大豆GmPIN2家族基因调控根系发育功能初探

生长素作为重要的植物激素之一。生长素的转运参与了植物各组织器官发育调控。在拟南芥中,生长素转运调控主要由PIN家族蛋白所介导,其中拟南芥AtPIN2主要通过介导生长素向基运输调控根的向重力性。大豆中PIN2家族蛋白及其功能研究尚未有报道。本研究通过构建系统进化树和蛋白质结构域分析发现,大豆GmPIN2a和GmPIN2b为AtPIN2的同源基因。组织表达分析研究发现, GmPIN2a和GmPIN2b在根、根瘤原基和根瘤等组织中高表达。GmPIN2a和GmPIN2b在根部主要表达在根尖表皮和外部皮层细胞,在根瘤中GmPIN2a、GmPIN2b均定位于根瘤基部维管束区,此外,GmPIN2a定位在根瘤顶部表皮及外皮层。利用基因编辑技术CRISPR/Cas9(Clustered RegularlyInterspersedShortPalindromicRepeats/CRISPRassociated9)同时敲除GmPIN2a和GmPIN2b后发现,Gmpin2ab突变体根具有明显的重力缺失表型。与野生型相比, Gmpin2ab和35S::GmPIN2b的根面积和侧根长度显著降低,Gmpin2ab...     

大豆PIN-Like(PILS)基因家族的鉴定、表达分析及在根瘤共生固氮过程中的功能

植物激素生长素在植物的生长发育过程中发挥了至关重要的作用,它的稳态和浓度梯度建立控制了几乎所有器官的极性建成。生长素在特定细胞中合成、运输、感知以及代谢降解建立了符合器官发育的生长素浓度梯度。在豆科植物中,根与土壤微生物互作形成了根瘤这一特殊的器官,进行生物固氮。然而,生长素稳态控制生物固氮的功能还未知。拟南芥中的研究表明,PIN-Like (PILS)蛋白协助调节的细胞内生长素稳态,并介导下游细胞核内的生长素信号传递。本研究以大豆作为研究模型,在大豆基因组中鉴定获得19个PILS家族基因(GmPILS),不均匀分布于大豆10条染色体上。GmPILS在大豆9种组织部位中表现出多种表达模式,且具有明显的组织表达特异性。GmPILS1e和GmPILS1f在根瘤菌体区域富集表达,使用人工微RNA沉默(artificialmicro RNA interference,amiRNAi)下调GmPILS1e和GmPILS1f在根瘤的表达,导致根瘤的固氮酶活性上升,而过量表达GmPILS1f导致根瘤的固氮酶活性下降,因此GmPILS1e和GmPILS1f可能参与大豆固氮酶活性的调节。这些结果为进一步解析大豆GmPILS家族基因的功能和作用机制奠定了基础,同时也为结瘤固氮在农业育种中的应用提供了有价值的基因资源。     

应用~(15)N示踪法对大豆不同来源氮素吸收与利用的研究

应用~(15)N 示踪技术,利用克拉克结瘤(R_(jl))和不结瘤(r_(jl))等位基因系以及3种氮处理造成4种不同氮素营养条件,研究在几种氮源单独或混合供应的情况下,各种来源氮素在大豆生长和产量形成过程中的相对重要性及其相互影响。试验结果表明,大豆前期主要利用土壤和肥料中氮素,并以土壤氮素为主,后期主要利用共生固氮。施氮对固氮有明显抑制作用,其轻、重和时间长短与施肥量有关。施氮可增加大豆对土壤氮的吸收,激发率为1.369～1.778,差异极显著。对营养器官氮素转运率测定结果表明,籽粒中氮素的50%是由营养器官转运而来。在营养器官转运到籽粒的氮素中约50%是来自叶片。测定3种氮源在体内各器官中的分配的结果表明,各种氮源间的分配模式有差异,与总氮的分配模式相比,肥料氮和土壤氮较多地分配于营养器官,空气氮较多地分配于籽粒。     

大豆NRG2家族基因的鉴定、特征及表达模式

氮是影响植物生长发育的重要矿质营养元素,硝态氮是大部分植物吸收氮素的主要形式,目前已发现许多基因参与硝态氮的吸收、转运及信号转导过程。硝酸盐调控基因2 (nitrate regulatory gene 2, NRG2)是近年来在拟南芥中鉴定到的与硝酸盐吸收和信号转导相关的基因。本研究采用生物信息学方法,对大豆NRG2家族成员进行全基因组鉴定及表达分析。结果表明：在大豆基因组中共鉴定到30个GmNRG2基因,其编码的蛋白均具有DUF630和DUF632结构域。系统进化分析显示,GmNRG2基因可以聚为7组,且同组的基因成员具有相似的外显子/内含子分布模式。GmNRG2基因不均匀地分布在16条染色体上,片段复制可能导致了GmNRG2基因在大豆基因组中的扩增。GmNRG2各成员启动子区域均存在数量不等的激素或逆境响应元件,表明该家族基因可能参与多种生长发育调节进程。表达模式分析显示,GmNRG2基因具有不同的组织表达特点,5个GmNRG2在干旱或盐胁迫条件下呈现出差异表达。以上结果为深入研究大豆NRG2家族基因的生物学功能提供了一定参考。     

科技与产品

<正>大豆耐逆性研究取得新进展中国科学院遗传与发育生物学研究所张劲松研究组和陈受宜研究组在前期的研究中鉴定到一系列大豆miRNA。该研究发现在这些miRNA中,miR 172a的表达受盐胁迫诱导。利用大豆毛状根转化体系,对miR172a的功能进行了深入研究。结果表明,在毛状根中过表达后显著增强大豆的耐盐性。一系列实验发现miR172a通过切割降解靶基因SSAC1,解除其蛋白对硫胺素(维生素B)前体合成酶基因     

应用15N示踪法对大豆不同来源氮素吸收与利用的研究

应用~(15)N 示踪技术,利用克拉克结瘤(R_(jl))和不结瘤(r_(jl))等位基因系以及3种氮处理造成4种不同氮素营养条件,研究在几种氮源单独或混合供应的情况下,各种来源氮素在大豆生长和产量形成过程中的相对重要性及其相互影响。试验结果表明,大豆前期主要利用土壤和肥料中氮素,并以土壤氮素为主,后期主要利用共生固氮。施氮对固     

大豆GmNramp3a基因克隆及表达分析

本研究利用RT-PCR技术从大豆中克隆了一个Nramp基因家族成员GmNramp3a,并对其基因序列和蛋白结构、亚细胞定位以及表达模式进行了详细分析。生物信息学分析结果表明,GmNramp3a基因开放阅读框(open reading frame, ORF)长度为1 557 bp,由4个外显子组成;Gm Nramp3a蛋白包含11个跨膜结构域(trans-membrane domain, TMD);进化树分析的结果显示Gm Nramp3a蛋白和模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtNramp2的同源性较高。通过拟南芥原生质体瞬时表达亚细胞定位分析表明,Gm Nramp3a蛋白主要定位于液泡膜。采用实时荧光定量PCR对GmNramp3a在大豆不同组织部位的表达量进行分析,结果表明GmNramp3a在茎、根、花和叶几个部位都能表达,尤其在茎和花中的表达量较高。本研究结果可为将来深入分析Gm Nramp3a的生物学功能提供理论基础。     

大豆GmNramp2a基因克隆及亚细胞定位和组织表达分析

为了初步研究大豆(Glycine max)天然抗性相关巨噬蛋白(natural resistance associated macrophage protein, Nramp)家族基因的功能,本研究克隆了一个大豆GmNramp成员基因GmNramp2a。生物信息学分析表明,GmNramp2a基因包含4个外显子,开放阅读框长1 551 bp。Gm Nramp2a蛋白含有10个跨膜结构域和13个保守基序,进化树分析表明GmNramp2a蛋白与拟南芥AtNramp3和AtNramp4同源性最高。通过拟南芥原生质体亚细胞定位分析表明,Gm Nramp2a蛋白定位于液泡膜。用qRT-PCR分析GmNramp2a基因的表达模式表明,Gm Nramp2a基因在根、根瘤、叶片和花中都有表达,其中在根瘤和叶片中表达量较高。结果为进一步研究Gm Nramp2a基因功能提供数据参考。     

拟南芥pre-miR399b植物表达载体的构建

根据拟南芥miR399b茎环序列设计引物,PCR扩增克隆了拟南芥pre-miR399b(precursor miRNA)基因。采用LIC(Ligation-Independent cloning)法将pre-miR399b连接到双元植物表达载体pJG045上,构建成植物表达载体pS-DC2,并用冻融法将其导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中。研究结果为将pre-miR399b基因转化大豆再生植株,鉴定miR399b基因在大豆磷吸收利用中的功能及培育磷高效大豆新品种奠定了基础。     

缺磷对已结瘤大豆生长和固氮功能的影响

磷对大豆生长起着非常重要的作用,然而区别磷在大豆生长和根瘤功能中的影响非常困难。为阐明根瘤形成后缺磷对大豆植株生长和固氮功能的影响,采用水培方法,营养液中供给正常磷酸盐浓度(30 µmol L^-1)条件下,待根瘤形成后,将营养液中的磷水平分别转换为0 µmol L^-1 (无磷)和4 µmol L^-1 (缺磷),研究缺磷对大豆生长和结瘤固氮的影响。结果表明,大豆根瘤具有固氮功能后,进行营养液中不同浓度的磷酸盐处理,从处理第9天开始,缺磷对大豆生物量的影响才表现出来,而缺磷对根瘤形成和生长的影响从处理开始就比较明显。处理第9天,无磷、缺磷和正常磷处理根瘤数比处理第3天分别增加11.8%、15.4%和20.0%,单位植株豆血红蛋白含量和单位根瘤豆血红蛋白含量都随磷浓度增加而增加。该结果表明,在保证大豆形成一定数目的根瘤后,缺磷会明显影响根瘤生长和固氮能力。     

Nitrogen Fixation and Nitrate Assimilation of Determinate, Semi-determinate and Undeterminate Soybeans (Glycine max L.)

Soybean ( Glycine max L.) nitrogen nutrition is ensured by both symbiotic nitrogen fixation and mineral nitrogen assimilation. The relationship between these two modes of N nutrition was analysed in 3 growth types (determinate, semi-determinate and undeterminate) of soybean. The nitrate reductase activity and nitrogenase activity (acetylene reduction) of plants grown in the field and greenhouse showed that these enzymatic activity acted simultaneously or successively during the growth cycle, depending on the availability of inorganic nitrogen in the growing medium. Undeterminate soybean types had a higher potential nitrate reductase activities than determinate types.
The proportion of N₂ fixed as measured by ¹⁵N labelling or stem ureide content indicated that determinate soybeans derived a higher proportion of their N from N₂ fixation than the undeterminates.     

利用功能标记揭示新疆小麦改良品种与地方品种的遗传变异

揭示新疆小麦改良品种与地方品种在主要农艺性状相关基因上的遗传变异对进一步改良和利用新疆育成品种具有重要意义。本研究利用52个功能标记对136份新疆小麦改良品种和地方品种分析发现, 与适应性相关的矮秆等位变异Rht-B1b和Rht-D1b、半冬性生长习性相关等位变异Vrn-D1b、T1BL·1RS易位系, 与品质相关的高脂肪氧化酶活性等位变异TaLox-B1a、低多酚氧化酶活性等位变异Ppo-D1a、低黄色素含量等位变异Psy-A1b以及与高粒重等位变异Hap-H (TaSus-2B)仅分布在改良品种中, 而且光周期不敏感等位变异Ppd-D1a (77.6%)、优质麦谷蛋白亚基Dx5+Dy10 (35.4%)和硬质等位变异Pin-D1b (25.0%), 以及高千粒重等位变异TaCwi-A1a (63.3%)、Hap-4A-T (Tacwi-4A) (33.8%)、Hap-5D-C (TaCWI-5D) (93.7%)、Hap-2 (TaGS1a) (77.9%)、TaGS-D1a (78.5%)、TaGS5-A1b (50.0%)和TaTGW6-A1a (92.1%)在改良品种中分布频率明显高于地方品种。大部分优异等位变异分布频率随着育种时期的推进呈现不连续性上升趋势。在适应性与品质相关基因方面, 春性改良品种的优异等位变异频率高于冬性改良品种。功能标记分析显示改良品种的遗传多样性高于地方品种。136份新疆小麦资源被聚为改良品种和地方品种两类, 改良品种被进一步聚为冬性和春性两类, 说明新疆改良品种与地方品种间存在明显的遗传差异。本研究鉴定的优异等位基因和等位基因组合为进一步改良新疆小麦品种提供了重要信息。     

利用酵母双杂交系统筛选大豆结瘤因子受体NFR1α的互作蛋白

大豆是重要的植物蛋白作物和粮豆间作作物,挖掘大豆的生物固氮潜力,对推动生态农业的可持续发展具有深远意义。大豆结瘤因子受体蛋白GmNFR1?(Nod Factor Receptor)对结瘤至关重要,但其具体调控机制尚不明确。本研究以大豆mRNA为模板,利用RT-PCR方法扩增到GmNFR1α蛋白的激酶结构域(GmNFR1α-pk),构建了pGBKT7-GmNFR1α-pk诱饵表达载体,通过酵母双杂交技术,筛选大豆根瘤AD-cDNA文库,从文库中分离到与GmNFR1α-pk相互作用的71个阳性克隆,经测序和同源性分析筛选到12种与GmNFR1α-pk互作的蛋白,包括钙离子结合手性蛋白、豆血红蛋白、结瘤素Nod44等蛋白。以大豆豆血红蛋白GmLbc2为例,回转酵母以及烟草体内BiFC验证其与诱饵蛋白的相互作用,对其进行同源蛋白比对及系统进化树分析,并利用百脉根毛根转化技术鉴定GmLbc2在结瘤过程中的生物学功能。研究结果进一步补充和完善了GmNFR1α介导的结瘤信号传递途径,为大豆与根瘤菌共生互作机制提供了新的分子证据。     

DEP1与NRT1.1B基因的遗传互作对水稻氮素利用的影响

提高氮素利用效率一直是水稻遗传改良攻关的重点方向。直立穗等位基因dep1及籼稻等位基因nrt1.1b均有利于提高水稻氮素利用效率,因此,阐明DEP1与NRT1.1B基因的互作关系对水稻氮素利用的影响对培育氮高效水稻品种具有重要指导意义。以携带不同DEP1与NRT1.1B基因型组合的重组自交系为供试材料,在低、中及高氮条件下（分别记为LN、MN和HN）,分析了DEP1与NRT1.1B基因间不同的遗传互作方式对水稻氮素利用、产量及其构成因素的影响。结果表明,不同氮素条件下,基因型组合dep1/nrt1.1b具有最大的氮素收获指数;LN条件下,nrt1.1b基因有利于提高氮素利用效率,在MN和HN条件下dep1基因有利于提高氮素利用效率;携带dep1基因株系有效穗数和穗粒数显著提升,其产量均值显著高于其他株系,而NRT1.1B基因对产量无显著影响。     

Mutations affecting nodulation in grain legumes and their potential in sustainable cropping systems

Many spontaneous and a large number of induced mutants that show altered nodulation pattern have been isolated in pea, soybean, common bean, faba bean, chickpea, groundnut and pigeonpea. Available information on nodulation mutants in these crops is summarised. The importance of nodulation mutants in basic studies on plant-microbe symbiotic interactions, nitrogen fixation and breeding of cultivars with higher yield and nitrogen fixation rate are examined. The nodulation mutants, after inoculation with specific bacterial strains or a number of different strains, show either: no nodulation (nod-), few nodules (nod+/-), ineffective nodulation (fix-), hyper nodulation (nod++) or hypernodulation even in the presence of otherwise inhibitory nitrate levels (nts). No spontaneous hypernodulation or nts mutants have been found, all have been induced in independent experiments using different cultivars of pea, soybean and common bean after mutagenising seeds. Most nodulation mutants show monogenic recessive inheritance, though semi-dominant and dominant inheritance is also reported. Nodule number is controlled by a process known as autoregulation; hypernodulating mutants show relaxed autoregulation. By grafting shoots of hypernodulating soybean mutant on normal nodulating soybean, mungbean and hyacinth bean, presence of a common, translocatable signal has been shown. Nodulation mutants have contributed to the understanding of the genetic regulation of host-symbiont interactions, nodule development and N fixation. Initially, the hypernodulating mutants were found to be poor in yield. Using the induced hypernodulating mutant, a new soybean cultivar ‘Nitrobean 60’, has been released in Australia. This cultivar is reported to have given 15% higher yield over cv. ‘Bragg,’ and contributed a higher amount of fixed N to the following cereal crop in rotation. Prospects of using the nodulation mutants in developing grain legume cultivars that combine high yield with high residual N, within the bioenergetic constraints, for developing sustainable cropping systems are examined. This revised version was published online in August 2006 with corrections to the Cover Date.     

棉花中GhTFL1a和GhTFL1c基因的表达及启动子分析

从陆地棉中克隆了磷脂酰乙醇胺结合蛋白GhTFL1a和GhTFL1c基因,并对该基因进行表达分析、启动子预测和启动子活性研究。利用启动子分析软件PlantCARE预测得出,GhTFL1a启动子区域有脱落酸响应元件、干旱诱导的MYB结合位点和顶芽特异表达响应元件等;GhTFL1c启动子区域有乙烯响应元件、干旱诱导的MYB结合位点和水杨酸响应元件。因此,将pGhTFL1a和pGhTFL1c分别构建到启动子检测载体pBI121-GUS上形成融合表达载体,通过烟草瞬时转化检测得出这2个基因的启动子都具有活性。实时荧光定量PCR分析表明, GhTFL1a和GhTFL1c在光周期处理和不同材料的陆地棉(栽培种和半野生种)中表达模式呈相反趋势。GhTFL1a基因受脱落酸(abscisic acid, ABA)、水杨酸(salicylic acid, SA)和盐胁迫诱导,而GhTFL1c可以响应赤霉素(gibberellin, GA)、SA和ABA胁迫。研究结果初步表明,GhTFL1a和GhTFL1c可能参与了植物逆境胁迫脱落酸和水杨酸响应的调控,为在棉花中进一步阐明其功能奠定了基础。     

费尔干猪毛菜病程相关蛋白SfPR1a基因的异源表达增强了烟草对干旱、盐及叶斑病的抗性

为明确一年生草本盐生植物费尔干猪毛菜(Salsola ferganica Drob.)病程相关蛋白基因SfPR1a (GenBank登录号为JQ670917)是否参与了植物对逆境胁迫的响应,采用qRT-PCR检测了该基因在不同组织部位和脱落酸(ABA)、茉莉酸(JAs)、乙烯合成直接前体(ACC)等相关激素胁迫及NaCl处理下的表达规律,同时对转基因烟草在盐、旱及丁香假单胞菌等胁迫下的抗性进行了鉴定。结果显示, SfPR1a基因在费尔干猪毛菜根中的表达量显著高于茎叶中,且受到ABA、JAs、ACC、NaCl的积极诱导;干旱胁迫下,转基因烟草的丙二醛(MDA)含量显著低于野生型烟草,显示出较强的抗旱表型;盐胁迫下,异源表达SfPR1a的转基因烟草幼苗生长显著优于野生型烟草;丁香假单胞菌攻毒后的转基因烟草叶片呈现严重的坏死反应,但植株的整体抗性表型显著优于野生型烟草;亚细胞定位结果显示该蛋白定位于植物细胞质外体空间。以上结果表明,费尔干猪毛菜病程相关蛋白SfPR1a基因参与了植物对非生物及生物胁迫的抗性。     

根瘤菌的分类、鉴定及应用技术研究现状

豆科植物(legumines)作为重要的粮食及经济作物,一直以来被广受重视。根瘤菌(Rhizbium)是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性杆菌,可与豆科植物形成共生固氮体系,不仅可以提高植物的产量而且对周边生态环境无影响。根瘤菌与豆科植物的共生体系是生物固氮效率最高的,占生物固氮总量的65%以上。深入研究这种共生固氮体系对中国农业的可持续发展具有重要意义。近年来,越来越多的学者参与到根瘤菌的分类、鉴定以及应用技术的研究。本文主要从根瘤菌的分类、形态水平、生理生化水平、细胞组分、核酸分子水平的鉴定和根瘤菌的应用等方面进行了综述,为根瘤菌的实际应用提供参考依据。     

R2R3-MYB转录因子GmMYB184调节大豆异黄酮合成

异黄酮是一类主要含在豆科植物中的次生代谢物, 在植物防御体系中发挥重要作用, 并与人类健康密切相关。大豆异黄酮含量受多基因和复杂代谢网络控制, 调控代谢途径上的结构基因不能显著改变大豆异黄酮含量, 与异黄酮代谢途径相关的转录因子的鉴定和应用可能会有效解决这个问题。本研究克隆了一个与大豆异黄酮合成相关的R2R3类型MYB转录因子GmMYB184, 并进行了初步的功能验证。亚细胞定位研究结果表明GmMYB184转录因子定位于细胞核。组织表达分析结果表明该转录因子基因与IFS2 (异黄酮合酶2编码基因)的表达模式相同。同时, GmMYB184和IFS2的表达模式与异黄酮的积累模式相似。谷胱甘肽诱导表达分析表明该转录因子基因与IFS2共同被诱导, 说明这两个基因可能参与同一或相似的生物过程。采用双荧光素酶报告系统分析其对异黄酮合成途径关键基因的转录激活活性影响, 发现GmMYB184能够促进IFS2和CHS8启动子表达活性分别提高5倍和7倍。最后, 通过发根农杆菌介导的遗传转化系统, 找到该转录因子在异黄酮合成调控中的直接作用证据。沉默GmMYB184导致大豆毛状根异黄酮含量的显著下降。但是, 过表达GmMYB184不足以显著提高毛状根中异黄酮的含量。总之, 本研究为大豆异黄酮合成分子机制探索及大豆异黄酮品质改良提供了理论依据。