EGF促进绵羊附睾上皮细胞体外增殖的研究

【目的】探讨表皮生长因子(EGF)对体外培养的绵羊附睾上皮细胞(EECs)增殖的影响。【方法】分离培养EECs,利用免疫荧光检测角蛋白18(CK18)对分离的细胞进行鉴定,用CCK-8法测定EGF的最佳作用质量浓度,用RT-PCR检测EECs中附睾分子标记——谷胱甘肽过氧化物酶-5(GPX5)和雄激素受体(AR)基因的表达情况,用流式细胞仪法检测EGF对EECs细胞周期和凋亡的影响。将P_4代EECs分别用表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂Gefitinib、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路抑制剂LY294002和DMSO(对照组)处理后,再用EGF培养,用流式细胞仪法检测细胞周期和凋亡情况。将P_4代EECs分别用EGF(-)、EGF、EGF+Gefitinib和EGF+LY294002处理后,用Western blot检测细胞中EGFR、AKT和叉头盒蛋白O1(FOXO1)磷酸化水平。【结果】分离培养的EECs可表达CK18,细胞纯度较好;EGF对EECs增殖促进效应呈浓度依赖性,用含50 ng/mL EGF培养基培养的EECs具有最高的增殖潜能,且不同传代EECs细胞均可正常表达GPX5和AR;EGF处理S期EECs细胞比例极显著升高(P0.01),凋亡指数显著降低(P0.05)。与对照组相比,Gefitinib组S期EECs细胞比例极显著降低(P0.01),LY294002组S期细胞比例显著降低(P0.05);Gefitinib组EECs细胞的凋亡指数极显著升高(P0.01),而LY294002组EECs细胞的凋亡指数无显著变化。EGF组中EECs细胞的EGFR、AKT和FOXO1磷酸化水平较高;与EGF组相比,EGF+Gefitinib组中EECs细胞的EGFR、AKT和FOXO1磷酸化水平明显降低,而EGF+LY294002组中EECs细胞的AKT和FOXO1磷酸化水平明显降低。【结论】EGF可增强绵羊EECs体外生长活力,其作用机制可能是EGF通过介导EGFR和PI3K/AKT信号通路上调了FOXO1的磷酸化水平。     

绵羊腔卵泡中葡萄糖和生殖激素及其受体基因表达的相关性分析

通过分析绵羊不同直径腔卵泡中葡萄糖与生殖激素(FSH、LH和17β-E_2)含量和相关受体基因表达的相关性,阐明不同腔卵泡发育中葡萄糖和生殖激素对卵泡生殖调控的机制。根据绵羊腔卵泡不同直径划分为小卵泡组(2.0～3.4 mm)、中卵泡组(3.5～5.4 mm)和大卵泡组(5.5 mm)3组,收集其卵泡液及颗粒细胞(GCs)。采用AnnextinV-FITC测定小、中和大卵泡中GCs凋亡情况;利用放射免疫法检测小、中和大卵泡组中葡萄糖浓度及FSH、LH和17β-E_2的含量;运用qRT-PCR技术检测小、中和大卵泡GCs中FSHR、LHR和G6Pase基因的转录水平。结果显示,不同直径绵羊腔卵泡中GCs凋亡无显著差异(P0.05);随着腔卵泡直径的增大,卵泡液中葡萄糖浓度、FSH、LH和17β-E_2的含量均升高;同时,GCs上FSHR、LHR、G6Pase基因的转录水平极显著升高(P0.01)。不同直径腔卵泡中,葡萄糖浓度与FSH含量均呈显著正相关,仅在大卵泡中与LH呈显著正相关(P0.05)。另外,葡萄糖浓度与FSHR、G6Pase基因的表达量呈显著正相关,只在大卵泡中与LHR表达量呈显著正相关(P0.05)。随着绵羊腔卵泡生长,葡萄糖与生殖激素含量和相关受体基因表达量具有显著相关性,共同参与调节卵泡发育。     

不同氧气浓度对绵羊体外受精胚胎凋亡相关基因表达的影响

[目的]研究绵羊胚胎体外发育过程中细胞凋亡的机制,以进一步提高胚胎体外发育能力。[方法]利用Real-time PCR技术,分别检测凋亡相关基因Mcl-1、Bad、Bak、Bik和Caspase-3在低氧环境(5%O2)和高氧环境(20%O2)培养的绵羊体外受精(IVF)胚胎中的表达水平。[结果]不论是高氧环境还是低氧环境,从2-细胞阶段到囊胚期均可检测到Mcl-1、Bad、Bak、Bik和Caspase-3的表达,Caspase-3基因表达水平随着胚胎的发育有逐渐增高的趋势,且高氧和低氧间差异不显著(P0.05);从8-16细胞期开始,Mcl-1、Bad、Bak和Bik表达水平都显著增加,且低氧环境中的表达水平均明显低于高氧环境中的表达水平(P0.05)。[结论]氧气浓度在一定程度上影响了绵羊胚胎中凋亡相关基因的表达,绵羊胚胎细胞凋亡可能是凋亡相关基因Mcl-1、Bad、Bak、Bik和Caspase-3相互协同的结果。     

FSH激活的ERK1/2信号通路在GC细胞增殖分化过程中的作用

为探明由促卵泡刺激素(FSH)激活的胞外信号调节蛋白激酶1/2 (ERKl/2)通路在颗粒细胞(GC)增殖分化过程中的作用,以分离培养的SD大鼠GC为材料,研究了FSH激活的ERK1/2通路对GC增殖和分化的影响.结果显示:FSH快速诱导了ERK1/2的磷酸化,这种诱导作用具有时间依赖性,FSH作用0.33h时其磷酸化水平达到最高,用磷酸蛋白激酶A(PKA)的特异性抑制剂H89抑制PKA活性,显著降低了FSH和腺苷酸环化酶激活剂(forskolin)对ERK1/2的激活作用.以增殖细胞核抗原(PCNA)为GC增殖指标,以甾体生成快速调节蛋白(StAR)和甾体生成为GC分化指标,检测发现50 ng/mL的FSH以时间依赖方式诱导了PCNA蛋白的表达,FSH处理2h,PCNA蛋白水平达到最高;用UO126(ERK1/2的特异性抑制剂)阻断ERK1/2通路发现,FSH对PCNA和甾体生成的促进作用明显减弱;激光共聚焦检测结果进一步显示,与对照组相比,FSH组StAR信号明显增强,抑制ERK1/2活性显著降低了StAR的荧光强度.可见,FSH激活的ERK1/2通路促进了PCNA和甾体的生成,诱导了GC的增殖和分化.     

不同能量蛋白水平对绵羊睾丸生精细胞凋亡及相关基因表达的影响

为研究不同能量蛋白对绵羊睾丸生精细胞凋亡及相关基因的影响,选择健康状况良好体重相似的绵羊公羔,将其随机分配到不同能量蛋白水平的3组日粮:100%自由采食组、65%采食组和35%采食组,进行饲喂,当100%自由采食组体重达到35kg后各组取样检测。结果表明,35%采食组中的Bcl-2,Bax mRNA表达量和生精细胞凋亡数量均显著高于其它两组(P<0.05)。65%采食组Bax mRNA表达量和生精细胞凋亡数目均高于100%自由采食组,但是差异均不显著(P>0.05)。100%自由采食组中Bcl-2mRNA表达量高于65%采食组,但是差异不显著(P>0.05)。说明不同能量蛋白水平日粮对绵羊生精细胞凋亡是有影响的,而Bcl-2,Bax参与了此凋亡调控过程。     

Ghrelin对绵羊早期体外胚胎发育调节机制的初步研究

【目的】探讨Ghrelin对绵羊早期胚胎发育的调节机制。【方法】将绵羊体外受精早期胚胎在Ghrelin组(300,1 000,10 000ng/mL)、Ghrelin受体拮抗剂D-Lys3-GHRP-6组(10,200,400ng/mL)、D-Lys3-GHRP-6+Ghrelin组(D-Lys3-GHRP-6 400ng/mL,Ghrelin 300,1 000和2 000ng/mL)、空白对照(不加D-Lys3-GHRP-6和Ghrelin)4个组别的胚胎发育液中进行发育培养,采用荧光定量PCR技术分别对各处理不同发育阶段(2-细胞期、4-细胞期、8-细胞期和16-细胞期)绵羊早期胚胎中ERK1、ERK2、P90rsk、Bcl-2、Bax mRNA的表达情况进行检测。【结果】与空白对照组相比,在添加Ghrelin组ERK1、ERK2、P90rsk、Bcl-2基因mRNA的表达表现为显著性上调(P0.05),且这种上调作用可被D-Lys3-GHRP-6所拮抗;在添加Ghrelin组Bax基因mRNA的表达无显著性变化,但在D-Lys3-GHRP-6组Bax基因mRNA的表达表现为显著性上调(P0.05)。【结论】Ghrelin可级联激活MAPK信号通路,抑制促凋亡基因Bax的表达、促进抗凋亡基因Bcl-2的表达,进而促进绵羊早期胚胎的发育。     

线粒体凋亡途径在硫酸黏菌素致PC12细胞凋亡中的作用

探讨线粒体凋亡途径在硫酸黏菌素诱导PC12细胞凋亡中作用.取对数生长期PC12细胞,用含0、62.5、125、250 μg· mL-1硫酸黏菌素DMEM培养液,作用24 h,采用Hoechst33258荧光染色法检测PC12细胞凋亡,Western blot法检测细胞色素C(Cyt-C)、Bax、Bcl-2蛋白表达含量,试剂盒检测Caspase-3活性.与对照组相比,125、250 μg· mL-1硫酸黏菌素剂量组细胞PC12细胞Cyt-C、Bax蛋白表达量、Caspase-3活性显著升高(P＜0.01);Bcl-2蛋白表达显著降低(P＜0.01),具有剂量-效应关系.说明线粒体途径介导PC12细胞凋亡是硫酸黏菌素神经毒性作用机制之一.     

椿皮提取物对Hela细胞增殖及凋亡相关作用机制

通过检测椿皮提取物对宫颈癌Hela细胞活力的影响,观察药物对细胞凋亡、细胞周期、细胞自噬及相关因子的调控作用,对引起细胞凋亡的分子机制进行初步研究.体外培养Hela细胞,以不同质量浓度的椿皮提取物处理宫颈癌Hela细胞后,MTT法检测药物对Hela细胞增殖的影响;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测椿皮提取物对Hela细胞凋亡的影响;PI单染流式细胞术检测椿皮提取物对Hela细胞周期的影响;qRT-PCR检测椿皮提取物对Bcl-2/Bax mRNA水平表达的影响;Western-blot法测定Hela细胞凋亡因子Bcl-2、Bax及自噬相关因子蛋白的表达.MTT结果显示,椿皮提取物能抑制宫颈癌Hela细胞增殖,呈剂量依赖性(P＜0.05);质量浓度为5,10,20 μg/mL椿皮提取物处理Hela细胞48 h后,Hela细胞增殖抑制率及凋亡率明显上升,并且高于对照组(P＜0.05);PI单染流式细胞术结果发现,椿皮提取物诱导阻滞Hela细胞分裂G2/M期(P＜0.05);qRT-PCR结果显示,Bax mRNA表达量升高,Bcl-2 mRNA表达量降低,呈剂量依赖性(P＜0.05);Westernn-blot结果显示,Bax蛋白表达量升高,Bcl-2蛋白表达量降低,LC3BⅡ/Ⅰ值升高,呈剂量依赖性(P＜0.05).椿皮提取物能明显抑制宫颈癌Hela细胞的增殖,通过调控Bax、Bcl-2凋亡基因表达,阻滞细胞G2/M期,促进细胞发生凋亡,通过调控LC3B基因表达,促进宫颈癌细胞发生自噬.     

饥饿诱导p53缺失猪成纤维细胞自噬促进凋亡

【目的】探究p53基因对饥饿诱导猪成纤维细胞(PFCs)形态、增殖、自噬及凋亡的影响,为进一步研究p53基因与肿瘤发生发展的分子机制提供理论依据。【方法】用EBSS、Baf A1和EBSS+Baf A1分别处理p53wt和p53-/-2株PFCs 2 h后,观察细胞形态变化并检测细胞的增殖、凋亡以及ATG9A和Bcl-2蛋白的表达情况。【结果】与对照组相比,EBSS和EBSS+Baf A1处理下p53wt与p53-/-的PFCs均发生皱缩和长出丝状伪足;在p53-/-PFCs中,其细胞的增殖率明显下降,ATG9A蛋白的表达水平显著或极显著上调(P0.05或P0.01),Bcl-2蛋白的表达水平无显著变化(P0.05);在p53wt PFCs中,Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P0.05);EBSS处理下,p53-/-PFCs的凋亡比率显著升高(P0.05)。与p53wt PFCs相比,p53-/-PFCs的形态变化率极显著下降(P0.01),其细胞的增殖率显著升高(P0.05),ATG9A蛋白表达水平显著或极显著升高(P0.05或P0.01),Bcl-2蛋白表达水平显著或极显著下降(P0.05或P0.01)。【结论】饥饿诱导p53缺失猪成纤维细胞自噬促进了凋亡的发生,这为进一步研究p53基因与自噬、凋亡及肿瘤发生的分子机制提供了重要的理论依据。     

巴什拜羊重组BPI蛋白的体外功能检测

研究巴什拜羊重组杀菌性/通透性增加蛋白(recombinant bectericidal/permeability increasing protein,rBPI)的体外生物学特性。向体外培养的鼠脑内皮细胞MBECs(mouse brain endothelial cell)中加入rBPI,利用Annexin V FITC/PI染色法在荧光显微镜下鉴定凋亡细胞,再用琼脂糖凝胶电泳观察DNA ladder,以检测rBPI诱导MBECs凋亡的作用;在体外培养的绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)中加入rBPI,利用real-time PCR技术检测rBPI对MO的抑制作用;在体外培养的大肠杆菌中加入rBPI,利用微量肉汤稀释法检测rBPI的抑菌作用;在体外培养的绵羊中性粒细胞中加入MO,利用real-time PCR技术检测BPI mRNA的表达水平。结果表明,Annexin V FITC/PI染色法可观察到凋亡早期细胞呈绿色,凋亡晚期或死亡细胞呈红色,在540nmol/L rBPI浓度诱导作用下可见清晰的DNA ladder条带;rBPI作用于MO3h时,MO16SrRNA表达水平显著低于对照组(P0.05);20、40和80mg/L的rBPI与阳性对照组相比均能够显著抑制大肠杆菌的生长(P0.05);绵羊中性粒细胞受到MO感染后3h和4h时表达BPI mRNA的水平均显著高于对照组(P0.05)。     

卵巢颗粒细胞自噬与PI3K/AKT/FOXO3a信号通路的相关性

细胞自噬是哺乳动物细胞物质代谢的一个重要机制,与细胞凋亡共同参与卵巢卵泡的发育和闭锁,并发挥重要的作用。近年研究发现,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT）信号通路参与卵巢疾病的发生。PI3K和AKT的过度激活可使原始卵泡过早发育以及卵泡过快凋亡,卵巢颗粒细胞作为卵泡发育重要的支持细胞,其功能的减退或凋亡很可能引发一系列女性内分泌方面的疾病。FOXO3a转录因子是PI3K/AKT信号通路下游的重要靶蛋白之一,参与抗增殖和凋亡。本文就关于卵巢颗粒细胞自噬与PI3K/AKT/FOXO3a信号通路的相关进展加以综述。     

二花脸猪linc-NORFA核心启动子鉴定与转录调控分析

【目的】 前期研究证实linc-NORFA作为母猪繁殖性状候选基因参与调控卵泡闭锁与卵泡颗粒细胞凋亡过程,进一步鉴定二花脸猪linc-NORFA核心启动子并分析其转录调控机制,为解析linc-NORFA介导猪卵泡闭锁的分子机制奠定理论基础并提供新的研究思路。【方法】 采集二花脸猪耳组织样品并提取基因组DNA,利用PCR扩增和测序技术获得二花脸猪linc-NORFA 5′调控区序列;通过构建缺失表达荧光报告载体并利用荧光素酶活性试验鉴定二花脸猪linc-NORFA核心启动子;利用生物信息学分析二花脸猪linc-NORFA核心启动子区序列特征与潜在的转录因子结合位点;构建猪FOXO1真核生物表达载体并进一步采用Western blot、qRT-PCR以及荧光素酶活性试验分析转录因子FOXO1过表达对二花脸猪linc-NORFA转录的影响;利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术鉴定转录因子FOXO1与二花脸猪linc-NORFA核心启动子区的结合能力。【结果】 通过克隆测序与序列拼接共获得二花脸猪linc-NORFA 5′调控区序列1 734 bp,其中包含两个潜在的CpG岛;利用荧光素酶活性试验证实linc-NORFA核心启动子位于-988 — -684 bp（转录起始位点作为+1）,生物信息学分析表明二花脸猪linc-NORFA核心启动子上包含多个转录因子的结合元件,例如ESR2、FOXO1、E2F1、BRCA1以及NFIC等;另外,ChIP试验还证实在猪卵巢颗粒细胞中FOXO1作为转录因子直接靶向结合在linc-NORFA的核心启动子区;进一步通过试验证实FOXO1过表达可显著下调linc-NORFA核心启动子区活性（P<0.01）,同时显著抑制体外培养的猪卵巢颗粒细胞中linc-NORFA的表达（P<0.01）。【结论】 鉴定了二花脸猪linc-NORFA核心启动子区,同时证实FOXO1作为转录因子能够与linc-NORFA核心启动子区特异性结合,进而抑制后者的转录活性与表达。研究结果对探究linc-NORFA在猪卵泡闭锁过程中显著下调的分子机制具有重要意义。     

MIF在不同直径猪卵泡的表达变化规律

为分析巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)在不同直径健康猪卵泡上的表达变化规律,将收集到的90个健康母猪卵巢,通过ELISA检测不同直径卵泡液中MIF质量浓度,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测颗粒细胞中MIF基因mRNA和蛋白的表达水平,采用免疫荧光检测MIF在颗粒细胞中的分布情况。结果显示:1)中等直径卵泡(3～4mm)液中MIF的质量浓度(54.17±7.86ng/mL)显著高于大卵泡(6mm,32.29±1.47ng/mL)和小卵泡(1～2mm,38.89±0.98ng/mL)(P0.05);2)中等直径卵泡颗粒细胞中MIF基因mRNA和蛋白质表达量也显著高于大卵泡和小卵泡的表达量(P0.05);3)MIF也在不同直径卵泡颗粒细胞中的细胞核和细胞质表达,但多集中于细胞质中。综上,随着猪卵泡发育过程,MIF在中等直径卵泡中表达量最高。本研究为母猪卵泡发育和排卵提供新的线索。     

Follicle-stimulating hormone is expressed in ovarian follicles of chickens and promotes ovarian granulosa cell proliferation

Follicle-stimulating hormone(FSH), an important hypothalamic-pituitary-gonadal axis(HPG) hormone, is secreted by the pituitary gland. This study confirms that FSH is expressed in chicken follicles at different stages, and positive FSHβ mRNA signals were stronger(P0.05) in granulosa cells than in oocytes. The 369 bp coding sequence of FSHβ in ovaries is 100% identical to that in the pituitary gland. The experiment in vitro revealed that the ovary possessed FSH secretory capacity. Further, FSHβ mRNA was significantly upregulated(P0.05) in follicles and significantly higher(P0.05) than that in the pituitary gland by approximately 2–23 times with the development. The number of granulosa cells decreased significantly(P0.05) in the cells with siRNA treatment, confirming that the ovarian FSH could promote granulosa cell proliferation. This view was supported by cell cycle analysis and CCND2 and CCNE2 expression. Further research indicated that no difference(P0.05) was observed between the number of granulosa cells treated with FSHβ siRNA and in exogenous FSH. However, the number of granulosa cells without FSHβ siRNA transfection was significantly higher(P0.05) for exogenous FSH. This finding suggests that the proliferative effect of exogenous FSH on ovarian granulosa cells depend on endogenous FSH. This study demonstrated that the FSH gene was expressed in chicken follicles and promoted ovarian granulosa cell proliferation, which enriched the theory on HPG axis.     

绵羊卵泡颗粒细胞体外培养条件的优化

为了探讨绵羊卵巢卵泡颗粒细胞体外培养时FSH(Invitrogen)与胰岛素的最佳质量浓度,试验在无血清条件下培养绵羊卵泡颗粒细胞,并向其中加入不同质量浓度的FSH与胰岛素,体外培养7 d后测定细胞数目以及培养液内雌二醇浓度。结果表明,当培养液内FSH质量浓度为25 ng/mL、胰岛素质量浓度为100ng/mL时,颗粒细胞的数目最多;当FSH质量浓度为1 ng/mL、胰岛素质量浓度为10 ng/mL时,培养液内雌激素质量浓度最高。     

Smad9基因干扰表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖及内分泌的影响

为阐明BMP/Smad信号通路下游的转录因子 Smad9对鹅卵泡发育的调控作用，研究采用RNAi技术干扰 Smad9基因在鹅卵泡颗粒细胞的表达。通过对SMAD9蛋白表达定位， Smad9基因干扰后颗粒细胞的增殖情况以及卵泡发育相关激素及其受体的表达分析，探讨 Smad9基因表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖及其内分泌功能的影响。结果显示，SMAD9蛋白在鹅卵泡仅表达于颗粒细胞，Smad9-siRNA显著抑制 Smad9的表达。 Smad9干扰后颗粒细胞的增殖能力明显降低，细胞上清中雌二醇（E₂）的水平显著下降，孕酮（P_{4）水平未见明显变化，细胞色素P450芳香化酶基因（ CYP19A1）和促黄体素受体（LHR）基因的表达显著下降，促卵泡素受体（FSHR）基因的表达无显著变化。这些结果表明，干扰 Smad9基因表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖和内分泌功能均产生显著影响，其机制可能是 Smad9基因表达抑制后引起颗粒细胞E2合成减少和LHR的表达下降有关。}     

miR-99a-5p inhibits target gene FZD5 expression and steroid hormone secretion from goat ovarian granulosa cells

MicroRNA (miRNA) has vital regulatory effects on the proliferation, differentiation and secretion of ovarian granulosa cells, but the role of miR-99a-5p in goat ovarian granulosa cells (GCs) is unclear. Both miR-99a-5p and Frizzled-5 (FZD5) were found to be expressed in GCs in goat ovaries via fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry, respectively, and FZD5 was verified (P<0.001) as a target gene of miR-99a-5p by double luciferase reporter gene experiments. Furthermore, FZD5 mRNA and protein expression were both found to be regulated (P<0.05) by miR-99a-5p in GCs. Moreover, the overexpression of miR-99a-5p or knockdown of FZD5 suppressed (P<0.05) estradiol and progesterone secretion from the GCs, as determined by ELISA. In summary, miR-99a-5p inhibits target gene FZD5 expression and estradiol and progesterone synthesis in GCs. Our study thus provides seminal data and new insights into the regulatory mechanisms of follicular development in the goat and other animals.     

LKB1基因对卵巢颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用

【背景】颗粒细胞类固醇激素的合成能力对卵泡发育及成熟具有重要作用,但其关键的调控因子尚不完全清楚。笔者前期的研究表明肝激酶B1（liver kinase B1,LKB1）基因参与细胞的脂类代谢,类固醇激素的合成与脂类代谢密切相关,并且有研究结果亦显示LKB1敲除可引起小鼠卵巢早衰,表明LKB1对维持卵巢的功能很关键,其在颗粒细胞的确切功能需要进一步研究。【目的】探究LKB1在牛卵泡中的表达模式及其对颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用, 为母牛繁殖生理调控研究提供理论依据。【方法】采用免疫组织化学染色对LKB1蛋白在卵泡中进行定位研究;同时分离培养牛原代颗粒细胞,并以促卵泡素受体（follicle stimulating hormone receptor, FSHR）蛋白作为标记基因,细胞免疫荧光染色鉴定颗粒细胞及纯度;然后以原代颗粒细胞为模型,采用siRNA沉默LKB1的技术,利用qRT-PCR方法检测LKB1功能缺失对类固醇激素合成相关基因表达的影响,另一方面采用腺病毒过表达LKB1,qRT-PCR和ELISA技术验证LKB1对类固醇激素合成相关基因表达的调控作用及雌二醇分泌。【结果】 1) LKB1蛋白在卵泡中的细胞均表达,但颗粒细胞的染色信号强于膜细胞,进一步的定量分析显示颗粒细胞的表达量显著高于卵泡膜细胞。2) 分离培养的牛原代卵泡颗粒细胞贴壁生长、细胞形态多呈圆形,能被颗粒细胞标志基因FSHR抗体标记。3) RNAi技术能显著抑制LKB1的表达。与对照相比,siRNA1和siRNA2干扰LKB1的效率分别为48% (P<0.05)和52% (P<0.05);沉默LKB1显著降低颗粒细胞类固醇激素合成基因 STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,分别下调了约为对照组的60%、80%和50%。4) LKB1过表达腺病毒及对照组对颗粒细胞均具有高的感染效率,LKB1过表达效率高达10倍（P<0.01）;过表达LKB1显著上调STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,进一步研究显示LKB1基因功能获得促进颗粒细胞雌二醇的分泌（P<0.05）。【结论】LKB1在卵泡颗粒细胞中高表达,促进类固醇激素生成基因STAR 、CYP11A1和CYP19A1的表达和雌二醇的分泌。本研究将为LKB1调控牛颗粒细胞类固醇激素合成的功能提供直接的理论依据。     

牛卵泡颗粒细胞CART与候选受体的分子对接及其功能

通过同源建模预测牛卵泡颗粒细胞(GCs)可卡因–苯丙胺转录肽(CART)与候选受体ZMPSTE24的三维结构,运用分子对接技术分析二者的结合模式,探究其分子互作关系;选取3头健康成年母牛,分离GCs,转染TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24沉默序列,提取总RNA,并采用q RT–PCR检测TEDDM1、AGTR2、CMKLR1、ZMPSTE24等4个候选受体沉默后m RNA的相对表达量;采用CCK–8法测定各试验组和对照组GCs增殖情况;采用ELISA法检测各组培养液中雌激素(E2)的质量浓度,研究此4个候选受体在牛卵泡GCs中的功能。结果表明：ZMPSTE24与CART存在1个结合位点、9个盐桥、17个氢键;4个候选受体试验组的m RNA相对表达量均极显著(P<0.01)低于si NC组和空白组的,表明TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24在GCs中沉默效果良好;TEDDM1、CMKLR1、AGTR2、ZMPSTE24沉默后,各试验组的细胞增殖率和培养液中E2质量浓度均极显著(P<0.01)低于阳性对照组(不加CART)的。可见,4个...     

胰岛素样生长因子-I对鸡等级前卵泡发育的促进作用

 【目的】探讨胰岛素样生长因子-I（IGF-I）对产蛋鸡等级前卵泡发育的影响。【方法】用免疫组化和RT-PCR法检测IGF-I受体在鸡等级前卵泡中的表达,研究IGF-I对鸡早期卵泡发育的影响。【结果】IGF-I受体在等级前卵泡颗粒层和膜层均有表达,且随着卵泡的发育其表达水平逐渐增高,在小黄卵泡(SYF)阶段达到最大;同时,卵泡体外培养结果表明IGF-I（100 ng•mL-1）、FSH（10 n•mL-1）及IGF-I+FSH处理可显著增加SYF中膜层和颗粒层的厚度及细胞密度,且IGF受体在颗粒层和膜层中的表达水平也显著增加,其中以IGF-I+FSH联合处理组的效果最为显著。【结论】IGF-I能显著提高产蛋鸡SYF颗粒层和膜层的细胞数目以及厚度,同时增加IGF-I受体的表达,并可与FSH联合作用以提高IGF受体的表达,促进鸡卵泡细胞的增殖,进而调节鸡等级前卵泡的发育,此结果有助于揭示家禽卵泡发育的局域性内分泌调节作用。