胰岛素、催乳素和孕酮对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

具有泌乳功能的乳腺上皮细胞系可作为乳腺发育学、乳腺病理学、泌乳生物工程学研究的细胞模型,本研究测定了激素对奶牛乳腺上皮细胞系泌乳功能的影响,为阐述泌乳机制提供工作基础。应用HPLC方法对体外培养奶牛乳腺上皮细胞的酪蛋白和乳糖的分泌情况和细胞培养液中的酪蛋白、乳糖含量进行测定,以确定胰岛素、催乳素和孕酮处理后的奶牛乳腺上皮细胞的泌乳功能。试验结果表明：奶牛乳腺上皮细胞具有酪蛋白和乳糖的分泌能力,在72h内,随着细胞培养时间延长,胰岛素处理组细胞中的酪蛋白和乳糖的升高趋势不明显,孕酮处理组升高趋势较明显,催乳素处理组升高趋势很明显;胰岛素处理组、催乳素处理组和孕酮处理组细胞培养液中酪蛋白升高趋势均很明显,乳糖含量均很高,三组激素比较而言,胰岛素处理组乳糖含量最高。此外,三组激素对乳腺上皮细胞活力影响均很大,在72h之内,总体变化为：催乳素处理组和孕酮处理组细胞活力均升高,胰岛素处理组细胞活力下降。     

漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞乳成分合成的影响

以体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞为模型,利用β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖/半乳糖检测试剂盒测定漏芦乙醇提取物处理的乳腺上皮细胞培养液中β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖含量;采用荧光定量RT-PCR检测β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖合成代谢相关酶和蛋白因子mRNA表达的变化。结果显示,25、50、100μg/ml的漏芦乙醇提取物以浓度依赖的方式显著提高乳腺上皮细胞合成分泌β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖含量(P<0.05)及乳腺上皮细胞中乳成分合成代谢相关酶和蛋白因子的mRNA表达水平(P<0.05)。实验结果表明漏芦乙醇提取物能促进奶山羊乳腺上皮细胞合成分泌β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖,并能提高乳腺上皮细胞乳成分合成代谢相关酶和蛋白因子的基因表达,进而影响奶山羊乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂和乳糖的合成。     

催乳素刺激牛乳腺中脂肪生成基因的表达但不刺激葡萄糖转运蛋白的表达

在泌乳开始时,葡萄糖转运蛋白(GLUT)和参与乳脂合成的一些酶的表达呈显著增加,本试验旨在研究催乳素是否刺激这些基因的表达。试验分为:无激素(对照组)、胰岛素样生长因子Ⅰ组、胰岛素(Ins)组、胰岛素+氢化可的松+羊催乳素(InsHPrl)组、胰岛素+氢化可的松+催乳素+17β-雌二醇(InsHPrlE)组,牛乳腺组织培养采用激素处理48、72和96h。试验采用实时荧光定量PCR检测β-酪蛋白、α-乳清蛋白和甾醇调节元件结合因子1(SREBF1)、脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰基辅酶A羧化酶(ACACA)、stearyol-CoA去饱和酶(SCD)、葡萄糖转运蛋白1、葡萄糖转运蛋白8和葡萄糖转运蛋白12的相对表达量。结果表明,催乳素混合组InsHPrl和InsHPrlE处理96h后,乳腺组织块中β-酪蛋白和α-乳清蛋白mRNA的表达增加了数百倍,同时也极显著提高了SREBF1、FASN、ACACA和SCD基因的表达(P<0.01)。然而,InsHPrl和InsHPrlE处理72h后,GLUT1或GLUT8表达量无明显变化,而GLUT12表达量显著降低了50%(P<0.05)。单一催乳素刺激组的小鼠乳腺上皮细胞系HC11或牛原代培养乳腺上皮细胞中,GLUTs表达不增加。此外,在催乳素刺激的奶牛乳腺中,GLUTs表达也无明显变化。说明在泌乳开始时,催乳素明显的增加了乳蛋白和脂肪生成基因的表达,但并没有显著上调GLUT基因的表达。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养及其生物学特性分析

旨在从奶牛乳腺组织中分离原代乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）并传代培养后探究其生物学特性。本研究从屠宰场采集健康泌乳奶牛乳腺并采用改进的酶消化法从乳腺中分离得到原代奶牛乳腺上皮细胞,通过形态学观察、免疫荧光以及染色体核型分析的方法对其进行鉴定。同时,研究第3、第6和第9代乳腺上皮细胞的生长曲线、群体倍增时间和冻存复苏活力,检测不同代次细胞分泌乳蛋白、乳脂、乳糖的功能及泌乳相关基因的表达。结果表明,所分离的奶牛乳腺上皮细胞纯度较好,细胞生长呈现S型,3个代次细胞的群体倍增时间依次为34.87、41.45和65.04 h,冻存复苏活力为88%~93%;在细胞分泌功能方面,诱导培养2 d后均能检测到酪蛋白、甘油三酯和乳糖,且各代次间无显著差异;此外,3个代次的细胞诱导后均能表达乳成分合成相关基因。本研究成功培养了原代奶牛乳腺上皮细胞,并证明直到第9代细胞仍然具有正常的生物学功能,为体外探究乳腺细胞增殖与分化机制提供了良好的试验材料和技术支撑。     

共培养体系下不同培养时间对奶山羊乳腺上皮细胞功能基因表达的影响

为提高奶山羊乳腺上皮细胞泌乳功能基因的表达量,采用分离培养至P_3代的1月龄健康萨能奶山羊乳腺上皮细胞和骨髓间充质干细胞并按2∶1的接种比例混合培养0、24、48、72、96、120、144和168 h(每个处理设置3个重复)后收集细胞,以QPCR检测各时间段SREBP、STAT5、FABP3基因的表达量,比较不同培养时间对奶山羊乳腺上皮细胞SREBP、STAT5、FABP3基因表达量的影响。结果表明:共培养体系下培养时间影响奶山羊乳腺上皮细胞中SREBP、STAT5基因的表达量,却对FABP3基因表达量没有影响。说明共培养体系下奶山羊乳腺上皮细胞与骨髓间充质干细胞混合培养72 h时乳腺上皮细胞泌乳功能基因的表达量最佳。     

激素及细胞因子对泌乳的影响及其调控

乳腺发育及泌乳过程是在机体内分泌系统严格控制下的复杂过程,受到多种激素和细胞因子的调控,包括催乳素(PRL)、生长激素(GH)、胰岛素(insulin)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、瘦素(leptin)等。催乳素是启动泌乳最关键的激素。GH对乳腺发育具有直接作用。胰岛素通过改变乳房外周的物质代谢调节乳腺的底物供应。IGF-1可促进细胞生长、分化和存活,从而维持泌乳细胞的数量和泌乳性能,是更直接的促进泌乳和维持泌乳因子。这些激素或细胞因子水平的变化不仅能够调控乳腺发育、启动泌乳以及维持泌乳等重要的生理过程,也直接影响乳产量及乳蛋白和乳脂肪的含量。论文综述了激素及其细胞因子对泌乳等的影响,并就其机制进行了探讨。     

miR-142-3p对奶山羊乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

为确定miR-142-3p对奶山羊乳腺上皮细胞泌乳功能的调节作用,试验选取泌乳期奶山羊乳腺上皮细胞为研究材料,利用脂质体转染技术抑制miR-142-3p的表达,采用实时荧光定量PCR、Western blotting、试剂盒等检测miR-142-3p基因沉寂后其对奶山羊乳腺上皮细胞泌乳功能的影响。结果显示,miR-142-3p基因沉寂后,奶山羊乳腺上皮细胞增殖能力增强,β-酪蛋白及甘油三酯分泌增加。由此可知,miR-142-3p通过抑制靶基因作用,影响奶山羊乳腺上皮细胞增殖、分泌β-酪蛋白及甘油三酯等泌乳功能。     

陕西不同地区不同泌乳时期奶山羊乳成分分析

试验旨在研究陕西三个不同地区不同泌乳时期的关中奶山羊乳常规营养成分的差异。选取健康,产奶量、体重及胎次接近的高产关中奶山羊139只(分别为凤翔县46只,淳化县50只,白水县43只)为研究对象,测定其乳脂率、乳蛋白、干物质、非脂固形物及乳糖的含量,从而对不同地区和不同泌乳时期山羊乳常规营养成分的相对含量进行对比。结果表明:3个地区奶山羊乳中乳脂率、乳蛋白、干物质和非脂固形物的含量差异不显著(P0.05)。随着泌乳时间的延长,各地区奶山羊乳中乳脂率、乳蛋白、干物质、非脂固形物均呈现出先下降后上升的趋势;乳中乳糖含量则随着泌乳时间的增加而呈现下降的趋势。这些结果对于统一不同地区羊奶的收购提供了一定的理论依据。     

崂山奶山羊乳腺上皮细胞系的建立及鉴定

实验采用组织块培养法、高密度培养和连续传代法等对崂山奶山羊乳腺上皮细胞进行培养、传代及鉴定。在对纯化的乳腺上皮细胞进行形态观察和生长动力学分析的基础上,进行染色体核型分析、免疫组化、质粒转染等方面的研究。结果表明:利用组织块培养法能够有效地进行崂山奶山羊乳腺上皮细胞的培养,并已传至40代,核型分析其染色体众数为60条,证明得到具有正常形态的崂山奶山羊乳腺细胞;进一步免疫组化显示培养细胞的波形蛋白、细胞上皮膜抗原、角蛋白和β-酪蛋白等上皮细胞标记蛋白呈阳性,证明该细胞为崂山奶山羊乳腺上皮细胞;最后油红染色可见到明显的脂肪滴,外源质粒PEGFP-N1-H-FABP能够稳定地在培养细胞中表达,表明所获得的细胞具有分泌功能。由此可见,利用组织块培养法能够成功建立崂山奶山羊乳腺上皮细胞系,并且所培养的乳腺上皮细胞具备一定的泌乳潜能。     

IGF-Ⅰ对奶牛乳腺上皮细胞乳脂和乳蛋白表达的影响

为了研究外源添加不同浓度的胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)乳脂和乳蛋白含量的影响,试验选取生长状态良好的第三代乳腺上皮细胞进行培养,试验组添加浓度分别为25,50,75μg/m L的IGF-Ⅰ,对照组仅添加与试验组等体积的完全培养基,用高效液相色谱法检测乳用三酰甘油的表达量,用Western-blot法测定培养12,24,48,72小时时的细胞乳蛋白中α-酪蛋白和κ-酪蛋白的表达量。结果表明:添加25μg/m L IGF-Ⅰ的试验Ⅰ组,细胞乳脂表达极显著高于对照组及其他试验组(P0. 01);试验组乳蛋白的表达均显著或极显著高于对照组(P0. 05或P0. 01)。说明IGF-Ⅰ对BMECs乳脂和乳蛋白的表达具有一定促进作用。