草原革蜱和边缘革蜱的分子生物学鉴定

本研究旨在建立草原革蜱和边缘革蜱的分子生物学鉴定方法,并探讨其系统发生关系。在新疆从动物体表采集寄生蜱,形态学鉴定后,PCR扩增获得2种革蜱的16S rRNA及线粒体色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因序列,测序后进行同源性分析。用Mega 5.0和Mrbayes 3.2软件分别构建系统进化树,草原革蜱16S rRNA序列与GenBank数据库中已知草原革蜱16S rRNA序列聚类,而边缘革蜱COⅠ序列与GenBank数据库中已知边缘革蜱COⅠ序列聚类,与形态学鉴定结果一致。本研究结果表明,在传统形态学分类的基础上,结合分子生物学鉴定方法能简易、准确鉴定草原革蜱和边缘革蜱。     

四川石渠县牦牛源蜱的形态学及分子生物学鉴定

为鉴定四川石渠县牦牛体表寄生蜱的种类,本试验使用体视显微镜观察蜱的形态学特征,对蜱做形态学初步鉴定,同时提取蜱组织DNA,用PCR扩增蜱COI基因,将阳性产物测序、比对,构建分子进化树进行分子生物学鉴定。结果表明,采集自石渠县牦牛体表的蜱为青海血蜱和西藏革蜱,其中西藏革蜱为优势虫种。     

新疆南疆部分地区蜱种鉴定及斑点热群立克次体流行病学调查

为了解新疆南疆部分地区不同蜱种携带斑点热群立克次体(spotted fever group Rickettsia,SFGR)情况,采用PCR技术扩增16S rDNA基因和SFGR外膜蛋白A(OmpA)基因,进行蜱种鉴定及SFGR检测。对测序阳性样本进行BLAST序列分析,应用DNAStar和Mega 6.0软件构建遗传进化树。结果显示:从新疆南疆9个县市共采集蜱1 340只,其种类包括3属4种,分别为图兰扇头蜱、边缘革蜱、银盾革蜱、亚洲璃眼蜱;在随机挑选的90份蜱DNA样本中共检测出57份SFGR阳性样本,其中阿拉尔市十一团、七连地区的阳性样本均来自犬体表寄生蜱,其余地区的阳性样本均来自绵羊体表寄生蜱。序列分析及遗传进化树显示,此次检测的亚洲璃眼蜱、边缘革蜱携带的SFGR与GenBank公布的SFGR疆内株Candidatus R.barbariae(登录号为MG668832.1)亲缘关系最近,处于同一分支;图兰扇头蜱携带的SFGR也同疆内株R.massiliae、R.conorii、Candidatus R.barbariae(MG668831.1、KP214024.1、MG668832.1)亲缘关系最近,处于同一分支;而银盾革蜱携带的SFGR与国外株R.raoultii(KT805295.1)亲缘关系最近,处于同一分支,并首次于新疆南疆绵羊寄生银盾革蜱中检出饶氏立克次体。本试验为该地区蜱传立克次体病的研究及防控提供重要依据。     

新疆2种优势革蜱携带马梨形虫和饶氏立克次体病原的检测

本试验旨在探究新疆优势分布的2种硬蜱所携带马泰勒虫、马驽巴贝斯虫和饶氏立克次体病原的情况。对采集于昭苏、和静2个采样点的硬蜱样品(n=188)经过分子生物学方法进行了种属鉴定的同时,以马泰勒虫18S rRNA、马驽巴贝斯虫Bc48和饶氏立克次体16S rRNA为靶标,应用PCR进行检测,并将阳性产物测序比对。在188只蜱虫中,93只(昭苏县)为边缘革蜱,95只(和静县)为森林革蜱;在2种硬蜱中,马驽巴贝斯虫的PCR阳性率分别为昭苏县30.1%(28/93)、和静县6.3%(6/95);饶氏立克次体的检出率分别为昭苏县6.5%(6/93)、和静县36.8%(35/95)。试验鉴定归类了昭苏县与和静县采样点的优势种硬蜱,并发现两地的2种硬蜱均可携带马驽巴贝斯虫和饶氏立克次体,本试验为革蜱携带病原相关研究以及蜱传疾病的科学防控提供基础数据。     

蜱源淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒的分子特征

淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic chorimeningtis virus,LCMV)是一种经鼠传播的人畜共患病毒。为明确东北地区LCMV在蜱的感染本底,2015年在吉林省采集蜱534只,其中草原革蜱占43.1%;森林革蜱38.4%;长角血蜱11.4%和全沟硬蜱7.1%。将采集蜱按蜱种及地区分组,进行宏病毒组测序,发现蜱感染LCMV。通过RT-PCR检测发现吉林省LCMV蜱感染率为3.5%,其中长角血蜱、草原革蜱、森林革蜱和全沟硬蜱感染率分别为12.2%,2.5%,4.4%和2.5%,长角血蜱携带率最高。通过全基因组测序获得LCMV全基因组序列,并对其进行遗传进化分析,结果表明东北地区蜱感染的LCMV属于基因Ⅰ型,提示蜱可能作为LCMV的传播媒介。本研究确定了东北地区蜱的LCMV感染率及基因型,为LCMV的防控监测提供科学依据。     

吸血行为对草原革蜱和森林革蜱中肠菌群结构的影响

本研究旨在探明随吸血时间的延长,草原革蜱和森林革蜱中肠菌群结构的特征及变化。从内蒙古呼伦贝尔和宁夏固原绵羊体表分别采集半饱血、饱血草原革蜱和半饱血、饱血森林革蜱,无菌条件下收集蜱中肠内容物,提取细菌总DNA,扩增细菌16S rDNA V3-V4区,IonS5^TMXL高通量测序,对比分析各样本菌群结构的特征。结果显示,森林革蜱半饱血中肠内的细菌多样性最高,草原革蜱饱血和半饱血中肠内的细菌多样性次之,森林革蜱饱血中肠内的细菌多样性最低;变形菌门为4个样品的优势菌门;无形体属、立克次体属、寡养单胞菌属和柯克斯体属为4个样品的优势菌属,其中无形体属在草原革蜱和森林革蜱饱血中肠内的含量高于2种蜱半饱血中肠,立克次体属和柯克斯体属在2种蜱半饱血中肠内的含量明显大于饱血中肠;边缘无形体、弯曲假单胞菌和柯克斯体科RFE02菌为4个样品的优势菌种,其中边缘无形体的分布特点与无形体属在2种蜱中肠内的分布特点相一致。结果表明,草原革蜱和森林革蜱中肠菌群结构易受到吸血行为的影响,共有菌属和菌种在不同蜱种和不同饱血状态下的相对丰度变化较大。     

吸血行为对草原革蜱和森林革蜱中肠菌群结构的影响

本研究旨在探明随吸血时间的延长,草原革蜱和森林革蜱中肠菌群结构的特征及变化。从内蒙古呼伦贝尔和宁夏固原绵羊体表分别采集半饱血、饱血草原革蜱和半饱血、饱血森林革蜱,无菌条件下收集蜱中肠内容物,提取细菌总DNA,扩增细菌16SrDNA V3-V4区,IonS5~(TM)XL高通量测序,对比分析各样本菌群结构的特征。结果显示,森林革蜱半饱血中肠内的细菌多样性最高,草原革蜱饱血和半饱血中肠内的细菌多样性次之,森林革蜱饱血中肠内的细菌多样性最低;变形菌门为4个样品的优势菌门;无形体属、立克次体属、寡养单胞菌属和柯克斯体属为4个样品的优势菌属,其中无形体属在草原革蜱和森林革蜱饱血中肠内的含量高于2种蜱半饱血中肠,立克次体属和柯克斯体属在2种蜱半饱血中肠内的含量明显大于饱血中肠;边缘无形体、弯曲假单胞菌和柯克斯体科RFE02菌为4个样品的优势菌种,其中边缘无形体的分布特点与无形体属在2种蜱中肠内的分布特点相一致。结果表明,草原革蜱和森林革蜱中肠菌群结构易受到吸血行为的影响,共有菌属和菌种在不同蜱种和不同饱血状态下的相对丰度变化较大。     

牦牛体表寄生硬蜱的鉴定及吸血前后观察

为探究牦牛体表寄生硬蜱的优势蜱种及其生物学特性，以便能更好地预防、控制蜱传疾病，从牦牛体表采集蜱虫约1000只，进行蜱种鉴定和饲蜱试验。通过形态学鉴定，牦牛体表寄生的优势蜱种为森林革蜱、草原革蜱、银盾革蜱和亚东璃眼蜱。本文通过查阅资料进一步研究了它们的形态学区分点，并通过实验室饲养观察其吸血情况。研究查清牦牛体表寄生蜱虫的种类，掌握其生活史，对今后牦牛养殖业及蜱传疾病的综合防治具有重大意义。     

马梨形虫病在新疆昭苏地区流行相关因素的调查与分析

为了解新疆昭苏县马匹体表蜱虫和周围游离蜱虫携带马梨形虫情况及其之间流行关系,于2016年4―7月份,分别采集马匹血液、相应马体表携带蜱虫和周围牧场的蜱虫,经PCR检测总携带梨形虫率分别为93.9%(31/33),15.8%(6/38),3.4%(6/175);对所采集的蜱虫进行形态学鉴定,结果分别为草原革蜱、森林革蜱和边缘革蜱;3种革蜱占马体表蜱虫总数的比率和带虫率分别为52.6%(7.9%),44.8%(7.9%),2.6%(0.0%),占牧场游离蜱虫总数的比率和带虫率分别为56.0%(2.3%),43.4%(1.1%),0.6%(0.0%);根据统计学分析,马匹年龄与携带梨形虫及其媒介蜱之间差异显著(P<0.05),马携带蜱虫数量与马源性、蜱源性泰勒虫的感染三者之间均存在显著性差异(P<0.01)。因此,新疆昭苏地区马梨形虫的流行与马匹年龄、带虫媒介蜱虫的数量、种类等因素有关联性。     

新疆昭苏县马梨形虫的检测及传播媒介蜱的鉴定

为了解新疆昭苏县马感染梨形虫情况及传播媒介蜱的种类,采用寄生虫病病原常规检查方法、分子生物学技术和血清学检测方法对200匹马进行马梨形虫的检测,对320只传播媒介蜱进行形态学鉴定。结果显示,血液涂片染色镜检红细胞染虫率为9.23%,PCR、cELISA对驽巴贝斯虫的检出率分别为28%和23.5%,对泰勒虫的检出率分别为36%和34%;对马体表和周边环境采集的320只蜱虫鉴定为草原革蜱和森林革蜱2种。本研究为该地区马梨形虫病的防控提供了科学依据。     

新疆边境地区蜱携带梨形虫种类的分子鉴定

为了调查新疆边境地区梨形虫在当地蜱中的携带情况,对采集于2019年4月份和5月份的新疆边境地区共25个县(市)的蜱进行形态学鉴定,提取DNA,利用梨形虫套式引物进行扩增并测序,并采用IQ-Tree软件的ML法构建不同地理株的进化关系.结果显示,采集到的1 516只蜱包括4个属9个种,分别为森林革蜱(Dermacento...     

牛蜱龙岩分离株的分子鉴定

为了解福建省龙岩地区牛场体表蜱的种类,试验采集龙岩地区牛体表寄生蜱样本,基于蜱的核糖体rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列PCR扩增方法进行分子鉴定,获得ITS1和ITS2基因序列,进行blastn相似性搜索,应用MegAlign和MEGA 7.0软件完成同源性分析及种系发育分析。结果表明,该蜱ITS1序列与中国甘肃微小扇头蜱分离株同源性达99.32%(JQ737124.1、JQ737125.1),与中国湖南微小扇头蜱HAI2分离株同源性达99.16%(MK224531.1);ITS2序列与中国河南、南非豪登微小扇头蜱分离株同源性均为100%(KX450287.1、KY457506.1);种系发育分析结果显示,龙岩地区牛体表分离的牛蜱ITS基因序列与扇头蜱属ITS基因序列聚类,与革蜱属和璃眼蜱属处于两个不同的分支。说明福建龙岩牛蜱分离株为微小扇头蜱。     

伊犁河谷区域银盾革蜱的鉴定及其携带马泰勒虫病原DNA检测

为了解伊犁河谷区域银盾革蜱的分布及其携带马泰勒虫病原情况,通过对银盾革蜱形态学及革蜱属特异性基因(ITS-2)和其携带病原18S rRNA基因PCR扩增及其PCR产物的克隆、测序、同源性比较等,鉴定和检测了采自昭苏种马场马体表银盾革蜱及其携带病原情况。试验结果显示,采回的蜱经形态学鉴定均为银盾革蜱,PCR扩增银盾革蜱ITS-2基因和马泰勒虫18S rRNA基因序列大小分别为825 bp和789 bp。本试验蜱获得的ITS-2序列与已发表的伊朗株(GQ144706.1)同源性为99%,与形态学鉴定结果一致,故鉴定为银盾革蜱。在181只银盾革蜱中携带马泰勒虫的有13只,阳性率为7.1%(13/181),且其携带病原目的基因序列与Gen Bank中已发表的马泰勒虫基因序列相似性为99%。研究表明,结合形态学分类和分子生物学方法对银盾革蜱鉴定具有简易、准确度高等特点,且分离银盾革蜱源性病原更有实际意义,为综合防控奠定了基础。     

马细小病毒的鉴定及遗传进化分析

本研究旨在了解马细小病毒的遗传进化特征。采集新疆昌吉市和哈密市等马场共计53匹马的粪便样品,运用高通量测序技术调查马匹携带病毒的情况。分析病毒宏基因组学测序结果,粪便样品中的核酸信息显示有马细小病毒(Equine Parvovirus,EqPV),根据GenBank中的细小病毒参考毒株VP1基因序列,设计特异性引物,验证病毒组学结果并分析马细小病毒的遗传进化特征。结果显示,在28份伊犁马粪便中发现3份样品呈EqPV阳性,阳性率为11%;在25份焉耆马粪便中检测到2份EqPV阳性样品,阳性率为8%,由遗传进化分析结果表明伊犁马和焉耆马细小病毒属于不同的进化分支,是完全不同的两种马细小病毒。本研究报道了新疆本土品种马的细小病毒携带情况,为马细小病毒的防控和流行病学研究提供基础数据。     

石河子地区宠物犬蜱的种类鉴定及其携带布鲁氏菌的检测

为了解新疆石河子地区宠物犬体表寄生蜱的种类及蜱携带布鲁氏菌情况,本试验在形态学分类的基础上,基于线粒体基因12S rRNA和细胞色素氧化酶Ⅰ（COⅠ）对宠物犬体表采集寄生蜱进行分子生物学检测,使用DNAMAN软件比对分析序列同源性,并应用序列分析软件Mega 7.0邻接法构建蜱种系统发育进化树,分析蜱种的遗传进化关系;基于布鲁氏菌外膜蛋白Omp22基因对宠物犬体表寄生蜱进行布鲁氏菌PCR检测,确定宠物犬蜱布鲁氏菌携带情况。结果显示,宠物犬体表寄生的436只蜱的形态学与线粒体基因（12S rRNA和COⅠ）分子生物学鉴定结果一致,均为新疆优势蜱种之一——图兰扇头蜱（Rhipicephalus turanicus）。基于12S rRNA基因构建的蜱种系统发育树显示,本试验所得宠物犬体表寄生图兰扇头蜱序列与GenBank中已知图兰扇头蜱的序列聚为一大支。基于布鲁氏菌Omp22基因的巢式PCR扩增结果显示,宠物犬体表寄生图兰扇头蜱携带布鲁氏菌的阳性率为4.82%（21/436）,且同源性为100%。BLAST比对显示,本试验所得宠物犬图兰扇头蜱携带的布鲁氏菌与新疆流行株YC31（GenBank登录号：MK201679.1）、QH5（GenBank登录号：MK201678.1）、EM3（GenBank登录号：MK201677.1）和ML9（GenBank登录号：MK201676.1）的同源性均为100%。本研究通过形态学及分子生物学探讨了新疆石河子地区宠物犬体表寄生蜱的种类及携带布鲁氏菌基本情况,为宠物犬体表寄生蜱的种类及蜱传疾病的监测和控制等研究工作提供了基础资料。     

马疱疹病毒1型主要毒力基因分析及TK基因缺失载体的构建

为了解新疆马疱疹病毒1型(EHV-1)主要毒力基因遗传进化情况并构建TK基因缺失株,本研究以EHV-1XJ2015株DNA为模板,对其主要毒力基因TK、gI和gE全长进行克隆、测序及生物信息学分析,并扩增TK基因左右重组臂TKL和TKR,构建质粒pUC-TKLR,将扩增后的增强绿色荧光蛋白(EGFP,含有CMV+polyA)插入pUC-TKLR质粒,构建TK基因缺失打靶质粒。TK、gI和gE基因同源性分析结果显示,XJ2015株与国外EHV-1分离株TK、gI和gE基因同源性均较高,分别为99.8%~100.0%、99.6%~100.0%和99.9%~100.0%;与EHV-3分离株同源性均最低,分别为72.9%、59.4%和62.1%;遗传进化分析显示,3个基因均与国外EHV-1同属于一个遗传进化分支,与EHV-9和EHV-4进化关系较近,但与EHV-3进化关系较远,表明XJ2015毒株与国外EHV-1毒株TK、gI、gE基因核苷酸上差异不明显,没有明显的地域性特征,功能基因保守且进化缓慢,同源基因功能相同或相近;经PCR扩增、酶切、测序及转染鉴定,本试验成功构建了用于TK基因缺失的打靶质粒pUC-TKLR-EGFP。通过对EHV-1主要毒力基因的分析及TK基因缺失打靶载体的构建,为新疆地区马鼻肺炎流行病学调查分析、TK基因缺失株的构建提供理论依据。     

马疱疹病毒1型主要毒力基因分析及TK基因缺失载体的构建

为了解新疆马疱疹病毒1型（EHV-1）主要毒力基因遗传进化情况并构建TK基因缺失株，本研究以EHV-1 XJ2015株DNA为模板，对其主要毒力基因TK、gI和gE全长进行克隆、测序及生物信息学分析，并扩增TK基因左右重组臂TKL和TKR，构建质粒pUC-TKLR，将扩增后的增强绿色荧光蛋白（EGFP，含有CMV+polyA）插入pUC-TKLR质粒，构建TK基因缺失打靶质粒。TK、gI和gE基因同源性分析结果显示，XJ2015株与国外EHV-1分离株TK、gI和gE基因同源性均较高，分别为99.8%~100.0%、99.6%~100.0%和99.9%~100.0%；与EHV-3分离株同源性均最低，分别为72.9%、59.4%和62.1%；遗传进化分析显示，3个基因均与国外EHV-1同属于一个遗传进化分支，与EHV-9和EHV-4进化关系较近，但与EHV-3进化关系较远，表明XJ2015毒株与国外EHV-1毒株TK、gI、gE基因核苷酸上差异不明显，没有明显的地域性特征，功能基因保守且进化缓慢，同源基因功能相同或相近；经PCR扩增、酶切、测序及转染鉴定，本试验成功构建了用于TK基因缺失的打靶质粒pUC-TKLR-EGFP。通过对EHV-1主要毒力基因的分析及TK基因缺失打靶载体的构建，为新疆地区马鼻肺炎流行病学调查分析、TK基因缺失株的构建提供理论依据。     

东北地区蜱携带的肝原虫分子检测

为检测东北地区蜱传肝原虫,于2015年4—6月通过布旗法在吉林省和黑龙江省采集蜱2 767只,其中森林革蜱168只、草原革蜱212只、全沟硬蜱1 629只、嗜群血蜱378只、长角血蜱380只。根据蜱种和地区分组,每组约15只,提取基因组DNA,应用巢式PCR方法检测肝原虫18S rRNA,阳性样本克隆、测序并进行系统进化分析,利用MLE(Maximum Likelihood Estimation)法计算感染率。东北地区蜱的肝原虫感染率为1.6%(43/189),森林革蜱、草原革蜱、全沟硬蜱、嗜群血蜱和长角血蜱的肝原虫感染率分别为2.8%(4/12)、1.5%(3/16)、2.0%(29/110)、0.5%(2/26)和1.1%(5/25),吉林省和黑龙江省肝原虫感染率最高的蜱种分别为森林革蜱(2.8%)和全沟硬蜱(2.1%),进化分析结果显示东北地区蜱携带的肝原虫为2个不同基因型,且均与日本貂(Martes melampus melampus)肝原虫的同源性为99%,均能在草原革蜱和全沟硬蜱中检出,而且在不同地区蜱的感染率存在一定差异。本研究确定东北地区存在蜱感染肝原虫,但是其分类地位及动物宿主还需进一步鉴定。     

新疆3个地区银盾革蜱种群的遗传多样性分析

为了解银盾革蜱遗传多样性和种群分化情况,本研究在新疆伊犁、阿勒泰和巴州地区采集硬蜱562份,对其进行形态学鉴定后,PCR扩增其中的50份银盾革蜱的COI基因序列后对其进行遗传多样性分析。结果显示,在50条597 bp的COI基因序列中,共检出84个变异位点。所有样品共检测到12种单倍型,群体单倍型和核酸多样性指数分别是0.757和0.05554。COI基因系统发育树分析结果显示,新疆3个地区银盾革蜱各地理种群间可划分为2个不同的谱系,且不同地理群体间存在着基因交流。中性检验显示,研究区域内的群体在近期未经历种群扩张;巴州地区内两个种群出现遗传分化现象。表明,3个地区银盾革蜱整体遗传多样性水平高,且种群内部出现了遗传分化现象。本研究结果为银盾革蜱不同地理种群间的系统发育及进化关系的研究提供遗传学信息。     

不同饱血状态草原革蜱与森林革蜱中肠菌群结构的对比与分析

为探明草原革蜱和森林革蜱不同饱血状态下中肠菌群结构的特点,本研究在无菌条件下分别采集饱血、半饱血草原革蜱和森林革蜱中肠内容物,提取细菌总DNA,PCR扩增细菌16S rRNA V3区,变性梯度凝胶电泳(DGGE)后,切取优势条带纯化、克隆和测序,测序结果与GenBank数据库中已知细菌序列进行比对分析。结果显示,在饱血、半饱血草原革蜱和森林革蜱中肠4个肠内容物样品中共检测到巴氏立克次体暂定种、柯克斯体科菌、大肠杆菌、嗜吞噬细胞无形体和斑疹伤寒立克次氏体5种细菌,其中半饱血草原革蜱中肠内存在的菌种为:巴氏立克次体暂定种、柯克斯体科菌和大肠杆菌;饱血草原革蜱中肠内存在的菌种为:巴氏立克次体暂定种、柯克斯体科菌和嗜吞噬细胞无形体;半饱血森林革蜱中肠内存在的菌种为:巴氏立克次体暂定种、大肠杆菌和嗜吞噬细胞无形体;饱血森林革蜱中肠内存在的菌种为:巴氏立克次体暂定种、柯克斯体科菌、嗜吞噬细胞无形体和斑疹伤寒立克次氏体;4个样品中的共有菌为巴氏立克次体暂定种。研究结果表明,不同蜱种中肠内菌群的结构随吸血时间的延长而发生变化。本研究将为防治草原革蜱、森林革蜱及相关蜱传病提供科学依据。