意大利蜜蜂4、5和6日龄幼虫肠道发育过程中差异表达基因的趋势分析

为探讨意大利蜜蜂(简称意蜂)幼虫肠道发育过程中的基因表达谱和基因差异表达信息,研究基于前期已获得的高质量的意蜂幼虫肠道转录组数据,利用STEM软件对意蜂4、5和6日龄幼虫肠道的差异表达基因(DEGs)进行趋势分析,进一步通过相关生物学软件对显著上调趋势包含的DEGs进行GO与KEGG代谢通路富集分析及表达量聚类分析。趋势分析结果显示,5 920个DEGs共聚类在8个基因表达模式,其中935个DEGs聚类在1个显著上调趋势。GO富集分析结果显示,显著上调趋势包含DEGs富集于39个GO条目,富集基因数最多的为结合,其次是细胞进程和单组织进程。KEGG代谢通路富集分析结果显示,显著上调趋势包含DEGs富集于94个代谢通路,富集基因数最多的是嘌呤代谢、内质网蛋白质加工和内吞作用。表达量聚类分析结果显示,随着意蜂幼虫肠道发育时间的延长,代谢和免疫相关通路富集基因的表达水平逐渐增强。研究提供了意蜂幼虫肠道发育过程的基因表达谱和基因差异表达信息,揭示了基因表达规律,为深入研究意蜂幼虫肠道发育的分子机制打下了一定基础。     

意大利蜜蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的 差异表达microRNA及其调控网络

【目的】 微小RNA（microRNA,miRNA）是一类重要的基因表达调控因子,可影响宿主与病原间的互作过程。蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）是一种特异性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。本研究旨在对意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）幼虫肠道在球囊菌胁迫前期的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA）及其靶基因进行深入分析,在miRNA组学水平探究意蜂幼虫在球囊菌侵染前期的胁迫应答,并通过构建显著DEmiRNA的调控网络筛选出与宿主应答相关的关键miRNA。【方法】 利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对正常及球囊菌侵染的意蜂4日龄幼虫肠道（AmCK和AmT）进行高通量测序,首先对原始数据进行质控和评估,随后将过滤后的数据与西方蜜蜂（Apis mellifera）参考基因组进行比对;将比对上的序列标签（tags）注释到miRBase数据库,得出已知miRNA的表达量;通过TPM（tags per million）算法对各样本中miRNA的表达量进行归一化处理,以|log₂ fold change|≥1且P≤0.05作为标准筛选得到显著DEmiRNA;利用TargetFinder 软件预测显著DEmiRNA的靶基因,并对其进行GO和KEGG代谢通路（pathway）富集分析。利用Cytoscape软件对miRNA-mRNA调控网络进行可视化。最后,利用茎环反转录PCR（Stem-loop RT-PCR）和荧光定量PCR（qPCR）验证测序数据的可靠性。【结果】 AmCK和AmT样品的测序分别得到13 553 302和10 777 534条原始读段（raw reads）,经严格过滤后得到的有效读段（clean reads）数分别为13 186 921和10 480 913条。各样品的生物学重复间的Pearson相关性系数分别在0.9822和0.9508以上。共有10个显著DEmiRNA,包括4个上调miRNA和6个下调miRNA。显著DEmiRNA在AmT的整体表达水平低于AmCK。10个显著DEmiRNA可靶向结合3 788个靶基因,其中上调miRNA的1 240个靶基因可注释到GO数据库中的39个GO条目,主要富集在结合、细胞进程、代谢进程和应激反应等;下调miRNA的749个靶基因可注释到34个GO条目,主要富集在细胞进程、结合、代谢进程和应激反应等。KEGG数据库注释结果显示,上调miRNA和下调miRNA的靶基因分别注释到95和66条代谢通路,富集基因数最多的分别是Wnt信号通路、Hippo信号通路、光传导以及内吞作用、磷脂酰肌醇信号系统、嘌呤代谢。对于上调和下调miRNA,分别有31和52个靶基因注释到内吞作用,15和7个靶基因注释到泛素介导的蛋白水解,11和5个靶基因注释到Jak-STAT信号通路,1和3个靶基因注释到MAPK信号通路。显著DEmiRNA与靶mRNA之间形成复杂的调控网络,7个显著DEmiRNA靶向结合96个与Wnt信号通路相关的mRNA,8个显著DEmiRNA靶向结合55个与内吞作用相关的mRNA。Stem-loop RT-PCR和qPCR结果验证了测序数据的可靠性。【结论】 对意蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的DEmiRNA及其靶基因进行预测和分析,并构建和分析了DEmiRNA-mRNA调控网络,研究结果提供了宿主miRNA的表达谱和差异表达信息,揭示了DEmiRNA通过调控细胞生命活动、新陈代谢以及部分细胞和体液免疫等生物学过程参与宿主的胁迫应答。miR-4331-y、miR-4968-y、miR-8440-y、novel-m0023-5p和novel-m0025-3p共同参与了宿主的Wnt信号通路和内吞作用的调控,可作为白垩病治疗的潜在分子靶标。     

西方蜜蜂工蜂不同虫态发育的转录组学分析

【目的】基于转录组学对西方蜜蜂工蜂不同虫态间的差异表达基因（DEGs）进行筛选和功能注释分析,揭示与工蜂生长发育相关的信号通路,为深入解析工蜂生长发育的分子调控机理提供基础数据。【方法】以西方蜜蜂工蜂的3日龄幼虫、1日龄蛹和1日龄羽化工蜂3个虫态为研究对象,利用llumina NovaSeq 6000平台进行转录组测序,采用DESeq2筛选不同虫态样品间的表达差异基因,然后分别进行GO功能注释分析及KEGG信号通路富集分析,并通过实时荧光定量PCR进行验证。【结果】经转录组测序,在西方蜜蜂工蜂3日龄幼虫与1日龄蛹间筛选出4823个差异表达基因（51.86%上调,48.14%下调）,在1日龄蛹与1日龄羽化工蜂间筛选出3295个差异表达基因（57.51%上调,42.49%下调）,在3日龄幼虫与1日龄羽化工蜂间筛选出5267个差异表达基因（52.95%上调,47.05%下调）。GO功能注释分析结果显示,3日龄幼虫与1日龄蛹间的差异表达基因注释到43个GO功能条目,1日龄蛹与1日龄羽化工蜂间的差异表达基因注释到45个GO功能条目,3日龄幼虫与1日龄羽化工蜂间的差异表达基因注释到44个GO功能条目,主要涉及细胞过程、细胞部分及结合等。KEGG信号通路富集分析发现,3日龄幼虫与1日龄蛹间有2905个差异表达基因富集到332条KEGG信号通路上,其中17条KEGG信号通路呈显著富集,涉及核糖体、氧化磷酸化和昆虫激素生物合成等;1日龄蛹与1日龄羽化工蜂间有1644个差异表达基因富集到331条KEGG信号通路上,其中45条KEGG信号通路呈显著富集,涉及氧化磷酸化、生热作用和胰岛素分泌等;3日龄幼虫与1日龄羽化工蜂间有2958个差异表达基因富集到337条KEGG信号通路上,其中14条KEGG信号通路呈显著富集,涉及核糖体、蛋白酶体和胰岛素分泌等。6个随机挑选差异表达基因的实时荧光定量PCR检测结果与转录组测序结果相符,即转录组测序结果可靠。【结论】昆虫激素生物合成通路相关差异表达基因调控与西方蜜蜂工蜂各虫态JH滴度变化规律一致,氧化磷酸化信号通路则与各虫态的营养摄入和活动行为相关,而胰岛素分泌通路涉及各虫态的营养调控、脂肪体合成及细胞凋亡。可见,昆虫激素生物合成、胰岛素分泌和氧化磷酸化3种信号通路在西方蜜蜂工蜂幼虫、蛹和成虫的发育调控中发挥着重要作用。     

意大利蜜蜂工蜂中肠发育过程中的差异表达环状RNA及其调控网络分析

【目的】环状RNA(circular RNA,circRNA)在可变剪接、转录调控和来源基因的表达调控等方面具有重要功能。本研究旨在探究意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂中肠发育过程中circRNA的表达谱及其发育过程中的差异表达circRNA(differentially expressed circRNA,DEcircRNA),进而在转录组水平探究DEcircRNA在中肠发育中的作用。【方法】基于前期获得的意蜂7和10日龄工蜂中肠样品(Am7和Am10)的全转录组数据,利用find_circ软件从质控后的数据中预测circRNA。采用RPM算法归一化处理得到circ RNA的表达量。利用DEGseq软件对circ RNA进行差异分析,按照差异倍数(fold change)≥2、P0.05及错误发现率(false discovery rate,FDR)0.05条件筛选DEcircRNA。通过BLAST比对GO和KEGG数据库,对DEcircRNA的来源基因进行功能和代谢通路注释。利用TargetFinder软件预测DEcircRNA-miRNA及DEcircRNA-miRNA-mRNA调控网络,通过Cytoscape v.3.2.1软件对调控网络进行可视化。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证测序数据的可靠性。【结果】意蜂中肠各样品比对上参考基因组的短序列读段数平均为19 616 356条。Am7与Am10的组内Pearson相关系数均≥0.950。共预测出256个DEcircRNA,包括105个上调circRNA和151个下调circRNA。Novel_circ_009675和novel_circ_013879分别在Am7和Am10中高量表达。DEcircRNA的来源基因可注释到包括结合、单组织进程及细胞进程在内的32个GO条目,其中分别有35、35和7个来源基因注释到催化活性、代谢进程和应激反应。上述来源基因还可注释到35条KEGG代谢通路,其中分别有5、5和4个来源基因注释到Hippo信号通路、内吞作用和吞噬体;进一步分析发现分别有1、2和2个来源基因注释到磷酸肌醇代谢、淀粉和蔗糖代谢和半乳糖代谢等物质代谢通路,5、4、3、1和1个来源基因注释到内吞作用、吞噬体、溶酶体、泛素介导的蛋白水解和MAPK信号通路等免疫通路。上述结果表明相应的DEcircRNA广泛参与意蜂工蜂中肠的生长发育、新陈代谢和免疫防御。DEcircRNA-miRNA调控网络分析结果显示,141个DEcirc RNA可靶向结合107个mi RNA,其中多数仅能结合1—2个mi RNA,但novel_circ_011577和novel_circ_010719结合的靶miRNA数可达32和28个;此外,mir-136-y、ame-miR-6001-3p及mir-136-y结合的circRNA数最多,分别为15、14和14个,表明相应的DEcircRNA可作为竞争性内源RNA在意蜂中肠发育过程发挥作用。进一步构建DEcircRNAs-ame-miR-6001-3p-mRNA调控网络,分析结果显示14个DEcircRNA可共同靶向结合ame-miR-6001-3p,表明它们可能通过调控ame-miR-6001-3p对意蜂中肠干细胞的分裂和分化进行间接调控。随机选取6个DEcircRNA进行RT-qPCR验证,结果显示5个DEcircRNA的表达量变化趋势与测序结果一致,证实了本研究测序结果的可靠性。【结论】通过对意蜂工蜂中肠发育过程中的DEcircRNA深入分析,提供了circRNA在意蜂工蜂中肠发育过程中的表达谱和差异表达信息,揭示了DEcircRNA在中肠发育过程中的作用,为中肠发育相关的关键circRNA的筛选和功能研究打下了基础。     

基于比较转录组学分析揭示中华蜜蜂及意大利蜜蜂幼虫的球囊菌抗性差异机制

为探究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,以下简称中蜂)与意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,以下简称意蜂)幼虫的球囊菌(Ascospahaera apis)抗性差异产生的原因,利用Venn分析、GO分类分析、KEGG代谢通路分析以及Ka/Ks分析对二者的转录组进行比较研究。Venn分析结果显示,中蜂与意蜂的同源基因有17 656个,归属于8 111个基因家族,二者的特有基因分别有1 158和241个,分别归属于468和86个基因家族。GO分类结果显示,中蜂和意蜂的特有基因分别富集在38和28个GO条目。KEGG代谢通路富集分析结果显示,中蜂和意蜂的特有基因分别富集于96和21个代谢通路;进一步分析发现中蜂的特有基因富集在内吞作用、溶酶体、泛素介导的蛋白水解和黑化作用等4个细胞免疫通路,以及MAPK信号通路和Toll-like受体信号通路等2个体液免疫通路,而意蜂仅有1个特有基因富集在MAPK信号通路。Ka/Ks分析结果显示受到强烈正向选择、弱正向选择、中性选择和负向选择的单拷贝同源基因分别有37、281、2 630和3 269个。对受到强烈正向选择的基因进行GO分类和KEGG代谢通路富集分析,GO结果显示中蜂和意蜂的单拷贝同源基因富集的GO条目类型相同;KEGG结果显示中蜂的单拷贝基因仅富集在氧化磷酸化。上述结果表明免疫相关基因数量的差异是二者的球囊菌抗性差异产生的重要原因之一,中蜂在与球囊菌的协同进化过程中可能通过提高能量利用从而限制球囊菌的增殖。本研究结果可为阐明中蜂及意蜂幼虫的球囊菌抗性差异产生的分子机制提供参考。     

意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道内球囊菌的差异表达基因分析

为检测蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)在胁迫意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)幼虫后期的基因表达谱,利用RNA-seq技术对纯培养的球囊菌孢子及球囊菌胁迫的意蜂6日龄幼虫肠道进行深度测序。通过比较处理组和对照组得到21 361个差异表达基因(DEGs),包括15 306个上调基因和6 055个下调基因。GO富集分析结果显示,上调基因富集于39个GO条目(term),基因富集数最多的为细胞进程(2 416unigenes)、细胞(2 408 unigenes)和细胞组件(2 408 unigenes);下调基因富集于38个GO term,基因富集数最多的为代谢进程(1 227 unigenes)、细胞进程(1 185 unigenes)和细胞(1 131 unigenes)。KEGG代谢通路富集分析结果显示,上调基因富集在119个通路,其中基因富集数最多的是核糖体(221 unigenes),其次为内质网中蛋白加工(190 unigenes)和内吞作用(177 unigenes);下调基因富集在113个通路上,基因富集数最多的是核糖体(144 unigenes),其次为RNA转运(113 unigenes)和氨基酸生物合成(108 unigenes)。进一步分析发现,富集在MAPK信号通路上的64个基因上调表达,说明该通路在球囊菌胁迫后期被激活。研究结果不仅为揭示球囊菌在胁迫意蜂幼虫后期的病原-宿主互作提供了重要信息,也为阐明球囊菌致病的分子机制奠定了基础。     

意大利蜜蜂幼虫响应东方蜜蜂微孢子虫胁迫的高表达基因分析

为探究意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)幼虫响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)胁迫的高表达基因(HEG)的作用,利用RNA-seq技术对正常的意蜂4、5和6日龄幼虫(Am4CK、Am5CK和Am6CK)及N.ceranae胁迫的意蜂4、5和6日龄幼虫(Am4T、Am5T和Am6T)进行测序。共得到268 765 544条原始读段,经过滤得到的有效读段数为266 318 442条,各样品的Q30均在92.42%及以上。根据FPKM值≥15的标准从上述6个样品中分别筛选出2 460、2 692、2 908、2 367、2 549和2 270个HEG。Venn分析结果显示,去除与对照组共有的HEG,Am4T、Am5T和Am6T的共有HEG数为3个,特有HEG数分别为373、210和79个。GO分类结果显示,Am4T、Am5T和Am6T的特有HEG分别能够注释26、27和16个GO条目,注释基因数最多的分别是代谢进程、结合和结合。KEGG分析结果显示这些特有HEG可分别富集在145、138和68条代谢通路,富集基因数最多的分别是过氧化物酶体、碳代谢和内质网蛋白加工。进一步分析结果表明N.ceranae胁迫可导致宿主的部分物质代谢、能量代谢和免疫代谢通路水平提高。从6个样品的共有HEG中随机选取10个进行RT-PCR验证,均能成功扩增出目的条带,说明本研究中的HEG真实存在。研究结果揭示了意蜂幼虫响应N.ceranae胁迫的HEG表达谱及作用,为深入解析宿主的胁迫应答机制提供了重要信息。     

意大利蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫的可变剪接基因分析

为探讨可变剪接基因在宿主响应球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫过程中的作用,基于前期已获得的意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)幼虫肠道转录组数据进行可变剪接基因分析。在正常的意蜂4日龄幼虫肠道(AmCK),球囊菌胁迫的意蜂4、5和6日龄幼虫肠道(AmT1、AmT2、AmT3)中共鉴定出55 895个可变剪接事件,以外显子跨越和可变3′端剪接为主。各样品的共有可变剪接基因数为8 157个,AmT1、AmT2、AmT3的特有可变剪接基因数分别为207、334和542个。GO分类结果显示共有可变剪接基因分布在50个GO条目。KEGG代谢通路富集分析结果显示,共有可变剪接基因富集在290个pathway,基因富集数最多的是内质网蛋白加工、RNA运输和碳代谢。上述分析结果揭示了可变剪接基因在意蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫过程中的重要作用,为深入研究可变剪接基因的功能打下了基础。     

微小RNA及其介导的竞争性内源RNA调控网络在意大利蜜蜂工蜂中肠发育过程中的潜在作用

【目的】微小RNA(micro RNA,miRNA)能够通过靶向结合导致m RNA的抑制或降解,从而对基因表达进行负调控。Mi RNA在昆虫的生长、发育、免疫和细胞生命活动调控方面扮演关键角色。本研究旨在对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂中肠的差异表达miRNA(differentially expressed miRNA,DEmiRNA)及其调控网络进行深入分析,并结合前期在m RNA、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和环状RNA(circular RNA,circ RNA)组学层面的相关研究结果,系统解析中肠发育过程的miRNA差异表达谱及竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络介导的中肠发育机理。【方法】利用small RNA-seq技术对正常的意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠(Am7和Am10)进行测序。将质控后的测序数据比对西方蜜蜂基因组,再将比对上的序列标签(tags)比对到miRBase数据库以鉴定已知miRNA。利用每百万标签序列(tags per million,TPM)算法对miRNA表达量进行计算和归一化处理。根据|log2 fold change|≥1且P≤0.05的标准筛选得到显著性DEmiRNA;利用相关软件进行靶m RNA的预测及GO和KEGG数据库注释。根据靶向结合关系及前期研究结果,利用Cytoscape软件对AMPK、PI3K-Akt、Wnt、c AMP、Hippo、m TOR、Toll/Imd、TGF-beta和MAPK 9条信号通路相关的DElnc RNA/DEcirc RNA-DEmiRNA-DEm RNA网络进行可视化;构建以miR-342-y为核心的ce RNA调控网络,进一步对网络中的靶m RNA进行代谢通路注释。利用茎环实时荧光定量PCR(Stem-loop RT-qPCR)验证测序数据及miRNA差异表达的可靠性。【结果】Am7 vs Am10比较组中共有112个显著性DEmiRNA,包括38个显著上调miRNA和74个显著下调miRNA,分别靶向结合7 434和9 559个m RNA,它们可注释到生物学进程相关的21和23个功能条目,细胞组分相关的16和17个功能条目,以及分子功能相关的10和11个功能条目;此外还能注释到果糖和甘露糖代谢、嘌呤代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等物质代谢相关的83和86条通路;内吞作用、泛素蛋白水解、黑色素生成等细胞免疫相关的10和10条通路;MAPK、Jak-STAT、NF-κB等体液免疫相关的5和5条通路;以及Hippo、Fox O、Notch等涉及生长发育的13和11条信号通路。进一步构建上述9条信号通路相关的ce RNA调控网络,分析发现意蜂中肠发育过程中DEmiRNA与DElnc RNA、DEcirc RNA和DEm RNA之间存在复杂的调控关系;DEmiRNA位于网络中心,而DElnc RNA、DEcirc RNA和DEm RNA位于网络的外周。miR-342-y在意蜂工蜂中肠和幼虫肠道发育过程中均为显著性下调表达,可靶向结合3个DEcirc RNA、4个DElnc RNA和327个m RNA。Stem-loop RT-qPCR结果显示4个DEmiRNA的差异表达趋势与测序结果一致,说明本研究中测序数据及miRNA差异表达趋势真实可靠。【结论】DEmiRNA可能通过参与调控物质和能量代谢通路、Hippo和Wnt等信号通路以及细胞和体液免疫通路相关基因的表达影响意蜂中肠的生长和发育;miR-182-x、miR-291-y、miR-342-y、ame-miR-6001-3p等关键DEmiRNA介导的ce RNA调控网络可能在意蜂中肠发育过程发挥重要的调控作用。     

微小RNA及其介导的竞争性内源RNA调控网络在意大利蜜蜂工蜂中肠发育过程中的潜在作用

【目的】微小RNA（microRNA,miRNA）能够通过靶向结合导致mRNA的抑制或降解,从而对基因表达进行负调控。MiRNA在昆虫的生长、发育、免疫和细胞生命活动调控方面扮演关键角色。本研究旨在对意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）工蜂中肠的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA)及其调控网络进行深入分析,并结合前期在mRNA、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和环状RNA(circular RNA,circRNA)组学层面的相关研究结果,系统解析中肠发育过程的miRNA差异表达谱及竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）调控网络介导的中肠发育机理。【方法】利用small RNA-seq技术对正常的意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠（Am7和Am10）进行测序。将质控后的测序数据比对西方蜜蜂基因组,再将比对上的序列标签（tags）比对到miRBase数据库以鉴定已知miRNA。利用每百万标签序列（tags per million,TPM）算法对miRNA表达量进行计算和归一化处理。根据|log₂fold change|≥1且P≤0.05的标准筛选得到显著性DEmiRNA;利用相关软件进行靶mRNA的预测及GO和KEGG数据库注释。根据靶向结合关系及前期研究结果,利用Cytoscape软件对AMPK、PI3K-Akt、Wnt、cAMP、Hippo、mTOR、Toll/Imd、TGF-beta和MAPK 9条信号通路相关的DElncRNA/DEcircRNA-DEmiRNA-DEmRNA网络进行可视化;构建以miR-342-y为核心的ceRNA调控网络,进一步对网络中的靶mRNA进行代谢通路注释。利用茎环实时荧光定量PCR（Stem-loop RT-qPCR）验证测序数据及miRNA差异表达的可靠性。【结果】Am7 vs Am10比较组中共有112个显著性DEmiRNA,包括38个显著上调miRNA和74个显著下调miRNA,分别靶向结合7 434和9 559个mRNA,它们可注释到生物学进程相关的21和23个功能条目,细胞组分相关的16和17个功能条目,以及分子功能相关的10和11个功能条目;此外还能注释到果糖和甘露糖代谢、嘌呤代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等物质代谢相关的83和86条通路;内吞作用、泛素蛋白水解、黑色素生成等细胞免疫相关的10和10条通路;MAPK、Jak-STAT、NF-κB等体液免疫相关的5和5条通路;以及Hippo、FoxO、Notch等涉及生长发育的13和11条信号通路。进一步构建上述9条信号通路相关的ceRNA调控网络,分析发现意蜂中肠发育过程中DEmiRNA与DElncRNA、DEcircRNA和DEmRNA之间存在复杂的调控关系;DEmiRNA位于网络中心,而DElncRNA、DEcircRNA和DEmRNA位于网络的外周。miR-342-y在意蜂工蜂中肠和幼虫肠道发育过程中均为显著性下调表达,可靶向结合3个DEcircRNA、4个DElncRNA和327个mRNA。Stem-loop RT-qPCR结果显示4个DEmiRNA的差异表达趋势与测序结果一致,说明本研究中测序数据及miRNA差异表达趋势真实可靠。【结论】DEmiRNA可能通过参与调控物质和能量代谢通路、Hippo和Wnt等信号通路以及细胞和体液免疫通路相关基因的表达影响意蜂中肠的生长和发育;miR-182-x、miR-291-y、miR-342-y、ame-miR-6001-3p等关键DEmiRNA介导的ceRNA调控网络可能在意蜂中肠发育过程发挥重要的调控作用。     

中华蜜蜂幼虫肠道参考转录组的de novo组装及SSR分子标记鉴定

【目的】利用RNA seq技术对中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫肠道参考转录组进行de novo组装,并进行功能及代谢通路注释,进而利用该转录组数据进行中蜂幼虫的SSR分子标记鉴定。【方法】实验室条件下饲养中蜂幼虫,将纯化的蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)孢子饲喂3日龄幼虫,剖取4、5和6日龄幼虫肠道,液氮速冻。将健康幼虫肠道与感染球囊菌的幼虫肠道同时进行Illumina测序。通过对raw reads的过滤得到clean reads,利用Trinity软件组装得到unigenes。通过BLASTx(E-value10-5)比对NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库,对unigenes进行功能和代谢通路注释。利用MISA软件对所有unigenes进行SSR搜索,并利用Primer Premier 5软件设计特异性SSR引物,通过常规PCR对来源于北京、辽宁兴城和四川成都的中蜂幼虫肠道样本进行SSR位点鉴定。【结果】中蜂幼虫肠道的RNA seq共得到35 670 000条reads,de novo组装得到43 557个unigenes,平均长度为898 nt。共有18 225个unigenes可被注释到上述公共蛋白数据库,单独注释到NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库的unigenes数分别为3 899、443、37和10个。KOG注释结果显示,11 442条unigenes分布于25个基因家族,其中注释到RNA加工和修饰家族的基因数最多,达1 249个。9 679个unigenes的GO分类结果显示,在生物学进程分类中,注释到细胞进程的基因最多,达4 201个,在分子功能和细胞组分类中,注释到结合与细胞的基因数最多,分别为4 935和2 900个。4 517个unigenes可注释到KEGG数据库中的216个代谢通路,注释到核糖体的基因数最多,达385个。利用MISA软件,可在7 763个unigenes搜索到13 448个SSR位点,随机选取20对SSR引物对国内3个不同来源的中蜂幼虫肠道样本的SSR位点进行扩增,有6对引物可鉴定出SSR分子标记。【结论】成功组装并注释了中蜂幼虫肠道参考转录组,可为中蜂及其幼虫的分子生物学及组学研究提供重要的参考信息,也可用于补充、丰富和检验东方蜜蜂的参考基因组,基于此转录组数据开发出6个中蜂的SSR分子标记,可应用于中蜂的基因图谱构建、基因多样性分析、基因定位等研究,也说明利用转录组数据开发非模式生物SSRs的方法可行。     

旱柳转录组测序及生物学分析

对盐敏感旱柳沿江柳和耐盐旱柳9901的杂交F_1代根部进行了RNA-Seq测序和分析,共获取了107 950条Unigene,平均长度为1 076.96 bp。通过与COG、GO等8个数据库比对,60 848个基因获得注释信息,其中38 182条Unigene在GO数据库中获得注释,24 101条Unigene在KEGG数据库中获得注释。GO和KEGG富集分析结果表明,差异表达基因主要调节核糖体代谢、植物激素信号转导等生物学功能。     

意大利蜜蜂工蜂中肠发育过程中长链非编码RNA的差异表达分析

【目的】长链非编码RNA(lncRNA)在真核生物的基因表达、表观遗传和细胞周期调控等方面发挥重要功能。本研究旨在探究意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂中肠发育过程中lncRNA的表达谱及其作用。【方法】利用RNA-seq技术和链特异性建库方法对意蜂7和10日龄工蜂中肠(Am7、Am10)进行深度测序,下机的原始数据经过Perl脚本过滤得到高质量有效读段。利用bowtie工具将有效读段比对核糖体数据库,进一步利用Top Hat2软件将未比对到核糖体数据库上的数据比对到参考基因组。利用CPC和CNCI软件对转录本的编码能力进行预测。通过RT-PCR对部分lncRNA进行鉴定。利用edgeR软件进行差异表达lncRNA(DElncRNA)分析,进而预测lncRNA的上下游基因,并对上下游基因进行GO及KEGG代谢通路富集分析。联用RNAhybrid、Miranda和Target Scan软件预测DElncRNA靶向结合的mi RNA及mi RNA靶向结合的靶基因,并通过Cytoscape软件构建DElncRNAs-mi RNAs-m RNAs的调控网络。最后,通过RT-qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】Am7和Am10的深度测序分别获得134 802 058和147 051 470条原始读段,经严格过滤分别得到134 166 157和146 293 288条有效读段;共得到3 890个DElncRNA,包括2 005个上调lncRNA与1 885个下调lncRNA。RT-PCR验证结果显示共有8个lncRNA能扩增出符合预期的目的片段,表明预测出的lncRNA真实存在。DElncRNA的上下游基因数为1 793个,它们涉及42个GO条目,包括代谢进程、发育进程、细胞进程、应激反应和免疫系统进程等;这些上下游基因还涉及251条代谢通路,包括碳代谢、嘌呤代谢和脂肪酸的生物合成等物质代谢通路,硫代谢、甲烷代谢和氧化磷酸化等能量代谢通路,Hippo信号通路、Wnt信号通路和Notch信号通路等信号通路,溶酶体、内吞作用和泛素介导的蛋白水解等细胞免疫通路,以及MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路和NF-kappa B信号通路等体液免疫通路,上述结果表明DElncRNA在意蜂中肠发育过程中参与物质和能量代谢、细胞生命活动和免疫调控。进一步分析发现TCONS_00020918可通过调控西方蜜蜂王浆主蛋白1编码基因在意蜂工蜂中肠的营养吸收、级型分化中发挥功能。DElncRNA的调控网络分析结果显示DElncRNA与mi RNA、m RNA间存在复杂的调控关系,部分DElncRNA处于调控网络的中心位置且能靶向结合较多的mi RNA,也有部分mi RNA可被多个DElncRNA共同靶向,表明这些DElncRNA可能在中肠发育中发挥重要作用。随机挑取5个DElncRNA进行RT-qPCR验证,结果显示它们的表达量变化趋势与测序结果一致,证实了本研究测序数据的可靠性。【结论】差异表达长链非编码RNA(DElncRNA)广泛参与意蜂工蜂中肠的新陈代谢、细胞活动和免疫调控并作为竞争性内源RNA(ce RNA)发挥作用,研究结果为关键lncRNA的筛选和功能研究提供了必要的数据支持。     

卵形鲳鲹卵巢不同发育时期的转录组测序分析

【目的】鉴定筛选出与卵形鲳鲹卵巢发育相关的候选基因及信号通路,为揭示其卵巢性成熟过程的分子机制打下基础。【方法】挑选卵巢发育处于?期和Ш期的雌性卵形鲳鲹,分别构建卵形鲳鲹卵巢?期和Ш期的cDNA文库,采用Illumina HiSeqTM 2500进行转录组测序,经过滤、质量控制及拼接组装后获得的Unigenes在七大数据库（Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO）中进行比对;通过FPKM及DEGseq筛选出差异表达基因,以GOseq和KOBAS对差异表达基因分别进行功能注释及信号通路富集分析,并采用MISA和GATK3进行SSR鉴定及SNP分析。【结果】卵形鲳鲹卵巢组织转录组测序获得的325156432条Raw reads,经过滤筛选得到317206752条Clean reads,拼接组装后得到59554条Unigenes;69.65%的Unigenes在Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO等七大数据库中注释成功,其中有24599条Unigenes被注释到GO数据库,15997条Unigenes被注释到KEGG数据库。在卵形鲳鲹卵巢组织的2个发育时期共鉴定获得56115个基因,经差异表达分析后获得17737个差异基因,其中8169个基因在卵巢Ш期上调表达、9568个基因在卵巢Ш期下调表达。GO功能注释分析发现,卵形鲳鲹卵巢差异表达基因主要注释在细胞过程、氮化合物代谢过程、初级代谢过程、核、核部分、离子结合及水解酶活性等条目上;而KEGG信号通路富集分析结果显示,17737个差异表达基因显著富集在318条代谢途径上,其中前20条KEGG信号通路包括2-氧代羧酸代谢、PI3K-Akt信号通路、甲状腺激素信号通路、磷脂酶D信号通路、Fc εRI信号通路和细胞周期等。卵形鲳鲹卵巢转录组（59554条Unigenes）中共存在30133个SSRs和82490个SNPs。【结论】GnRHR、FSHR、FSHβ、CYP11A、SIRT3和PEG3等差异表达基因及PI3K-Akt信号通路和VEGF信号通路等与卵形鲳鲹卵巢的发育密切相关,共同调节卵巢的发育与成熟,在卵巢性成熟过程中发挥重要作用。     

天维菌素处理埃及伊蚊幼虫的转录组学分析

为探索新型大环内酯类杀虫剂天维菌素对蚊虫防控的应用前景，进一步了解天维菌素对蚊虫的作用机制，本研究利用转录组测序技术研究埃及伊蚊幼虫参与药物代谢及靶标等生物学过程的基因。利用高通量测序获取给药前后埃及伊蚊的差异表达基因，进一步进行Gene Ontology（GO）及KEGG富集分析，并利用Real-time Quantitative PCR（rt-qPCR）验证目标基因表达情况。结果显示，与对照组相比，天维菌素处理后埃及伊蚊幼虫中有2 647个基因差异显著表达，其中上调基因有697个，下调表达的基因有1 950个。Gene Ontology分析显示，测序基因主要注释到细胞过程、代谢过程、膜、结合和催化活性等功能类。KEGG通路主要富集在药物代谢、免疫应答、生物合成以及消化与吸收等过程。选取GST-1，EST2等6个目标基因进行rt-qPCR验证，表达水平与测序结果一致。     

萝卜蚜有翅型和无翅型转录组差异分析

采用Illumina测序平台获得了萝卜蚜转录组数据,有翅蚜和无翅蚜混合样本共得到107 992 806条Cleaning Reads,组装得到69 588条Unigene序列,平均长度为716 bp。有翅蚜测序结果共得到44 620 184条Cleaning Reads;无翅萝卜蚜测序结果共得到47 113 716条Cleaning Reads。2组样品差异表达基因的分析表明共有显著性差异表达基因104个,其中表达上调基因有74个,表达下调基因有30个。对差异表达基因进行GO注释及KEGG富集分析显示,Hippo信号通路、甲状腺激素信号通路和催产素信号通路与翅型分化及与之紧密联系的生殖率差异相关性较强。     

藏黄牛与宣汉黄牛心脏miRNA表达谱比较

【目的】miRNA作为一类非编码RNA,广泛参与机体多种生命活动,研究旨在挖掘miRNA在藏黄牛和宣汉黄牛心脏组织中的差异miRNA,为进一步研究藏黄牛低氧适应的分子机制提供基础数据。【方法】随机选取健康的藏黄牛和宣汉黄牛各3头,迅速采集其心脏组织,使用Trizol法提取RNA,琼脂糖凝胶电泳切胶选取18—30nt的片段,连接3'端和5'端,反转录后进行扩增,凝胶电泳切胶纯化后建立藏黄牛和黄牛各3个文库,利用Illumina HiSeq4000测序平台进行高通量测序;将测序得到的序列进行过滤,比对GenBank和Rfam数据库,筛选出藏黄牛和宣汉黄牛的差异miRNA,进行功能注释及信号通路富集分析;随机选择8个miRNAs,利用实时荧光定量PCR检测其在心脏组织的表达量,以验证测序数据的准确性。【结果】藏黄牛和宣汉黄牛心脏组织的高质量读值的序列分别为17 463 446条和13 662 812条,干净读值为16 552 296条和12 055 304条,且在藏黄牛和宣汉黄牛中高质量核酸序列长度富集最多的均是21nt,分别为37.5%和32.1%;且共筛选出219个差异miRNAs,其中48个显著上调,171个显著下调;GO功能注释得到差异miRNA靶基因分子功能中显著富集的条目有22条,如,GO:0005488(结合)、GO:0005515(蛋白质结合)和GO:0043167(离子结合);细胞组分中显著富集的条目有20条,如,GO:0005623(细胞)、GO:0044464(细胞组分)和GO:0005622(细胞内);生物过程中显著富集的条目有13条,如,GO:0035556(细胞内信号转导)、GO:0032774(RNA生物合成过程)和GO:0006351(转录,DNA模板化),KEGG信号通路分析得到差异表达miRNAs靶基因显著富集到胰岛素信号通路(139个靶基因)、mTOR信号通路(38个靶基因)和HIF-1信号通路(92个靶基因)等232个信号通路中,其中有12个靶基因共同作用于这3个信号通路,说明miRNAs可能通过这3个信号通路,共同参与藏黄牛低氧适应性的调控;随机选取8个miRNAs进行荧光定量验证,其表达趋势与测序结果表达趋势基本一致,表明高通量测序数据可信度较高。【结论】得到了miRNA在藏黄牛与宣汉黄牛心脏组织中的表达谱,为揭示藏黄牛低氧适应性的调控机制研究奠定了基础。     

2种不同生长规格墨瑞鳕肌肉组织转录组测序分析

【目的】掌握不同生长规格墨瑞鳕个体间差异表达基因的表达特点,为其功能相关基因深度挖掘及分子遗传育种提供科学依据。【方法】挑选同一养殖条件下极大个体和极小个体的墨瑞鳕,构建肌肉组织cDNA文库后,采用Illumina HiSeqTM 4000测序平台对存在生长差异的墨瑞鳕肌肉组织进行转录组测序分析,获得的Unigenes在Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO等数据库中进行比对;通过FPKM及DEGseq筛选出差异表达基因,以GOseq和KOBAS对差异表达基因分别进行GO功能注释及KEGG信号通路富集分析,并采用MISA进行SSR鉴定分析。【结果】从墨瑞鳕肌肉组织中共测序获得39749条Unigenes,其长度范围在301~55230 bp,平均长度为1705 bp。注释到Nt、Nr、Swiss-Prot、Pfam数据库的Unigenes分别有27046、20824、18268和17772条,在7个数据库中均得到注释的Unigenes共计6742条,占Unigenes总数的16.96%。根据差异表达基因筛选条件P<0.05且|log₂ Fold Change|>1,共筛选出722个差异表达基因,其中上调基因308个、下调基因414个。差异表达基因GO功能注释分析结果表明,注释基因数目较多的GO功能条目包括细胞过程、代谢过程、膜、细胞器及结合等;KEGG信号通路富集分析发现,差异表达基因被成功富集到234条信号通路上,主要涉及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶信号通路、MAPK信号通路、胰岛素信号通路及FoxO信号通路等。在39749条Unigenes中鉴定筛选出22120个SSRs,占Unigene总数的55.65%,SSR的平均间距为3063 bp。【结论】基于转录组测序分析获得的墨瑞鳕肌肉组织差异表达基因以发挥结合、细胞过程及代谢过程等功能为主,且主要富集在PI3K-Akt信号通路、核糖体信号通路、FoxO信号通路及细胞凋亡等能量代谢相关通路上,通过共同协调而对墨瑞鳕的生长发育起调控作用。     

三叶木通果实转录组测序初步分析

为了探究三叶木通果实成熟过程中基因表达情况,本实验采用Illumina HiSeq2000高通量测序技术对三叶木通6个不同时期果实进行了转录组测序,对所获得的数据进行GO和KOG注释与分类及KEGG代谢通路分析。本实验共获得Unigene 106 547条,在GO与KOG数据库中分别有27 302和12 014条Unigene注释成功,KEGG通路分析显示有11 749个Unigene参与到270条已知代谢通路中,其中包括26条乙烯合成关键酶的Unigene。本实验结果可为探究三叶木通果实成熟过程中基因表达情况以及三叶木通果实成熟基因的后续研究提供重要基础。     

感染意大利蜜蜂工蜂的东方蜜蜂微孢子虫及其纯化孢子的高表达基因分析

为探究东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)在侵染意大利蜜蜂(Aips mellifera ligustica)过程的基因表达谱及高表基因(highly expressed gene,HEG)的功能,本研究利用RNA-seq技术对N.ceranae感染的意蜂工蜂7和10 d工蜂中肠(NcT1和NcT2)及其纯化孢子(NcCK)进行高通量测序。根据FPKM值≧15的标准筛选出各组的HEG并进行Venn分析,进而通过GO分类和KEGG代谢通路富集分析对各组的共有HEG进行功能注释。测序得到的原始读段经严格质控后分别得到5 816 465、28 501 225和210 824 312条高质量的有效读段,分别从NcT1、NcT2和NcCK中筛选出1 263、1 233和1 511个HEG,其中有1 079个基因在各组均高量表达,分别有15和7个基因仅在NcT1和NcT2中高量表达。GO分类结果显示,共有HEG涉及9个生物学进程相关条目,10个细胞组分相关条目,以及5个分子功能相关条目。KEGG代谢通路富集分析结果表明,共有HEG富集在218条代谢通路,富集基因数最多的是核糖体、Epstein-Barr病毒感染、细胞周期、内质网蛋白加工和真菌核糖体生物合成。深入分析结果显示分别有5和5个共有HEG富集在MAPK和cAMP信号通路,表明此2条信号通路及富集的HEG可能在N.ceranae的环境应激和侵染过程中发挥重要作用。研究结果提供了N.ceranae感染意蜂工蜂过程中的基因表达谱,揭示了HEG的作用,为深入解析N.ceranae的侵染机制打下了初步基础。