转PeDREB2a和KcERF基因紫花苜蓿的表型及抗旱耐盐性

以紫花苜蓿(Medicago sativa)‘中苜1号’为受体材料，通过根癌农杆菌介导法将抗旱基因PeDREB2a、KcERF转入‘中苜1号’，获得转基因抗性苗66株，基因组PCR检测阳性率为93.94%,RT-PCR检测表明目的基因在转录水平上能够稳定表达；利用Taqman PCR方法检测目的基因的拷贝数，结果表明PeDREB2a、KcERF基因在转基因株系Z6、Z7、Z9中均为单拷贝。在正常生长条件下，转基因株系Z6和Z7株高、分枝数、叶片吲哚乙酸含量、纤维素含量均显著高于野生型，而叶片乙烯含量显著低于野生型(P<0.05)。用20%PEG-3350和250 mmol·L^-1 NaCl胁迫处理进行表型观测和抗逆生理指标检测，表明转基因株系与野生型相比抗旱、耐盐能力明显增强。本研究为进一步培育抗逆优质高产苜蓿新品种提供了新种质。     

水稻金属硫蛋白基因(rgMT)遗传转化的紫花苜蓿耐盐性分析

采用根癌农杆菌介导法将从水稻(Oryza sativa)中克隆出的一个金属硫蛋白基因(rgMT)转化到紫花苜蓿(Medicago sativa)品种"农菁1号"中,经PCR和Northern blot技术对获得的抗性植株进行了检测,证明rgMT基因已整合到苜蓿基因组中并在转基因植株中转录表达。以野生型苜蓿为对照,对获得的转基因苜蓿株系在不同浓度NaCl、NaHCO3胁迫下的表型和生理指标测定发现,NaCl、NaHCO3胁迫处理后,野生型苜蓿受胁迫严重甚至死亡,转基因苜蓿受胁迫较轻。转基因苜蓿的脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性显著高于野生型(P0.05),细胞膜透性显著低于野生型,野生型苜蓿叶片中积累的过氧化氢高于转基因苜蓿的叶片中积累的过氧化氢。研究结果表明,rgMT基因已在苜蓿中表达,并且提高了转基因苜蓿的耐盐性。     

紫花苜蓿MsWRKY11基因的克隆及其耐盐功能分析

本研究从紫花苜蓿cDNA中克隆到一个MsWRKY11基因,进化分析表明MsWRKY11与蒺藜苜蓿WRKY11亲缘关系最近.MsWRKY11受NaCl、水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)的诱导表达.将PHB-MsWRKY11-Flag表达载体转入紫花苜蓿获得超表达紫花苜蓿.250 mmol·L-1 NaCl处理下,转基因株系的株高和地上生物量,以及过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性和K+/Na+均明显高于野生型,而Na+含量、电导率、丙二醛(MDA)含量和超氧阴离子含量均显著低于野生型.进一步分析发现盐胁迫下耐盐性相关的关键基因MsNHX1、MsSOS3、MsAPX、MsGRX、MsNAC和MsP5CS的表达量受到强烈诱导,转基因紫花苜蓿叶片中6个基因的表达量高于野生型.上述结果表明,MsWRKY11通过调节细胞K+/Na+内稳态和保护过氧化物酶活性,从而降低Na+对细胞膜结构的破坏,提高紫花苜蓿的耐盐能力.     

紫花苜蓿MsZAT10基因的克隆及其在烟草中的功能验证

C2H2型锌指蛋白ZAT10在植物应对外界非生物胁迫中具有重要的作用。克隆得到紫花苜蓿C2H2型锌指蛋白MsZAT10基因。该基因开放阅读框全长762 bp,编码253个氨基酸。ZAT10蛋白含有2个单C2H2型保守结构域,有典型的QALGGH保守基序,属于C2H2型锌指蛋白。氨基酸序列比对和进化树分析表明,紫花苜蓿MsZAT10与蒺藜苜蓿MtZAT10亲缘关系最近,其氨基酸的相似性为76%。构建植物表达载体pCBM-MsZAT10,通过农杆菌介导法转化到烟草,经过草丁膦(PPT)抗性筛选和聚合酶链式反应(PCR)鉴定,获得25株阳性植株。荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表明,MsZAT10基因在转基因株系中得到表达。选取3个转基因株系进行抗逆性分析,在-4 ℃条件下处理2 h,转MsZAT10基因烟草叶片的萎蔫程度和相对电导率均低于野生型烟草。在0 ℃条件下处理5 h,转MsZAT10基因烟草与野生型烟草相比积累更多的脯氨酸和可溶性蛋白,但丙二醛(MDA)含量要低于野生型烟草。另外,在300 mmol·L^-1 NaCl溶液中处理4 d,转MsZAT10基因烟草的打孔叶圆片仍保持绿色而野生型烟草明显失绿。以上结果表明MsZAT10基因在提高烟草对低温和盐胁迫的抗性方面具有重要的作用。     

AtSOS基因在紫花苜蓿中的表达及其耐盐性研究

本研究采用基因工程技术改良紫花苜蓿耐盐性,通过种植转基因耐盐紫花苜蓿达到改良土壤的目的。以紫花苜蓿子叶节为外植体,通过农杆菌介导法将来源于拟南芥的AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3多基因表达载体导入阿尔冈金紫花苜蓿中,经PCR检测、抗除草剂筛选和RT-PCR鉴定,获得了能稳定表达的转基因株系。以转基因的紫花苜蓿和野生型紫花苜蓿为材料进行盐处理,每个处理重复3次,测定其生理生化指标、株高、Na⁺和K⁺含量、细胞膜透性、叶绿素含量。结果显示,在不同盐浓度处理下,所有植株的株高均有所增长,但在100和200 mmol·L^-1的NaCl处理下,转基因植株的长势显著高于野生型植株;随着处理时间的增加,所有植株的叶绿素含量均呈先上升后下降的趋势,且野生型植株叶绿素含量均低于转基因植株;在100和200 mmol·L^-1的NaCl处理下,转基因植株的细胞膜透性、超氧化物歧化酶活性和脯氨酸含量的增加量均小于野生型植株,而过氧化物酶、过氧化氢酶活性和可溶性糖含量的增加量均大于野生型;各植株中丙二醛含量均下降,且野生型植株下降的更为明显;盐处理后,转基因植株根系中Na⁺的积累比野生型植株少,而K⁺的吸收多于野生型植株。转AtSOS基因的紫花苜蓿通过发挥AtSOS途径的作用,促进了植物体将细胞内的Na⁺外排,从而减轻盐胁迫对植物体的伤害,提高了转基因植株的耐盐性。     

紫花苜蓿MsZAT10基因的克隆及其在烟草中的功能验证

C2H2型锌指蛋白ZAT10在植物应对外界非生物胁迫中具有重要的作用。克隆得到紫花苜蓿C2H2型锌指蛋白MsZAT10基因。该基因开放阅读框全长762 bp,编码253个氨基酸。ZAT10蛋白含有2个单C2H2型保守结构域,有典型的QALGGH保守基序,属于C2H2型锌指蛋白。氨基酸序列比对和进化树分析表明,紫花苜蓿MsZAT10与蒺藜苜蓿MtZAT10亲缘关系最近,其氨基酸的相似性为76%。构建植物表达载体pCBM-MsZAT10,通过农杆菌介导法转化到烟草,经过草丁膦(PPT)抗性筛选和聚合酶链式反应(PCR)鉴定,获得25株阳性植株。荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表明,MsZAT10基因在转基因株系中得到表达。选取3个转基因株系进行抗逆性分析,在-4℃条件下处理2 h,转MsZAT10基因烟草叶片的萎蔫程度和相对电导率均低于野生型烟草。在0℃条件下处理5 h,转MsZAT10基因烟草与野生型烟草相比积累更多的脯氨酸和可溶性蛋白,但丙二醛(MDA)含量要低于野生型烟草。另外,在300 mmol·L~(-1) NaCl溶液中处理4 d,转MsZAT10基因烟草的打孔叶圆片仍保持绿色而野生型烟草明显失绿。以上结果表明MsZAT10基因在提高烟草对低温和盐胁迫的抗性方面具有重要的作用。     

盐胁迫应答基因GmWRKY6的克隆及转基因百脉根的抗盐分析

根据大豆盐胁迫RNA-Seq数据,筛选并克隆得到1个大豆WRKY类转录因子GmWRKY6基因。序列分析表明,该基因含有1 个1674 bp的开放阅读框,编码557 个AA,编码蛋白属于IIb 类WRKY 家族成员,含有1个WRKY 保守结构域和1个C₂H₂锌指结构基序。基因表达模式分析表明,GmWRKY6基因在大豆根中表达量较高,并且该基因受盐胁迫诱导表达。构建GmWRKY6基因的植物超表达载体,获得7株T₀代阳性转GmWRKY6基因百脉根。进一步对T₁代转基因株系进行抗盐分析发现,在200 mmol·L^-1 NaCl 处理14 d后转基因株系生长状态良好,而野生型对照生长矮小,叶片干枯。此外,对相关生理指标的测定发现,转基因株系叶片中脯氨酸和叶绿素含量显著高于野生型对照,而丙二醛含量和相对质膜透性显著低于野生型对照。此外,盐胁迫下转基因百脉根叶片中钠离子含量显著低于对照,而钾离子含量显著高于对照。以上结果表明大豆GmWRKY6基因的超表达能够显著增强百脉根的抗盐能力。     

GsCRCK基因转化农菁1号苜蓿及其耐盐性分析

GsCRCK基因是参与胁迫早期应答的钙/钙调素调控的受体类蛋白激酶基因,研究发现GsCRCK正向调控拟南芥对NaCl和ABA胁迫的耐性,将耐盐蛋白激酶基因GsCRCK转化苜蓿,对于增强苜蓿的耐盐性具有重要的现实意义。本研究采用农杆菌介导法将其转入农菁1号苜蓿,获得大量抗性植株。经 PCR和RT-PCR检测证明GsCRCK基因已整合到农菁1号苜蓿基因组中并在转基因植株中转录表达。对获得的2个转基因株系进行耐盐性分析,在300 mmol/L NaCl条件下进行胁迫处理,测定处理0,3,6,9,12,15 d后的质膜透性、丙二醛(MDA)和叶绿素(Chl)含量,以及胁迫15 d时的SOD活性;并统计400 mmol/L NaCl处理15 d时各株系的死亡率。结果显示,300 mmol/L 高盐胁迫15 d后转基因苜蓿仍能正常生长,而野生型苜蓿则遭受盐害严重;转基因苜蓿的相对电导率极显著低于野生型,MDA含量也显著低于野生型,而Chl含量和SOD活性都显著高于野生型;在400 mmol/L NaCl处理下,2个转基因株系的死亡率分别为13.33%和10.00%,明显低于野生型植株(63.33%)。表明GsCRCK基因的导入提高了转基因苜蓿的耐盐性。     

转 GsGST13/SCMRP 基因双价苜蓿的耐盐性分析简

 本研究是将从野大豆盐碱胁迫基因表达谱中筛选得到的GsGST13 基因和采用生物信息学方法改造的高甲硫氨酸蛋白基因SCMRP 构建成双价植物表达载体,通过农杆菌介导法转化农菁１号苜蓿,获得超量表达的转基因苜蓿,并对其中２个转基因苜蓿株系进行耐盐性分析及氨基酸组分分析。结果显示,转基因苜蓿具有较强的耐盐性,表现为随着盐浓度的升高,野生型苜蓿盐害不断加重,生长发育受抑制,叶片逐渐变黄、卷曲、萎蔫,而转基因苜蓿只受到轻微影响,仍能正常生长。转基因株系的丙二醛含量和过氧化氢含量显著低于非转基因株系（P＜０．０５）,而株高,鲜重,ＧＳＴ 活性和ＳＯＤ 活性显著高于非转基因对照（P ＜０．０５,P ＜０．０１）;同时株系Ｇ１６和Ｇ５０的含硫氨基酸含量分别比野生型植株提高了０．５７％ 和０．５２％。说明超量表达GsGST13 ／SCMRP 基因增强了苜蓿的耐盐性,并提高了含硫氨基酸含量。     

转多抗基因新疆大叶苜蓿光合生理特征对土壤水分变化的响应

以新疆大叶苜蓿及其为母本的4种转基因株系(SN:转AtNDPK2基因;SC:转codA基因;SOR:转IbOr基因;SAF:转AtABF3基因)为研究材料,通过盆栽控制试验,比较研究了不同土壤水分条件下始花期各株系苜蓿的光合和荧光参数特征。结果表明,随土壤含水量从80% FC(田间持水量)降至40% FC,各株系叶片净光合速率(P_n)、蒸腾速率(T_r)和气孔导度(G_s)均呈下降趋势,叶片瞬时水分利用效率(WUE_i)呈上升趋势。在40% FC时,各转基因株系P_n值(11.19~21.58 μmol·m^-2·s^-1)均显著(P<0.05)大于非转基因株系(6.06 μmol·m^-2·s^-1),各株系间WUE_i无差异但以转AtABF3基因株系最大(3.22 μmol·mmol^-1)。土壤水分降低过程中,各株系叶片初始荧光(F_o),最大光化学效率(F_v/F_m)和光化学淬灭系数(qP)值总体呈下降趋势,实际光化学效率(Φ_PSⅡ)和表观电子传递效率(ETR)值呈先上升后下降,而非光化学淬灭系数(NPQ)值整体呈上升趋势。转基因株系qP值出现显著下降时的土壤水分含量(50% FC)低于非转基因(70% FC)苜蓿。在40% FC时,转基因株系F_v/F_m(0.78~0.82)值显著高于非转基因苜蓿(0.58)。总体表明,转多抗基因均不同程度地提高水分胁迫条件下新疆大叶苜蓿的光合性能,其中转codA基因株系可维持较高光合速率,转IbOr基因株系能维持较高光能利用能力,转AtABF3基因株系能够高效利用水分,转AtNDPK2基因株系总生物量最高。     

CPB-LAR-GFP表达载体的构建及其在紫花苜蓿愈伤组织中的表达

以无色花青素还原酶编码基因LAR为靶序列,构建携带绿色荧光蛋白GFP和抗除草剂bar基因的双标记选择植物表达载体,通过农杆菌介导法对紫花苜蓿进行遗传转化,经PCR检测和PPT筛选出抗性愈伤组织,转基因紫花苜蓿愈伤组织的缩合单宁含量比对照高30.8%。试验证明重组基因已转化至紫花苜蓿愈伤组织中并发挥生理功能,为研究缩合单宁合成与代谢的分子调控机制和培育具有抗除草剂和抗臌胀病的牧草新品种奠定基础。     

转Cecropin B抗菌肽基因柑橘对溃疡病的离体抗性评价

本文对转Cecropin B抗菌肽基因的锦橙植株进行了表达检测以及柑橘溃疡病病原菌的接菌实验。分别用喷雾法和针刺法进行离体接菌实验,用Real-time PCR和Southern blot进一步检测分析了在转基因植株中Cecropin B基因的表达、整合情况。结果显示与喷雾法相比,针刺接种处理的离体叶片开始显症时间短,且发病率高,便于统计分析。针刺接种6天后,大部分转基因株系发病率与非转基因植株无显著差异,其中,PR8、PR11、AAT8 和AAT14株系的发病率分别为67%、63%、68%和54%,显著低于非转基因植株。Real-time PCR表达分析结果表明,转基因株系中Cecropin B基因表达量明显高于对照株系。Southern blot结果显示PR8和AAT14株系中转基因为单拷贝, PR11和AAT8株系中转基因分别为两个拷贝和三个拷贝。实验结果表明转Cecropin B抗菌肽基因提高了对柑橘溃疡病的抗性。     

转DREB1A/Bar双价基因马铃薯的耐旱性及除草剂抗性分析

在前期获得DREB1A/Bar双价转基因马铃薯的基础上,对转基因植株进行了耐旱性和除草剂抗性分析。耐旱性分析显示,在正常浇水条件下,对照和各转基因马铃薯株系生长状态良好且大致相同,各株系的丙二醛含量、相对电导率和SOD酶活性无显著差异(P0.05)。经过控水10d后,非转基因对照植株叶片明显萎蔫卷曲,而转基因植株仍然保持良好的生长状态;转基因株系的丙二醛含量和相对电导率显著低于非转基因株系(P0.05),而SOD酶活性显著高于非转基因对照(P0.05)。控水18d时,大部分对照植株死亡,死亡率为74.33%;转基因植株只有极少数植株死亡,DR2和DR5的死亡率分别为20.43%和5.65%。用0.3%的市售草铵膦喷施各株系,10d后,对照植株全部枯死,转基因株系的个别叶片干枯,绝大多数叶片及所有茎秆生长状态良好。以上分析表明,DREB1A和Bar基因的导入,明显增强了转基因马铃薯对干旱和除草剂的抗性。     

转Bar基因紫花苜蓿杂交组合的筛选与评价

为探究抗除草剂转基因紫花苜蓿（Medicago sativa）的高效杂交种选育技术。本试验以‘公农1号’作为父母本配置了1个对照组合,以转Bar基因的抗草铵膦除草剂转基因紫花苜蓿作为父本,以雄性不育系MS-GN-1A作为母本,配置了11个杂交组合。对后代植株的抗性进行Bar试纸条、PCR检测,对产量和品质性状进行评价和筛选,结果表明,试验中有7个杂交组合的后代表现优异。此试验以紫花苜蓿雄性不育系作为母本配置杂交种,使抗除草剂转基因紫花苜蓿的目标性状高效且稳定遗传,同时在此试验基础上筛选出了优良杂交后代,为良种繁育提供了一定的理论基础。     

Bar基因转化草原1号苜蓿的研究

利用农杆菌介导法将抗草丁膦的Bar基因导入草原1号苜蓿,经叶片筛选试验证实转基因植株对除草剂Basta具有抗性,通过多聚白酶连式反映检测,初步证实目的基因已转入到苜蓿基因组中.     

农杆菌介导的smt1富硒基因转化紫花苜蓿研究

利用遗传转化,将硒富基因转入紫花苜蓿（Medicago sativa）是提高苜蓿富硒能力,解决当前硒不足问题的有效途径之一。本研究以“中苜1号”紫花苜蓿为受体材料,通过农杆菌介导法将来自硒超富集植物二沟黄芪(Astragalus bisulcatus)的硒代半胱氨酸甲基转移酶基因(smt1)转入苜蓿,并以3 mg·L-1潮霉素进行筛选,获得转化植株10株。结果表明,5株均能扩增出与smt1基因大小相符的条带。RT PCR检测结果表明,2株目的基因表达呈阳性,这表明smt1基因已成功转入紫花苜蓿基因组中,且可以在植株中正常表达。     

干燥体细胞胚用作转基因苜蓿人工种子的研究

为探明干化的体细胞胚作为转基因苜蓿(Medicago sativa)人工种子的可行性,采用农杆菌菌株GV3101 感染苜蓿叶柄的遗传转化方法,获得转化苜蓿植株并诱导转化出苜蓿植株的体细胞胚。将成熟的子叶期体细胞胚先置于含10 mM脱落酸的胚形成培养基BOi2Y中培养14 d,然后将胚置于一系列的6种干燥剂中缓慢干燥7 d,最后将胚转到1/2MSO萌发培养基中,直到茎叶萌发和根形成。分析不同转基因株系干化人工种子的萌发率和再生植株中的GUS表达,并利用Southern杂交分析转基因干化人工种子再生植株的遗传变异。结果表明:干化后的转基因人工种子萌发率达到74.3%,产生的植株从形态上相似于没有干化处理的体细胞胚再生植株。在随机的3个转基因株系中,Southern杂交结果表明再生植株仍能稳定表达GUS,每个株系基因整合位点一致。因此,干化体细胞胚用作转基因植物种质保藏的方法是有效可行的。     

农杆菌介导白三叶草高效遗传转化和转基因植株再生

利用子叶下胚轴为外植体,通过农杆菌Ti质粒介导途径,建立了白三叶草高效遗传转化及转基因植株高频率再生体系。PCR检测及Southern印迹鉴定结果表明,外源T-DNA片段已整合到转基因植株的基因组中,且多以1~2个少数拷贝存在。Northern印迹结果和对报告基因GusA编码蛋白的活性检测结果表明,目的基因在部分转基因植株中高水平表达。适宜条件下外植体遗传转化后的植株再生比例达58.23%~62.12%。与对照相比,转基因植株在外部形态上没有发生改变。     

细叶百合LpWRKY20基因对非生物胁迫的响应及抗旱性分析

以细叶百合LpWRKY20基因为研究对象,通过荧光定量(qRT-PCR)分析该基因在不同非生物胁迫中的表达,结果表明,在不同非生物胁迫中该基因表达量存在差异。利用叶盘法将pBI121-LpWRKY20-GFP植物表达载体转入烟草并获得转基因株系。在干旱胁迫条件下,转基因植株的表型优于野生型;转基因植株超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性均高于野生型,且随着时间的延长这种清除体内自由基的能力在显著升高,而丙二醛(MDA)含量均低于野生型,说明转基因植株细胞膜受损程度较低,具有较强的自我修复能力。干旱条件下表型及生理指标的变化均表明转基因植株具有较强的抗旱性,初步推断LpWRKY20具有抗旱的功能。