水貂ASIP基因单倍型检测及其皮肤组织mRNA差异表达分析

试验旨在探究鼠灰色(agouti signaling protein,ASIP)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)形成的单倍型及皮肤组织差异表达mRNA对水貂被毛色素沉积的影响。通过PCR扩增、Sanger测序技术对金州黑水貂、红眼白水貂和名威银蓝水貂ASIP基因进行SNPs单倍型检测分析,利用实时荧光定量PCR技术检测3种毛色皮肤组织ASIP基因的表达量,分析单倍型及mRNA差异表达与毛色表型的相关性。结果表明,301个样本中共检测到10个SNPs,内含子2中4个SNPs(G18A、A159G、G235T、C1189T)共形成10种单倍型(Hap1～Hap10),其中Hap1(GAGC)和Hap2(GAGT)是3种不同毛色水貂群体的共享单倍型;部分内含子3中6个SNPs(C252T、A290C、G298C、A340G、T343C、T379C)形成4种单倍型(Hap1～Hap4),且Hap2(CCCGCC)是名威银蓝水貂群体的主体单倍型。5个位点(A290C、G298C、A340G、T343C、T379C)均处于完全连锁不平衡状态。实时荧光定量PCR检测显示,金州黑水貂和名威银蓝水貂ASIP基因mRNA表达量分别是红眼白水貂的1.25和0.95倍,三者间差异不显著(P0.05)。研究结果初步提示,ASIP基因调控水貂不同毛色表型形成的分子机制可能存在差异。     

水貂酪氨酸酶(TYR)基因克隆、SNPs筛查及其皮肤组织mRNA差异表达分析

旨在克隆和分析水貂酪氨酸酶（tyrosinase,TYR）基因编码区,揭示该基因编码区SNPs及其皮肤组织mRNA差异表达规律与水貂毛色表型的关系。本研究采集7月龄雄性金州黑水貂、名威银蓝水貂和红眼白水貂共计301个样本的血液,利用聚合酶链式反应（PCR）方法对水貂TYR基因5个外显子进行分段克隆,并拼接获得其完整编码区序列（coding sequence,CDS）;采用PCR产物直接测序技术筛查3种毛色水貂外显子1、4和5中的SNPs;采集9只7月龄雄性水貂（黑、灰与白色被毛各3只）背中部皮肤组织,通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）技术检测TYR基因mRNA在3种毛色水貂皮肤组织中的表达水平。结果表明,克隆的水貂TYR基因序列长2 391 bp,由5个外显子组成,编码区长1 596 bp,编码的531个氨基酸中包括信号肽（18个氨基酸）和成熟肽（513个氨基酸）,该序列已上传GenBank（KJ716783）。SNPs筛查发现,3种毛色水貂TYR基因外显子4和5不存在突变位点,外显子1发现2处变异：c.441G>A和c.138T>A,c.441G>A为同义突变且仅存在于金州黑水貂群体。qRT-PCR分析显示,TYR基因mRNA在3种毛色水貂皮肤组织中均表达,且在金州黑水貂中的表达极显著高于银蓝水貂和红眼白水貂（P<0.01）,在银蓝水貂中的表达显著高于红眼白水貂（P<0.05）。研究结果提示,TYR基因c.138T>A位点及其皮肤组织mRNA差异表达水平与水貂毛色显著关联。     

水貂酪氨酸酶(TYR)基因克隆、SNPs筛查及其皮肤组织mRNA差异表达分析

旨在克隆和分析水貂酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因编码区,揭示该基因编码区SNPs及其皮肤组织mRNA差异表达规律与水貂毛色表型的关系。本研究采集7月龄雄性金州黑水貂、名威银蓝水貂和红眼白水貂共计301个样本的血液,利用聚合酶链式反应(PCR)方法对水貂TYR基因5个外显子进行分段克隆,并拼接获得其完整编码区序列(coding sequence,CDS);采用PCR产物直接测序技术筛查3种毛色水貂外显子1、4和5中的SNPs;采集9只7月龄雄性水貂(黑、灰与白色被毛各3只)背中部皮肤组织,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术检测TYR基因mRNA在3种毛色水貂皮肤组织中的表达水平。结果表明,克隆的水貂TYR基因序列长2 391 bp,由5个外显子组成,编码区长1 596 bp,编码的531个氨基酸中包括信号肽(18个氨基酸)和成熟肽(513个氨基酸),该序列已上传GenBank(KJ716783)。SNPs筛查发现,3种毛色水貂TYR基因外显子4和5不存在突变位点,外显子1发现2处变异:c.441GA和c.138TA,c.441GA为同义突变且仅存在于金州黑水貂群体。qRT-PCR分析显示,TYR基因mRNA在3种毛色水貂皮肤组织中均表达,且在金州黑水貂中的表达极显著高于银蓝水貂和红眼白水貂(P0.01),在银蓝水貂中的表达显著高于红眼白水貂(P0.05)。研究结果提示,TYR基因c.138TA位点及其皮肤组织mRNA差异表达水平与水貂毛色显著关联。     

水貂TYR基因T138A位点多态性及其与毛色性状的关联分析

试验旨在检测水貂酪氨酸酶（tyrosinase,TYR）基因T138A位点的多态性,并分析其与水貂毛色表型的相关性。提取5种被毛色型430只水貂血液基因组DNA,采用PCR-RFLP技术,对TYR基因T138A位点进行多态性检测,统计等位基因频率与基因型频率,通过卡方（χ²）独立性检验分析该位点多态性与水貂毛色性状的相关性。结果表明,T138A位点存在2个等位基因T和A,形成TT、TA和AA 3种基因型,AA基因型在吉林白水貂群体中为优势基因型（0.9069）,而TT基因型为金州黑水貂、珍珠水貂、咖啡水貂和银蓝水貂群体的优势基因型,其中在金州黑水貂群体中基因型频率最高（1.0000）。关联分析表明,TYR基因T138A位点的多态性与毛色性状呈极显著相关（P<0.0001）。表明TYR基因T138A位点可能是影响水貂毛色的主控位点或与调控白色被毛表型主控位点连锁的分子标记。     

牦牛EPO、PPARα基因SNP与高原低氧适应的相关性分析

试验旨在探究促红细胞生成素基因（EPO）、过氧化物酶体增殖剂激活受体α（PPARα）的遗传多样性,并分析其多态性与牦牛高原低氧适应性的相关性。采集不同海拔高度的6个牦牛类群（中甸牦牛、麦洼牦牛、斯布牦牛、类乌齐牦牛、帕里牦牛、申扎牦牛）以及三江黄牛共375头耳样,提取DNA并分别构建DNA池,采用直接测序法结合PCR-RFLP检测分析EPO、PPARα基因的多态性,最后应用SHEsis软件统计分析候选基因SNPs与牦牛高原适应性的相关性。结果表明,EPO基因存在3个SNPs位点：rs527G→A、rs1031A→T、rs1192T→C;PPARα基因存在3个SNPs位点：rs77363C→T、rs77471C→A和rs77534C→T。χ²适合性检验结果显示,EPO基因3个SNPs位点均符合Hardy-Weinberg平衡状态;PPARα基因的rs77363C→T位点上,6个牦牛类群都处于平衡状态（P>0.05）,在PPARα基因的rs77471C→A和rs77534C→T位点,麦洼牦牛偏离Hardy-Weinberg平衡（P<0.05）。单倍型分析得出,EPO基因的ATC单倍型在高海拔地区牦牛中的分布频率随海拔升高而升高;PPARα基因的TAC单倍型在6个牦牛类群中分布频率显著高于其他单倍型。研究表明,EPO、PPARα基因可作为牦牛适应高原环境的分子标记,为进一步探讨牦牛高原低氧适应性机制提供一定理论帮助。     

晋汾白猪ApoA5基因单倍型与体重和肉质性状的相关性分析

试验旨在探究晋汾白猪载脂蛋白A5（apolipoprotein A5,ApoA5）基因的单倍型与体重和肉质性状的相关性。选取180头晋汾白猪为研究群体,利用PCR技术检测ApoA5基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）,并采用Haploview软件分析这些SNP位点的连锁不平衡程度;筛选非完全连锁的SNP位点,构建不同的ApoA5基因单倍型,统计不同单倍型的基因频率,并通过SPSS软件分析不同ApoA5基因单倍型与晋汾白猪体重和肉质性状的相关性,鉴定优良性状的ApoA5基因单倍型。结果显示,晋汾白猪ApoA5基因共检测到21个SNPs位点,其中5个完全连锁单倍型块,分别包含5、2、3、4和2个SNPs位点;另外10个非完全连锁的标签SNP组合成不同的ApoA5基因单倍型,其中Hap 1的基因频率最高,达到46.7%,远高于其他单倍型;ApoA5基因单倍型与晋汾白猪的初生重、断奶重、6月龄体重、肌内脂肪含量、剪切力和滴水损失均具有明显的相关性,而与pH_{24 h}没有明显的相关性;ApoA5基因Hap 11晋汾白猪的初生重、断奶重、6月龄体重和肌内脂肪含量均最高,且剪切力最低,滴水损失也相对较低;Hap 6的初生重最低;Hap 2的断奶重和6月龄体重均最低;Hap 3的肌内脂肪含量最低,剪切力最高;Hap 10的滴水损失最高。晋汾白猪ApoA5基因Hap 11属于优良性状单倍型,是一个具有优良性状的分子标记,可以用于晋汾白猪的分子育种,提高选种效率。     

玉树马和德保矮马SLC36A1基因多态性研究

 控制马香槟毛色的CH（Champagne gene）基因家族包含4个候选基因（SLC36A1、SLC36A2、SLC36A3、SPARC）,研究发现SLC36A1基因外显子2的突变是造成马香槟毛色的关键位点。为揭示中国马SLC36A1基因遗传多态性,本研究以玉树马和德保矮马共74个样本为研究对象,以马DNA池为模板扩增SLC36A1基因的10个外显子及部分内含子序列并进行测序分析。共发现马SLC36A1基因5个SNPs,分别位于内含子3（g.26699953 A>G, g.26699851 G>C, g.26699850 G>C）,外显子4（g.26699562 G>A）及外显子6（g.26697018 C>T）。利用PCR RFLP方法对74个家马样本进行基因分型,发现外显子6的SNP有基因型CC、CT;外显子4的SNP有基因型GG、GA;内含子3的g.26699850 G>C突变有基因型GG、GC;内含子3的另外2个SNPs（g.26699953 A>G, g.26699851 G>C）通过测序,发现有AA、AG、GG与GG、GC、CC基因型。所有5个马SNPs均为野生型占主要优势。由此界定了马SLC36A1基因有9种单倍型（H1 H9）,其中H5是最主要的单倍型。德保矮马遗传多样度为0.4190,比玉树马（0.2228）高,表明德保矮马香槟毛色遗传多态性比玉树马更丰富。玉树马与德保矮马的平均单倍型多样度为0.3160,表明其香槟毛色遗传多态性相对较低。     

红眼白水貂FSHβ和NCOA1基因多态性及其与繁殖性状的相关分析

本研究旨在检测红眼白水貂促卵泡激素β（follicle-stimulating hormone beta subunit,FSHβ）和核受体辅激活蛋白1（nuclear receptor coactivator 1,NCOA1）基因多态性与繁殖性状的关系。采用单链构象多态性（SSCP）和DNA测序相结合的方法检测了红眼白水貂215个个体的单核苷酸多态性,针对红眼白水貂群体的特点建立合适的统计分析模型,利用SAS 9.4统计软件对候选基因进行多态性分析,并采用最小二乘法分析了总产仔数和产活仔数的遗传效应。结果表明,在红眼白水貂FSHβ基因上存在2个多态位点,分别为内含子1处的g.1228G > A突变和外显子2处的g.1866T > C突变;在NCOA1基因上存在1个多态位点,为第6外显子处g.151536T > C突变。在红眼白水貂群体中,FSHβ基因的优势基因为B等位基因,NCOA1基因的优势基因为A等位基因;FSHβ基因g.1228G > A位点的AA和AB基因型个体在总产仔数、产活仔数上均极显著高于BB基因型（P < 0.01）,g.1866T > C位点在总产仔数和产活仔数上呈现BB > AB > AA的趋势;NCOA1基因的AB基因型个体的总产仔数和产活仔数均极显著高于AA基因型（P < 0.01）;g.151536T > C与g.1228G > A的合并基因型对繁殖性状有显著影响（P < 0.05）。因此,可以利用以上突变位点对红眼白水貂的繁殖性状进行标记辅助选择研究。     

水牛MFSD2A基因多态性及其与产奶性状的关联分析

【目的】研究水牛主要促进因子超家族成员2a(major facilitator superfamily domain containing 2a,MFSD2A)基因多态性,并筛选与水牛产奶性状相关联的SNP。【方法】采集383头健康水牛血液DNA,利用PCR扩增和Sequenom MassARRAY飞行时间质谱技术对SNP位点进行筛选及基因型检测,并进行遗传多样性、连锁不平衡(LD)和单倍型分析,以及对不同基因型和单倍型与水牛产奶性状进行关联分析。【结果】在水牛MFSD2A基因中检出7个SNPs位点,多态信息含量(PIC)均在0.25~0.40之间,属于中度多态,除g.8290 T＞C位点外,其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05);关联分析结果表明,这7个SNPs位点与305 d产奶量均显著关联(P＜0.05),且突变杂合子基因型的305 d产奶量是3种基因型中最低的,g.568 C＞G和g.701 A＞G位点与乳脂率显著关联(P＜0.05),乳脂率从大到小依次为突变纯合子＞野生纯合子＞突变杂合子,g.568 C＞G、g.3326 G＞A、g.8290 T＞C和g.8523 C＞G位点与乳蛋白率显著关联(P＜0.05),7个SNPs位点与乳尿素氮关联均不显著(P＞0.05);连锁不平衡和单倍型分析结果明,g.568 C＞G、g.701 A＞G和g.3203 T＞G位点可组成一个单倍型模块(Block 1),g.8523 C＞G和g.9138 G＞T位点可组成另一个单倍型模块(Block 2)。其中g.568 C＞G和g.701 A＞G、g.568 C＞G和g.3326 G＞A、g.8523 C＞G和g.9138 G＞T位点的r²分别为0.87、0.37和0.48,处于强连锁不平衡状态。Block 1中的H1(CAG)单倍型乳蛋白率显著高于H2(CAT)和H3(GCT)(P＜0.05),Block 2中的D3(GG)单倍型305 d产奶量极显著高于D1(CG)和D2(CT)(P＜0.01)。【结论】筛选出的MFSD2A基因7个SNPs位点与305 d产奶量均显著关联,g.568 C＞G和g.701 A＞G位点与乳脂率显著关联,g.568 C＞G、g.701 A＞G、g.3326 G＞A、g.8290 T＞C和g.8523 C＞G位点与乳蛋白率显著关联,这7个SNPs位点与乳尿素氮均无显著关联。纯合子的基因型在高305 d产奶量和乳脂率的选择上更有优势,H1(CAG)和D3(GG)单倍型是提高水牛305 d产奶量和乳蛋白率的有利单倍型。     

水貂酪氨酸酶基因外显子1的鉴定及序列变异分析

根据GenBank中公布的雪貂(登录号:EF405957)、大熊猫(登录号:XM_002930310)、家犬(登录号:CFU42219)及猫(登录号:AY959314)的酪氨酸酶(tyrosinase, TYR)基因DNA序列保守区域,设计1对特异性引物,利用PCR及克隆技术测定了短毛黑水貂、红眼白水貂和米黄色水貂的TYR基因外显子1部分序列,并对该序列进行了BLAST鉴定及变异位点分析,基于该基因编码氨基酸序列构建了16个物种的系统进化树。结果表明,测定的3种毛色水貂TYR基因序列长度均为796 bp,包括795 bp的外显子1和1 bp 5'UTR,共检测到5个单一突变位点:g.A34G、g.T138A、g.T248C、g.A545G和g.C765A,包含4个错义突变:g.A34G(p.Ser12Gly)、g.T248C(p.Val83Ala)、g.A545G(p.Tyr182Cys)和g.C765A(p.His255Gln),1个移码突变分别出现在短毛黑水貂和红眼白水貂个体间:g.T138A(p.Cys46*),获得TYR基因GenBank登录号分别为:短毛黑水貂(KJ198847)、红眼白水貂(KJ658343)和米黄色水貂(KJ152769)。水貂与雪貂、大熊猫、家犬、猫、家兔、猪、羊驼、山羊、绵羊、牛、人、猕猴、黑猩猩、原鸡和日本鹌鹑的TYR基因核苷酸序列同源性为72.8%～98.6%,相应氨基酸序列同源性为75.0%～98.1%。TYR基因分子进化树显示水貂与雪貂遗传关系最近,分化时间约为1000万年前,且与原鸡和日本鹌鹑亲缘关系最远。该结果为进一步开展TYR基因多态性与水貂毛色表型的相关性研究奠定了生物信息学基础。     

Single-nucleotide polymorphism identification in the caprine myostatin gene

Polymerase chain reaction (PCR) products of MSTN gene amplified from 35 goats representing 17 Chinese indigenous goat breeds and five imported goat breeds were sequenced to identify the single‐nucleotide polymorphisms (SNPs) of a 379‐bp fragment including part of intron 2 and exon 3 of MSTN gene. A total of eight SNPs (A1980G, G1981C, A1982G, G1984T, A2121G, T2124C, G2174A and A2246G) were identified among the sequenced goats. The SNPs found are all located in intron 2 except for A2246G, which was a synonymous mutation in exon 3. Four haplotypes were sorted from these eight SNPs, of which, haplotype I (AGAGATGA) and haplotype II (GCGTGTAA) are the two main haplotypes with the frequency of 77.8% and 14.8% respectively. The SNPs found at positions 1980, 1981, 1982, 1984 and 2121 might be linked to inheritance completely.     

Correlation Analysis Between Haplotypes of ApoA5 Gene on Body Weight and Meat Quality in Jinfen White Pigs

This study was aimed to explore the correlation between the haplotypes of apolipoprotein A5 (ApoA5) gene and body weight,meat quality in Jinfen White pigs.180 Jinfen White pigs were selected,PCR was used to detect the single nucleotide polymorphism (SNP) of ApoA5 gene,and the linkage of these SNPs was analyzed by Haploview software.Non-fully linked SNPs were screened to form the haplotypes of ApoA5 gene,and the frequency of different haplotypes of ApoA5 gene were calculated.The correlation between the haplotypes of ApoA5 gene and body weight,meat quality was analyzed by SPSS software to identify the haplotypes of ApoA5 gene with excellent traits.The results showed that ApoA5 gene of Jinfen White pigs contained 21 SNPs and 5 completely linked regions which included 5,2,3,4 and 2 SNPs,respectively.Ten non-completely linked tag SNPs were selected to form the haplotypes of ApoA5 gene,Hap 1 had the highest gene frequency (46.7%).The haplotypes of ApoA5 gene had a significant correlation with the birth weight,weaning weight,6-month-old body weight,intramuscular fat content,shear force and drip loss,but no significant correlation with pH_{24 h} in Jinfen White pigs.Hap 11 of ApoA5 gene in Jinfen White pigs had the highest birth weight,weaning weight,6-month-old body weight and intramuscular fat content,the lowest shear force,and the lower drip loss.Hap 6 had the lowest birth weight.Hap 2 had the lowest weaning and 6-month-old weight.Hap 3 had the lowest intramuscular fat content and the highest shear force.Hap 10 had the highest drip loss.Hap 11 of ApoA5 gene in Jinfen White pigs had excellent traits,which could be used as a molecular marker to use in molecular breeding of Jinfen White pigs and improve the breeding efficiency.     

Relationship Analysis Between the Polymorphism of T138A Locus in TYR Gene and Hair Color in Mink (Neovison vison)

In order to detect the polymorphism of T138A locus in tyrosinase (TYR) gene in mink and analyze the relationship between the genetic polymorphisms and phenotypes of mink hair color, the blood samples of 430 minks with five kinds of different hair color were taken and their genomic DNA were extracted. The T138A locus of TYR gene in mink was detected using PCR-RFLP method. Allele frequency and genotype frequency were calculated. Furthermore, the relationship between the polymorphism of T138A locus and hair color trait were analyzed by the statistical method of Chi-square independence test. The results showed that the T138A locus polymorphism was found with two alleles T and A,and three genotypes of TT, TA and AA. AA genotype was dominant genotype in Jilin White mink (0.9069), TT genotype was dominant genotype in Jinzhou Black mink,Pearl mink,Coffee mink and Silverblue mink, and existed mainly in Jizhou Black mink (1.0000). The association analysis of T138A locus polymorphism with hair color trait indicated that there was extremely significant correlation between TYR gene polymorphism and hair color of mink (P < 0.0001). This results indicated that the T138A locus might affect hair color phenotype, or molecular marker linked with the major gene regulating the white hair phenotype of mink.     

藏羊BMPRⅡ基因多态性及其单倍型与产羔性状相关分析

【目的】 研究骨形态发生蛋白受体Ⅱ(bone morphogenetic protein receptor Ⅱ, BMPRⅡ)基因多态性及其单倍型与藏羊产羔性状的相关性。【方法】 以433只藏羊母羊为研究对象, 采用改良多重高温连接酶检测反应技术(improved multiple ligase detection reaction, iMLDR)对BMPRⅡ基因9个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点在藏羊群体中的多态性进行检测, 使用Haploview 4.2软件分析其连锁不平衡性并构建单倍型, 应用基因关联分析探究BMPRⅡ基因多态性及单倍型与藏羊产羔性状的关联。【结果】 藏羊BMPRⅡ基因外显子12中存在6个SNPs, 分别为: g.90192 T>C、g.142532 C>T、g.142614 A>G、g.142751 T>C、g.143138 A>G和g.143189 G>A, 外显子3、9和13中各存在1个SNP, 分别为: g.143570 C>G、g.124843 A>C和g.145233 A>G, 这9个SNPs均为同义突变。9个SNPs中, 除g.90192 T>C外, 均存在3种基因型。多态信息含量分析显示, 群体在g.90192 T>C、g.142614 A>G和g.145233 A>G位点处于低度多态(PIC<0.25), 在g.124843 A>C、g.142532 C>T、g.142751 T>C、g.143138 A>G、g.143189 G>A和g.143570 C>G位点均处于中度多态(0.25<PIC<0.5)。χ²适合性检验结果显示, 所有突变位点均未偏离哈代-温伯格平衡状态。相关性分析显示, 不同位点不同基因型与藏羊产羔性状均无显著相关(P>0.05), 但g.142532 C>T位点CT基因型平均产羔数高于CC和TT基因型, g.142751 T>C位点CC基因型平均产羔数高于TT和TC基因型, g.143189 G>A位点GA基因型平均产羔数高于GG和AA基因型, g.143570 C>G位点CG基因型平均产羔数高于CC和GG基因型, g.145233 A>G位点GG基因型平均产羔数高于AA和AG基因型, 差异均不显著(P>0.05)。BMPRⅡ基因中除g.90192 T>C位点外的8个SNPs位点在藏羊群体中共形成14种单倍型(H1~H14), 单倍型与藏羊产羔数间均无显著相关(P>0.05)。【结论】 BMPRⅡ基因g.142532 C>T、g.142751 T>C、g.143189 G>A、g.143570 C>G和g.145233 A>G位点对藏羊产羔数有一定潜在的影响。