河北省又取得一批农药植保类科研成果

<正>(接上期)7.棉花黄萎病拮抗芽孢菌剂的研制单位名称:河北农业大学评价单位名称:保定市科技局项目组分离1株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)有较高拮抗的芽孢杆菌菌株,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。盆栽试验表明,Z-5菌株对棉花黄萎病的防治效果达到76.05%。采用抗利福平和抗     

一种防治棉花黄萎病的生物复合种衣剂的研制

【目的】为充分发挥甲基营养型芽孢杆菌菌株LH-L3的抑菌和促生长作用,将该菌株作为复方种衣剂的有效成分,引入到化学种衣剂。【方法】通过测定4种配方的种衣剂对带菌种子的杀菌效果,确定最佳配方;采用平板法测定菌株存活情况,确定其货架期;进行温室盆栽试验,研究其防治病虫害的效果。【结果】4号配方种衣剂(克百威10%(质量分数,下同)、咯菌腈2.5%、福美双10%、10~9cfu·m L~(-1)LH-L3)杀菌效果最好,室温贮藏半年后有效活菌量仍达到1.1×10~5cfu·m L~(-1)。在盆栽试验中,出苗15 d时该种衣剂包衣棉种出苗率、株高、最大叶宽比对照分别提高11.54%、18.74%、20.91%。在棉花发生黄萎病2 d和5 d时,发病率分别降低65.42%和48.56%。包衣种子棉苗棉大卷叶螟的被害株率比空白对照降低66.92百分点,防治效果达92.33%。【结论】LH-L3菌株与化学农药复配作为种衣剂完全可行,且本试验研制的生物复合种衣剂对棉花黄萎病和棉大卷叶螟有较好的防治效果。     

一株大丽轮枝菌拮抗细菌7-47菌株的分离与鉴定

 从全国各地棉田采集土样,筛选对棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）具有拮抗作用的芽孢杆菌菌株。通过初筛得到具有拮抗作用的菌株68株,复筛选出1株拮抗活性较高的菌株7-47,并通过生理生化试验,形态特征的观察及16S rDNA的序列分析对其进行了鉴定,认为菌株7-47属于漠海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）。     

贝莱斯芽孢杆菌SZAD1对大丽轮枝菌的生物防治效果

【目的】黄萎病是棉花的主要真菌病害,缺乏高抗品种和安全有效的化学杀菌剂。生物防治黄萎病对棉花生产具有重要意义。本研究旨在探讨棉花内生细菌对大丽轮枝菌的拮抗活性和生物防治潜力。【方法】通过16S r DNA与gyr B序列分析,对菌株SZAD1进行鉴定。在平板对峙试验中检测SZAD1对黄萎病菌VD080菌丝生长的抑制能力,通过种子浸泡和灌根检测对黄萎病的防效。制备含羧甲基纤维素或几丁质的琼脂平板培养基来检测菌株能否分泌纤维素酶和几丁质酶,并用二硝基水杨酸试剂法测定酶活性。【结果】SZAD1属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。SZAD1菌株能显著抑制VD080菌丝生长,种子浸泡法和灌根法处理中SZAD1菌株对棉花黄萎病的防效分别为60.10%和56.00%。SZAD1菌株能产生纤维素酶和几丁质酶,在培养72 h时达到最大酶活性。该菌发酵72 h的上清液抑菌效果最强。加入25 mg·L~(-1)和50 mg·L~(-1)的SZAD1发酵上清液后,液体马铃薯葡萄糖琼脂培养基中的VD080孢子含量分别较对照降低了30.20%和96.53%。【结论】SZAD1菌发酵上清液通过灌根法处理可减少VD080在棉花植株茎部的定植,减轻棉花叶片枯萎程度。SZAD1有作为生防菌控制棉花黄萎病的潜力。     

内生和根际细菌对棉花防御酶活性诱导和黄萎病防治作用

【目的】研究细菌Bacillus vanillea SMT-24、B. velezensis BHZ-29、B. subtilis SHT-15、B. atrophaeus SHZ-24在土壤中的定植、促生、对棉花诱导抗性及对黄萎病的防治效果,为更好地防治棉花黄萎病提供科学依据。【方法】通过观察抑菌圈,判断各菌株对大丽轮枝菌的拮抗效果;以4株菌在根际土壤定植数量,反映拮抗菌定植能力;调查棉花株高、根长、根毛数、叶片数,分析4株菌的促生作用;测定棉叶过氧化氢酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase,PAL)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性,并通过盆栽试验调查拮抗菌发酵液灌根后棉花的病情指数,探讨拮抗菌株对棉花诱导抗性的作用。【结果】SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24能明显抑制大丽轮枝菌的生长,形成清晰的抑菌圈,第3次接种后2～22 d,在根系土壤中能大量存活,提高棉花株高、叶片数和根毛数,以及棉叶CAT、SOD、PAL、POD活性,并降低病情指数。【结论】拮抗菌SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24能促进棉花生长,提高部分防御酶活性,有效防治棉花黄萎病。     

棉花黄萎病拮抗蛋白的分离与纯化

从棉花叶组织中分离到的类芽孢杆菌(Paenibacillus)LC105菌株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌具有明显的拮抗作用.该菌株发酵液分别用过滤、高压灭菌及有机溶剂处理,初步证明对大丽轮枝菌产生拮抗作用的物质为蛋白质.LC105菌株发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析及Sephacryl S-100凝胶层析分离纯化,得到了分子量为27 kDa的抗菌蛋白.     

一株棉花黄萎病拮抗芽孢细菌的分离鉴定及活性检测

 采用改良的琼脂平板扩散法,通过初筛和复筛,得到一株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）具有较强的抑菌活性的拮抗细菌Z-5菌株。通过对该菌株的形态特征观察、生理生化鉴定和16S rDNA的序列分析,确定拮抗细菌Z-5菌株为Bacillus malacitensis。盆栽实验表明Z-5菌株对大丽轮枝菌的防治效果达到76.05%,对棉花黄萎病具有明显的防治作用。     

棉花黄萎菌拮抗菌BDT-25的鉴定及抗菌蛋白产生条件研究

拮抗细菌BDT_25是从根际土壤中分离到的一株对棉花黄萎病菌具有强烈抑制作用的芽孢杆菌。经生理生化特征的鉴定,证明BDT_25菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。此外,该菌株还对棉花枯萎病菌、棉花立枯病菌等10种其他病原真菌的生长具有显著的抑制作用,为一株广谱拮抗细菌菌株。通过对BDT_25菌株培养条件的研究发现,采用NB液体培养基,28℃,170 r/min培养48 h所得发酵液对棉花黄萎病菌的抑制作用最强。其发酵液经硫酸铵沉淀粗提到对棉花黄萎病菌具有抑制作用的提取物,进一步实验表明,该拮抗物质对热和多种蛋白酶敏感,证实其为抗菌蛋白。     

土壤环境因子对棉花根际与内生拮抗细菌存活数量的影响

【目的】分析实验室条件下土壤理化性质对棉花黄萎病拮抗细菌数量及活性的影响,揭示拮抗细菌在土壤不同理化条件下的适应能力。【方法】以已筛选的4个棉花黄萎病拮抗细菌菌株为基础,采用涂布法测定培养皿土壤中不同理化因子(含水率、温度、含盐量、肥力、pH、土壤类型)下的拮抗细菌数量;通过最适土壤理化环境下的盆栽试验,对棉株根部土壤中的拮抗细菌数量进行测定并对棉花黄萎病发生情况进行统计。【结果】SHZ-24和BHZ-29菌株在土壤中活菌相对数量较高,其中SHZ-24的活菌相对数量在15%的土壤含水率下达到27.74%,BHZ-29菌株在中等肥力、灰漠土中分别达到24.81%和15.24%。在高肥、土壤含水率小于20%的土壤条件下,4种拮抗细菌对棉花黄萎病的防病效果均较好,其中BHZ-29防效最高(87.12%),SMT-24防效最低(35.04%)。【结论】4株拮抗细菌在水分合适和施肥土壤中有很好的适应性,可维持一定数量和活性。     

棉花黄枯萎病拮抗菌株的筛选及抗菌蛋白的分离纯化研究

从棉花植株根部筛选的108株芽孢杆菌中,通过对棉花黄枯萎主要病原菌大丽轮枝菌拮抗效果的复筛,分离到一株LC-105菌株,其抑菌圈达到20 mm以上;本研究从该菌株的发酵代谢产物中,分离出活性拮抗物质,进一步通过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和Sephacryl-S100凝胶层析对其代谢产物进行了分离纯化,证明该拮抗物质为一种蛋白质,最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳证实了所分离物质的纯度达到电泳纯.     

棉花根部拮抗枯萎病菌或黄萎病菌的可培养内生细菌多样性分析

为解析棉花内生细菌的种群结构,更好地开发利用生防内生细菌,以棉花枯萎病菌、黄萎病菌为指示病原真菌,对常抗棉和泗棉3号根部分离获得的内生细菌进行拮抗活性筛选,获得87株至少对其中1个指示病原真菌具有拮抗作用的内生细菌。ARDRA分析(Amplified ribosomal DNA restriction analysis)和16S r DNA序列测定表明棉花根部可培养内生拮抗细菌可分为13个ARDRA类群,分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、农杆菌属(Agrobacterium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、不动杆菌属(Acinetobacter)和假单孢菌属(Pseudomonas)7个属。其中常抗棉根部内生拮抗细菌分属于芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属和农杆菌属,而泗棉3号根部内生拮抗细菌则分属于芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、中华根瘤菌属、不动杆菌属和假单孢菌属,二者的优势种群都是芽孢杆菌属细菌。BOX-PCR分析显示这些内生拮抗细菌具有丰富的遗传多样性。通过测定这些内生拮抗细菌对棉花黄萎病菌和棉花枯萎病菌的拮抗力大小,以及是否具有产纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶和嗜铁素的活性,表明这些内生拮抗细菌具有不同的生防作用机制。     

黄瓜白粉病的生防细菌筛选及鉴定

为开发黄瓜白粉病的生防资源,与三七根腐病菌、禾谷镰刀菌和柑橘炭疽病菌进行平板对峙培养,从25株黄瓜根际土细菌和91株烟草内生细菌中筛选出具拮抗功能的菌株;以盆栽试验从拮抗功能菌株中筛选能够防治黄瓜白粉病的生防菌株;用PCR扩增生防菌株的gyrB基因,结合菌株的菌落形态和部分生理生化特征,确定生防菌株分类地位。结果表明,在116株对峙培养细菌中,18株对三七根腐病菌、禾谷镰刀菌和柑橘炭疽病菌有较好拮抗效果。在盆栽试验中,烟草内生菌YN-201490和黄瓜根际菌株WL-1对黄瓜白粉病防效较好,其中YN-201490的1.81×10⁸ cfu/mL和WL-1的1.6×10⁸ cfu/mL稀释液连续施用3次后的防效分别达64.86%和61.26%。最终YN-201490被鉴定为枯草芽孢杆菌,WL-1被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。     

大丽轮枝菌拮抗细菌的分离与抗菌物质鉴定

从黄萎病发病棉田未发病棉株根际土样中分离芽孢杆菌,利用对峙培养法对大丽轮枝菌进行平板拮抗实验,筛选出6株对大丽轮枝菌有拮抗作用的芽孢杆菌,其中3株菌发酵代谢产物具有抗菌活性。S4-3菌株发酵液滤液经100℃、30min热处理丧失抗菌活性,发酵液氯仿抽提物不具有抗菌活性,发酵液硫酸铵沉淀物有抑菌活性,但经蛋白酶处理后活性丧失,认为S4-3菌株抑菌活性物质是蛋白质。而菌株S4-5发酵液经100℃热处理后还有较高的抗菌活性,发酵液氯仿抽提物也具有抗菌活性,但硫酸铵沉淀物对病原菌无抑制作用;S5-6菌株发酵液滤液经100℃热处理丧失抗菌活性,硫酸铵沉淀物也不具有抗菌活性,而发酵液氯仿抽提物有抗菌活性,因此认为S4-5和S5-6菌株产生的抑菌物质不是蛋白质类。     

棉花黄萎病拮抗细菌Bacillus subtilis ZL2-70抗菌蛋白的理化性质和抑菌机理

【目的】旨在研究棉花黄萎病拮抗细菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZL2-70抗菌蛋白的抑菌谱、理化性质以及抑菌机理,为棉花黄萎病生物农药的研制与开发奠定理论基础。【方法】采用抑菌圈法测定该抗菌蛋白的抑菌谱,以及温度、pH、无机离子、有机溶剂、蛋白酶对其稳定性的影响,并通过无菌小瓶等方法研究抗菌蛋白对大丽轮枝菌菌丝和孢子的抑制作用,测定了抗菌蛋白的纤维素酶和几丁质酶活力。【结果】棉花黄萎病拮抗细菌B.subtilis ZL2-70抗菌蛋白抑菌谱广,对19种植物病原菌表现出抑菌活性;该蛋白理化性质相对稳定,耐高温,在pH 5.0~10.0范围内抑菌活性较稳定,经EDTA处理后活性变化不大,对Fe3+敏感,对蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感;该抗菌蛋白对大丽轮枝菌的菌丝生长和孢子萌发有双重抑制作用,能使病原菌菌丝胞壁消融、原生质凝集渗漏、菌丝细胞泡囊化,并可抑制病菌孢子的萌发;抗菌蛋白具有纤维素酶和几丁质酶活性,且酶活力与抑菌活性有关。【结论】初步推断该抗菌蛋白通过多糖酶活力破坏大丽轮枝菌的细胞壁和抑制病原菌的孢子萌发而起到抑菌作用。     

人参灰霉病菌拮抗细菌菌株筛选及鉴定

从林下参叶片中分离内生细菌,以人参灰霉病菌为指示菌,筛选拮抗菌株,基于形态学特征和16S rRNA基因序列分析,对拮抗菌株进行鉴定。结果表明,从林下参叶片中共分离得到56株内生细菌,其中菌株FS-1对人参灰霉病菌具有很好的抑制作用。采用生长速率法测定菌株FS-1的发酵液对8种植物病原真菌均有抑制作用。该菌株具有很好的固氮作用,且能够分泌吲哚-3-乙酸(IAA)和产生胞外蛋白酶,IAA产量为4.25 mg/L。通过形态特征观察、生理生化测定和16S rRNA序列分析结果,将菌株FS-1鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。本研究表明菌株FS-1具有一定的生防潜力,可用于人参灰霉病的生物防治。     

“可防治棉花黄萎病的大丽轮枝菌弱毒菌株Vd171及其应用”等两个项目获发明专利

<正>日前从中国农业科学院棉花研究所传出好消息,近日,该所植保室朱荷琴博士研究团队喜获两项发明专利:棉花内生真菌CEF08111及其在棉花黄萎病防治中的应用和可防治棉花黄萎病的大丽轮枝菌弱毒菌株Vd171及其应用。据介绍,棉花内生真菌CEF08111及其在棉花黄萎病防     

生防细菌NCD-2中抑菌功能相关基因的定位及克隆

枯草芽孢杆菌NCD-2菌株是一株有效防治棉花黄萎病的细菌,它通过产生抑菌物质达到对大丽轮枝菌的抑制作用。以该菌株作为有效成分的微生物农药已通过国家农药登记。通过原生质体转化法将含有转座子mini-Tn10的质粒pHV1249转入枯草芽孢杆菌NCD-2中,获得转化子。对转化子通过高温诱导转座子转座,获得4 000个NCD-2菌株的突变子。对这些突变子进行对大丽轮枝菌的抑菌作用测定,筛选到2株抑菌作用增强的突变子和4株抑菌作用降低的突变子。采用染色体步移技术对此6个突变子中转座子插入位点基因的侧翼序列进行克隆和测序,结合枯草芽孢杆菌168菌株的全基因组序列对测序结果进行序列同源性和基因定位分析,结果表明:抑菌作用增强的2个突变子中,转座子插入到一个功能未知的基因内部,此基因与枯草芽孢杆菌168菌株中的yvoA基因的同源性为98%;抑菌作用降低的4个突变子中,转座子插入位点对应于枯草芽孢杆菌168菌株中的phoP基因内部,插入位点的侧翼序列与枯草芽孢杆菌168菌株中的phoP基因的同源性达到98%。     

番茄内生细菌种群动态分析及拮抗菌株的筛选

摘要：采用研磨组织稀释分离法对3个种植地区的番茄内生细菌的种群分布、数量变化规律进行了初步探讨。共分离、纯化得到内生细菌374株,经形态及理化特征鉴定,分属10个不同的属,13个种。其中假单孢菌属Pseudomonas sp.,黄单孢菌属Xanthomonas sp.;肠杆菌属Entenobacter sp.和芽孢杆菌属Bacillus sp.为优势种群。内生细菌在番茄植株种群数量从0.21x104 到13.82x104 cfu.g -1鲜重之间,但不同品种、组织、生育期及种植地,内生细菌的种群和数量各不相同,各组织中内生细菌的种群及数量根中最多,其次是茎和叶,成株期内生细菌无论种类和数量都明显高于苗期。采用平板对峙法从分离的内生细菌中筛选出对番茄灰霉病菌具有体外拮抗活性的菌株32个,占菌株总数的8.56%; 25个菌株对叶霉病菌有抑制作用,占菌株总数的6.68%;对灰霉病菌和叶霉病菌都具有拮抗作用的菌株20个,占菌株总数的5.35%。对灰霉病菌有强拮抗作用的菌株12个,对叶霉病菌有强拮抗作用的菌株仅1个,其中芽孢杆菌是主要的类群。     

生防细菌NCD-2突变体构建及抑菌功能基因的防病作用

生防细菌NCD-2是一株枯草芽孢杆菌菌株,该菌株通过分泌抑菌肽而对棉花黄萎病病原菌和棉花立枯病病原菌起到抑制作用。本研究着重通过原生质体法与诱导转座方法,建立了携带转座子Tn917质粒pTV1对枯草芽孢杆菌NCD-2野生菌株的转化体系与转座子突变技术,获得1500多个转座子插入突变子。通过测定这些突变子对大丽轮枝菌的抑制作用,筛选到2个抗生作用丧失的抑菌功能缺失的突变子。室内盆栽试验结果表明这2个抑菌功能缺失突变子对棉花立枯病的防效显著低于野生菌株,说明NCD-2野生菌株产生的抑菌肽在该菌株防治棉花立枯病中起到主要作用,进而说明编码该抑菌肽的基因在该菌株防治棉花立枯病中具有重要作用。     

辣椒内生菌的分离及拮抗菌的筛选与鉴定

用稀释分离法从健康辣椒植株的茎、叶、果肉中共分离得到植物内生菌88株,其中细菌有65株,真菌有21株,放线菌2株。用平板对峙法从中筛选出内生菌003和X两株对辣椒疫霉病菌、辣椒绿霉病菌、辣椒炭疽病菌3种病原菌具有明显拮抗作用的菌株,得出抑制率为34.80%～48.0%。根据菌株形态、生理生化特性对菌株003和菌株X进行了初步鉴定,结果显示菌株003和菌株X都为芽孢杆菌属(Bacillus)。