雨生红球藻植物类型隐花色素基因克隆与序列分析

为了从雨生红球藻中获得感知蓝光信号的植物类型隐花色素(CRY)序列,采用同源克隆和RACE相结合的方法获得了雨生红球藻编码植物类型Hae-P-CRY的c DNA全长,并对其序列进行生物信息学分析。结果表明,Hae-P-CRY基因的c DNA全长为3 608 bp,包含开放阅读框全长2 988 bp,编码995个氨基酸,预测等电点6.19,理论分子质量为107.7 ku。经Blast P分析发现,Hae-P-CRY氨基酸序列与莱茵衣藻来源植物类型Cre CRY氨基酸序列的相似性达到66.6%,与拟南芥CRY氨基酸序列相似性为46.94%。系统进化分析表明,Hae-P-CRY与其他真核绿藻来源的植物型CRY聚在一支,属于植物类型CRY。结构域分析表明,Hae-P-CRY基因含有光感知PHR结构域和信号转导CCT结构域,暗示具有感知和转导光信号功能。试验从雨生红球藻得到植物类型Hae-P-CRY基因序列,可为其表达、功能及互作蛋白研究奠定基础,同时为进一步解析雨生红球藻在蓝光响应中的分子机制奠定基础。     

茄子生长素响应因子SmARF8的克隆与分析

 【目的】克隆茄子生长素响应因子新基因,为研究茄子果实形成发育的分子机制提供依据。【方法】采用RT-PCR 和RACE 技术克隆茄子ARF家族相应基因的cDNA全长序列。经序列联配进行与其它物种同源基因的保守域和进化关系分析。实时定量PCR 检测目的基因在茄子不同组织中的表达情况。【结果】将该基因命名为SmARF8,它的cDNA序列全长为3 671 bp,编码阅读框全长2 676 bp。氨基酸序列分析表明,SmARF8蛋白拥有核定位序列,蛋白质结构具有ARF家族的N-端DNA结合域,中间脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基富集的非保守调控域,C-末端蛋白互作域。氨基酸与拟南芥的调控单性结实基因ARF8相似性较高,进化树分析表明它们聚集在一个分支上,进化关系非常密切。SmARF8基因在幼果中表达最强,在根、茎、叶、花蕾、花朵及成熟果实中表达较强烈。【结论】从茄子中克隆得到一个生长素响应因子家族基因SmARF8。     

笃斯越橘花青苷途径中CHS基因的克隆与序列分析

以笃斯越橘花朵为试材,根据兔眼蓝莓查尔酮合成酶(VaCHS)mRNA全长序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增出长度大约为1 400bp目的片段,经测序,结果表明,笃斯越橘CHS基因(VuCHS)cDNA序列全长1 391bp,包含1 170bp开放阅读框(ORF),编码389个氨基酸,将笃斯越橘CHS基因(VuCHS)编码的蛋白质与其他来源的查尔酮合成酶蛋白的氨基酸序列进行比对,发现与兔眼蓝莓、杜鹃花和猕猴桃的一致性分别为99%、93%和93%,该基因蛋白质的氨基酸序列与其他植物CHS基因蛋白质的氨基酸序列进化分析表明,与兔眼蓝莓和猕猴桃属于同一分支,与兔眼蓝莓亲缘关系最近。     

光皮桦成花相关MADS-box基因BlMADS1的克隆与表达

MADS-box家族基因广泛分布于植物中,在花发育过程中起着重要调控作用。采用同源克隆结合c DNA末端快速扩增技术(RACE)在光皮桦Betula luminifera中克隆到1个MADS-box基因,命名为Bl MADS1。该基因可能存在2个不同的转录本Bl MADS1S和Bl MADS1L:前者为1 150 bp,编码254个氨基酸,具有MADS-box基因的典型结构,与欧洲白桦Betula pendula的同源基因相似性最高(97%);后者长1 312 bp,但仅含有690 bp的开放阅读框(ORF),编码229个氨基酸,缺失MADS-box蛋白的C端。这种缺失可能由内含子可变剪切造成。同源比对和系统进化分析表明:Bl MADS1属于AP1/SQUA亚家族的AGL79这一分支。定量聚合酶链式反应(PCR)表达分析表明:Bl MADS1基因在根、茎、叶和花器官中均有表达,但Bl MADS1S和Bl MADS1L这2个转录本表达模式存在差异。雄花序发育过程中,Bl MADS1的2个转录本的表达峰值均在萌动雄花序时期;而在雌花序发育过程中,Bl MADS1L和Bl MADS1S表达水平的峰值分别出现在初生雌花芽和萌动雌花序。图6表1参27     

山荆子CBF转录因子的克隆、序列分析及植物表达载体的构建

利用RT-PCR技术从山荆子cDNA中克隆CBF基因,ORF全长756 bp,编码252个氨基酸;其氨基酸序列含典型的CBF基因蛋白保守的序列AP2/EREB DNA结合域及CBF家族蛋白特征短多肽序列(PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR);与Genebank上收录的几种植物CBF基因进行氨基酸同源性比对,结果发现山荆子CBF转录因子MbCBF和苹果CBF/DREB1基因的氨基酸序列相似性为98%;与梅树CBF相似性为67%;进一步构建了植物表达载体,为利用CBF基因提高植物抗逆性奠定基础。     

无核葡萄D类MADS-box基因的克隆与序列分析

MADS-box基因在多种植物的发育过程特别是花器官和果实发育过程中发挥重要的作用。该试验从无核葡萄c DNA文库中,克隆得到一个D类的MADS-box基因,命名为Vv MADS3,该基因全长839bp,开放阅读框长681bp,编码一个含有226个氨基酸的蛋白。通过序列分析得知,该基因所编码的蛋白与其它植物质中的MADS-box蛋白有很高的同源性。该基因的研究为进一步揭示葡萄无核分子机理和进行无核葡萄育种提供依据。     

甜荞FaeseuFUL基因的克隆和序列结构分析

利用基因同源克隆技术结合3' RACE和5' RACE基因克隆技术,从甜荞(Fagopyrum esculentum)花芽中克隆到1个与花序分生组织发育和果实发育等过程中起到重要作用的euFUL基因的同源基因FaeseuFUL(GenBank登录号为KM386626).序列分析表明,其cDNA全长1060bp,包括38bp的5'-UTR、1个编码231个氨基酸的696bp的完整开放阅读框以及326bp的3’-UTR.蛋白质分子序列比对和分子系统进化分析表明,FaeseuFUL基因是MIKC-type MADS-box基因,属于AP1/ SQUA亚家族的euFUL进化系,与拟南芥的AGL8/FUL的同源基因相似性达到81.4％,其编码区的C末端含有euFUL进化系的FUL基序和paleoAP1基序.     

中国水仙NtMADS3基因全长的克隆与表达分析

MADS-box基因在植物花发育中具有重要作用。采用RT-PCR和RACE技术,从中国水仙幼嫩花蕾中分离到了一个MADS-box同源基因,命名为NtMADS3(GenBank登记号:EU081900)。该基因cDNA全长980 bp;编码区编码241个氨基酸,具有典型的植物MADS-box基因结构。序列分析表明,NtMADS3编码的蛋白与其他植物的MADS-box蛋白有着较高的一致性,其中与石刁柏的AOM3一致性高达89.2%,与拟南芥的AGL6一致性为60.0%。系统进化树分析表明NtMADS3基因属于E类功能基因。组织表达模式分析显示,NtMADS3基因在中国水仙的开花期各器官及花的各部位均有表达。将该基因置于CaMV 35S启动子控制下,构建到载体pBI121的多克隆位点,在拟南芥中异位表达,转基因植株花期提前,但花型无显著变化。     

荻MsFT1及MsFT2基因的克隆及序列分析

FT(Flowering locus T)基因是最初在拟南芥中发现的一个控制光周期途径开花的一个关键基因,禾本科水稻中发现Hd3a(Heading date 3a)基因被证明与FT的同源且功能相同。该研究采用同源序列法通过水稻Hd3a的m RNA序列在近缘物种甜高粱基因组序列中进行BLAST得到c DNA序列进行引物设计,从禾本科芒属荻中克隆出2条FT的同源基因,命名为Ms FT1和Ms FT2。Ms FT1全长543 bp,编码181个氨基酸;Ms FT2全长540 bp,编码180个氨基酸。Ms FT1和Ms FT2的碱基序列相似性达98%,推导的氨基酸序列相似性达97%,均含有PEBP特异结构域。通过clustal软件将Ms FT1和Ms FT2与其他物种FT基因比较显示与甜高粱的相似性最高达98%、96%,其次是玉米、小麦、水稻等禾本科植物相似度较高。将Ms FT1和Ms FT2氨基酸序列和水稻FT家族18个成员进行对比,Ms FT1及Ms FT2属于FT家族中的FT-like亚族,且与Hd3a处于同一进化分支上。     

蓝莓鲨烯合酶基因的克隆与表达分析

鲨烯合酶基因(SQS)在植物三萜类化合物合成途径中起着重要作用,是上游代谢通路中的关键基因。本研究采用RT-PCR技术从‘喜来’蓝莓根中克隆得到VcSQS基因,序列全长1 489 bp,序列分析结果表明,其含有1 242 bp的开放阅读框,编码413个氨基酸。氨基酸同源序列分析表明,蓝莓与其它物种SQS蛋白氨基酸序列相似性很高,与山茶科的茶相似性最高,达90.58%,与葡萄相似性达87.92%。荧光定量试验结果表明,SQS基因在蓝莓叶中的表达量最高,芽中的最低。     

鸭梨过氧化物酶基因全长克隆与序列分析

采用RT-PCR和RACE方法,从鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd)果实中获得过氧化物酶(Peroxidase)基因POD的cDNA全长,命名为PbPOD,并将该基因在GenBank上登录,登录号为JQ325052。基因序列分析表明,该基因的cDNA全长为1 487 bp,包含72 bp的5'非翻译区、404 bp的3'非翻译区和长度为1 011 bp且编码336个氨基酸的编码区(CDS)。氨基酸序列分析表明,该基因编码的蛋白具有POD家族保守存在的所有功能活性位点,且与甜瓜、拟南芥、烟草等植物POD相似性达92%以上。     

山核桃MADS-like基因的克隆与分析

MADS-box基因在植物花发育的整个阶段起到了极为关键的作用。根据山核桃Carya cathayensis雌花芽454测序得到的基因片段,采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术,获得了1条Cc MADS-like基因。序列分析结果表明:Cc MADS-like开放阅读框(ORF)长度为609 bp,编码202个氨基酸,具有典型的MADS-box结构域,包括高度保守的MADS盒和K区以及I区、C区。Cc MADS-like与拟南芥Arabidopsis thaliana,金鱼草Antirrhinum majus,美洲黑杨Populus deltoides,欧洲大叶杨Populus trichocarpa等的同源基因所编码的蛋白质同源性分别达到48%,65%,69%,71%。山核桃不同组织实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)结果表明:Cc MADS-like基因在花芽中表达量远远高于其他组织,暗示该基因极有可能参与山核桃成花发育。酵母单杂交实验表明,Cc MADS-like蛋白具有转录激活活性。     

甜荞花同源异型基因FeMADS1的克隆和序列结构分析

采用同源克隆方法,并结合RACE技术,从甜荞花芽分离得到1个A类MADS-box基因FeMADS1的cDNA全长,GenBank登录号为KM386627,其cDNA全长1 107bp,包括1个编码234个氨基酸、长为705bp的开放阅读框。序列同源比对和分子系统发生分析表明,其蛋白与拟南芥AGL8(FUL)的相似性最高,属A类MADS-box基因亚家族中的euFUL进化系,含MADS、I、K和C末端4个明显的结构域,并且K结构域包含K1、K2和K3共3个保守的富含疏水氨基酸残基的亚结构域,C末端结构域含FUL型基因2个特有的模体:FUL motif和paleoAP1motfi。     

辣椒花器官发育相关PAP3基因的克隆与生物信息学分析

AP3基因属于MADS-box基因家族中控制花器官发育的B类基因,与PI基因一起参与控制植物花瓣和雄蕊的形成。克隆到了辣椒控制花器官发育的PAP3基因(Gen Bank登录号:HM104635),该基因全长929 bp,编码226个氨基酸,具有典型的MADS结构域和K结构域;与其他6种植物同源基因比对显示,它们的氨基酸序列相似性在82%~91%之间;系统进化树分析表明,PAP3属于MADS-box基因家族中的AP3/PI亚族成员,与辣椒花器官发育相关。     

芒果CHI基因的克隆及其表达分析研究

采用RT-PCR和RACE方法从芒果的果实中克隆得到了一个参与花色素苷生物合成的查尔酮异构酶基因(CHI)的全长的c DNA序列,进而对得到的序列采用了TMHMM、DNAman等软件进行生物信息学分析,发现芒果CHI基因包含编码区、3′和5′非翻译区的长度为960 bp的c DNA序列,开放阅读框为753 bp,编码250个氨基酸;等电点为6.46,分子重量为27.03 Kd;对跨膜结构域进行了预测发现,该基因无跨膜结构域;蛋白二级结构元件以无规则卷曲和β-折叠为主;聚类分析发现:该基因与美洲葡萄、葡萄、龙眼和橄榄等植物的亲缘关系较近,而与拟南芥、萝卜、文心兰等亲缘关系较远;分别对红色和绿色的叶片分析发现:该基因主要在红色叶片中表达量比较高。     

沙田柚F-box蛋白基因的克隆及序列分析

采用生物信息学方法,对沙田柚[Citrus maxima(Burm.)Merr.cv.Shatian Yu.]F-box蛋白基因编码的蛋白质从序列特征、理化性质、跨膜结构域、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明,该基因全长为1 427 bp(Gen Bank登录号为KR363148),开放阅读框(ORF)全长为1 101 bp,共编码366个氨基酸,编码蛋白质的分子质量43.09 ku,理论等电点5.15。沙田柚F-box蛋白基因编码蛋白含有一个植物F-box蛋白家族的保守结构域,为亲水性非分泌不稳定蛋白,不跨膜运动,共有30个可能的磷酸化位点。氨基酸序列分析表明,其编码的氨基酸与甜橙(Citrus sinensis,KDO71185)和克莱门柚(Citrus clementina,XP_006425495)F-box蛋白的同源性分别为99%、98%。系统进化树表明,沙田柚F-box蛋白基因与与甜橙(Citrus sinensis,KDO71185)和克莱门柚(Citrus clementina,XP_006425495)亲缘关系很近,属于同一进化分支。     

条斑紫菜抗坏血酸过氧化酶基因的克隆及生物信息学分析

结合电子克隆及RT-PCR技术获得条斑紫菜(Porphyrayezoensis)过氧化物酶基因。该基因cDNA序列长847 bp,包含编码245个氨基酸的开放阅读框。生物信息学分析结果显示,该基因编码蛋白无信号肽序列,与高等植物拟南芥的细胞质抗坏血酸过氧化物酶蛋白序列同源性较高,在细胞质中行使功能。此外,该基因的进化历程基本符合植物从低等到高等的进化过程。     

蓝莓角鲨烯环氧化酶基因的克隆与表达分析

角鲨烯环氧化酶(SQE)催化角鲨烯合成三萜类骨架β-香树酯前体2,3氧化鲨烯,是熊果酸合成途径中的重要限速酶。本研究采用RT-PCR技术从‘喜来’蓝莓根中克隆得到VcSQE基因,全长序列1 744 bp,序列分析结果表明,其含有1 620 bp开放阅读框,编码539个氨基酸;氨基酸同源序列分析表明,蓝莓与其它物种SQE蛋白氨基酸序列相似性很高,与山茶科的茶相似性最高,达90.6%,与猕猴桃相似性为89.7%;不同植物SQE蛋白序列分析发现,该类植物SQE含有3个保守结构域,均在VcSQE中存在;荧光定量试验表明,VcSQE基因在叶中表达量最高,根中表达量最低。     

萼脊兰AGAMOUS(AG)基因的克隆与表达分析

通过对萼脊兰AGAMOUS(AG)基因进行结构、功能分析、克隆和AG基因的表达调控等方面的探究,发现,萼脊兰AG的氨基酸序列属于植物特有的MIKC型MADS-box的C类基因,该基因c DNA全长1 002 bp,包含一个702 bp的开放阅读框,该基因命名为AG(登录号KY744276),共编码233个氨基酸。蛋白序列比对和进化树分析表明,AG蛋白与蝴蝶兰蛋白一致性最高,进化距离最近。二级结构分析表明,该蛋白分子属于亲水性蛋白,其中α螺旋占48.93%,延伸链占11.59%,不规则卷曲占39.48%。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,AG基因在花蕾和蕊柱中表达量很高,说明AG基因的表达具有组织特异性,在ABCDE模型中属于C类基因的特征非常明显,控制着雄蕊和雌蕊的发育。