿Medicago truncatula子叶节外植体的高频植株再生体系.选用在高达5 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)的种子萌发培养基上生长3 d的蒺藜苜蓿幼苗,制备获得由1片子叶和半个胚轴组成的子叶节外植体.以SH培养基为基本培养基,对不同浓度α-萘乙酸(NAA)和6-BA组合诱导不定芽形成条件进行优化的结果表明,不定芽诱导培养基中仅用浓度为4 mg/L 6-BA的平均不定芽数达到3.56,显著优于与其它生长调节物质组合的处理.     

乌拉尔甘草离体再生与遗传转化技术的研究

研究乌拉尔甘草离体再生受体系统和遗传转化技术方法,为甘草基因工程育种提供前期实验基础。以乌拉尔甘草茎段为外植体,试验筛选最适不定芽分化培养基和增殖壮苗培养基; 以乌拉尔甘草茎段为受体,利用农杆菌介导法对乌拉尔甘草进行GUS和GFP基因的遗传转化研究。结果表明,以乌拉尔甘草去腋芽茎段为外植体,其不定芽最适分化和增殖培养基配方为MS+0.1 mg/L TDZ+0.1 mg/L 6BA+0.1 mg/L IBA,不定芽分化率达38.8%,增殖倍数3.67,适宜的壮苗培养基为MS+0.5 mg/L NAA。与去腋芽茎段相比,带腋芽茎段的不定芽分化率达100%,能够在含抗生素的选择培养基MS+0.1 mg/L TDZ+0.1 mg/L 6BA+0.1 mg/L IBA+50 mg/L Kan+250 mg/L Car上存活,确定为最适转化受体;带腋芽茎段在分化培养基上预培养7 d后,经OD₆₀₀=0.6的菌液侵染10 min,共培养3 d,在选择培养基上培养20 d,其不定芽分化率为43.75%,经GFP荧光检测可得到78.88%的GFP基因瞬时表达率;随机选取5株再生转化植株,经PCR检测,均有GFP和GUS基因的目的条带,GFP基因表达较强烈,初步获得了5个株系的阳性转化植株。     

乌拉尔甘草组培再生体系的研究

甘草是兼具生态和经济双重价值的重要植物资源,人工培育以野生变家种为主,尚未开展系统的育种工作。本研究以内蒙古杭锦旗的野生乌拉尔甘草为材料,研究了外植体、基本培养基、NAA、TDZ和蔗糖对丛生芽诱导的影响以及微繁体系的建立。结果表明,适合甘草丛生芽诱导的外植体为生长4~7 d的无菌苗子叶节,培养基为MS TDZ 0.1 mg/L NAA 0.1 mg/L 蔗糖20~30 g/L;将带1叶的茎段在改良MS NAA 0.1 mg/L 6-BA1.0~2.0 mg/L的培养基中培养,其增殖倍数可稳定达到25倍;在1/2MS 核黄素2.0 mg/L中生根,炼苗3 d移栽到蛭石中,成活率达96%以上。1个带腋芽茎段培养3个月可获得13 906棵生根试管苗,成活13 350株,繁殖效率高达85%。     

扁穗牛鞭草组织培养体系建立

以扁穗牛鞭草茎段为外植体，进行组织培养体系研究，结果表明：初代培养最佳配方为MS＋6-BA1．0mg／L＋NAA0．1mg／L，芽诱导率可达100％；继代增殖最佳增殖配方为MS＋6-BA1．5mg／L＋NAA0．2mg／L，增殖系数为5．4；生根阶段以1／2MS＋IBA0．2mg／L为最佳的生根培养基配方，生根效果最好，生根率最高；初代培养生根苗与增殖后生根培养苗移栽成活率都在97％以上。     

早开堇菜组织培养及植株再生体系的建立

以野生早开堇菜为材料,研究了不同外植体类型(子叶节、叶片、叶柄)和不同激素配比对其不定芽诱导、愈伤组织诱导和分化的影响,成功建立了早开堇菜组织培养植株再生体系。结果表明,1) 诱导子叶节和叶柄不定芽诱导的最适培养基为 MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA,叶片不适合作为直接诱导不定芽的外植体。2) 3种外植体均能诱导愈伤组织,子叶节愈伤组织诱导的时间最短,其次为叶柄,叶片最晚。子叶节和叶柄愈伤组织诱导的最适培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D,诱导率分别为98.3%和96.7%;叶片愈伤组织诱导的最适培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D+0.05 mg/L NAA,诱导率可达88.3%。3) 最适愈伤组织分化培养基为:MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA,分化率为100%。4)不定芽增殖的最佳培养基为:MS+1.5 mg/L 6-BA+0.075 mg/L NAA,增殖率为4.68。 5)再生苗移植到添加1.0 mg/L 6-BA的1/2 MS培养基上,生根率92.3%。6)组培苗移栽到珍珠岩∶河沙∶腐殖质(1∶2∶2)的混合基质时,100%成活,且植株长势好。     

白三叶×高加索三叶草F1代茎段离体培养器官发生的研究

以白三叶Trifoliumrepens×高加索三叶草T.ambiguum未成熟胚离体培养产生的F1代无菌苗的茎段为外植体,进行不定芽途径的直接器官发生培养。筛选适宜的诱导、分化及生根培养基,研究不同质量浓度激素组合对体细胞器官发生的影响,为建立扩繁体系及之后的回交试验奠定基础。结果表明:MS+2,4-D 0.1 mg/L、6-BA2 mg/L为适宜的诱导培养基,MS+NAA0.5 mg/L、6-BA1 mg/L、KT 1 mg/L为适宜的分化培养基,不添加任何激素的1/2 MS培养基为适宜的生根培养基。     

紫花苜蓿离体培养植株再生及其RAPD分析

对苜蓿(品种农宝)的下胚轴外植体进行离体培养建立了再生体系。结果表明,子叶和下胚轴切段在附加0.2~1.0 mg/L IAA和2.0 mg/L 6-BA或2.0 mg/L KT的MS培养基上培养,均能诱导出愈伤组织,但子叶所诱导的愈伤组织不具有分化能力。下胚轴切段培养5~7 d即可诱导出愈伤组织,并分化出绿色芽点,在原培养基上进而可分化出大量的丛生芽。在含0.2 mg/L IAA和2.0 mg/L 6-BA的MS培养基上,其分化率最高可达到42.6%。这些芽在含0.2 mg/L IAA和0.5 mg/L KT的MS培养基上长成2 cm左右的幼苗时,将其切下转至1/2 MS0培养基上,培养10 d即可诱导生根,得到再生植株。随机选取实生苗和下胚轴愈伤组织再生苗进行RAPD分析,结果表明,所用的50个随机引物中有5个扩增出差异性条带,甚至再生植株之间也有1条引物扩增的条带有差异,这说明经组织培养所得到的再生植株与实生苗相比,在DNA水平上发生了一定程度变异,并且这种变异也存在于再生植株之间。     

马蹄金子叶的愈伤诱导与植株再生研究

以不同植物生长调节剂组合和不同基本培养基,探讨了马蹄金子叶离体培养的方法和影响因素。结果表明,不同植物生长调节剂组合的培养基对愈伤组织的诱导频率有显著影响,出愈率为16%～100%;以MS或B5培养基作诱导愈伤组织的基本培养基效果较好;将子叶接种到MS+1.0mg/L2,4-D+0.2mg/L6-BA的诱导培养基中诱导愈伤组织,再用MS+0.1mg/L2,4-D+2.0mg/L6-BA+3.0mg/LAgNO3作分化培养基出苗效果最佳,愈伤组织分化频率高达20.7%。     

利用桑树特异种质资源的冬芽组织培养再生植株的试验

以不同类型的桑树特异种质资源的冬芽为材料,分别在含有不同种类生长调节剂及添加量的培养基中培养诱导桑树再生植株,考察桑树特异种质资源利用冬芽培养再生植株的可行性,筛选适宜的生长调节剂及其用量。结果表明:供试桑树种质资源的冬芽在不添加生长调节剂的培养基中外植体停止生长,添加生长激素TDZ能较好地诱导和促进愈伤组织的形成与生长,但会抑制生长芽的再生长,而添加细胞分裂素6-BA能促进冬芽的再生,且添加3.0 mg/L 6-BA的培养基中冬芽再生率显著高于添加1.0 mg/L 6-BA的培养基;8份桑树种质资源的冬芽在含3.0 mg/L 6-BA的改良培养基中培养,新疆药桑和小花叶皮桑的丛生芽诱导率最高,其冬芽的再生率均为66.7%,滇桑次之,再生率为55.5%,天目山桑和斯里兰卡的再生率分别为40.0%和25.0%;5份桑树种质资源的冬芽再生组培苗转移至生根培养基中培养1个月后,只有滇桑和新疆药桑分别诱导出再生根系(诱导率为分别为20.0%、14.3%)后移栽成活。研究结果初步显示,离体组织再生培养是保存和利用天然22倍体新疆药桑、渐危种滇桑等珍稀桑树种质资源的有效途径之一。