Collimonas sp.ZL261蛋白酶基因的克隆、表达及其酶学特性

分离自西藏色季拉山海拔4530 m高山草甸土壤的山冈单胞菌(Collimonas sp.)ZL261代谢产物具有很高的蛋白酶活性,为了明确其蛋白酶种类及其作用特点,本文采用限制性内切酶法构建了菌株ZL261的基因组文库,利用透明圈法筛选其胞外蛋白酶活性克隆,对其基因及蛋白结构进行了分析,进一步研究了该酶的表达和酶学特性。结果表明:该蛋白酶基因(命名为capro)包含一个长为1092 bp的完整开放阅读框(GenBank:KF992845),其编码蛋白由363个氨基酸组成;序列比对和同源性分析结果显示,该氨基酸序列与食真菌山冈单胞菌(Collimonas fungivorans)Ter331胞外蛋白酶序列(NC015856)相似性最高,为83%;一级、二级和三级结构分析均显示该蛋白含M35金属蛋白酶家族(EC 3.4.24.20)保守结构域。蛋白酶基因在大肠杆菌DH5α中异源表达获得了约38 kDa的目的蛋白。ZL261粗酶液对金属蛋白酶抑制剂EDTA敏感,最适作用pH值为7,最适温度30℃,在10℃时仍保持70%以上酶活力。综合分析可知,该蛋白酶为中性低温金属蛋白酶。具有较好的开发应用潜能。研究结果为微生物蛋白酶的开发提供了新型种质资源,也为探求不同生境微生物蛋白酶的系统进化关系提供了基础信息。     

菌寄生真菌黄蓝状菌(Talaromyces flavus)几丁质酶基因的克隆与生物信息学分析

菌寄生真菌的几丁质酶有很强的降解几丁质能力,在控制植物病害方面起着重要的作用.为克隆和研究菌寄生真菌黄蓝状菌(Talaromyces flavus)几丁质酶基因(tfchi1),本研究根据真菌几丁质酶基因的保守序列设计扩增基因中间片段的简并引物,采用RT-PCR、3'-RACE及5+-TAIL的方法获得了该基因的DNA和mRNA序列(GenBank:GU361769,GU361770).tfchi1长为2 561 bp,具有6个内含子,长度分别为129、78、68、65、53和59 bp,包含1 194bp的ORF,编码一个由397个氨基酸组成的蛋白.推导的tfchi1氨基酸序列以及蛋白质结构生物信息学分析表明,该蛋白具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGGW和DGXDXDWE,属于糖苷水解酶18家族几丁质酶,与柄篮状菌(Talaromyces stipitatus ATCC 10500)几丁质酶(XP_002480365)氨基酸序列同源性为96％,分子量为43.47kD,等电点为4.97.该蛋白无信号肽序列,有15个潜在的N-糖基化位点,Tfchi1的二级结构以无规卷曲和α-螺旋为蛋白的主要结构元件,三级结构中有(α/β)8的圆桶形结构.tfchi1转化毕赤酵母(Pichia pastoris )GS 115,酵母工程菌可分泌具几丁质酶活性的表达产物,重组蛋白的分子量与理论值相符.结果说明,本研究已从T.flavus中正确克隆了1个糖苷水解酶18家族几丁质酶基因.     

海洋细菌QDC01的鉴定及其几丁质酶基因的克隆与分析

海洋微生物是几丁质酶的重要来源。本研究从青岛海域海蜇(Rhopilema esculenta)体中分离到一株产几丁质酶的细菌QDC01,通过形态、培养特征以及16S rDNA序列同源性分析,将该菌株鉴定为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。根据已报道的嗜水气单胞菌几丁质酶基因相关序列设计引物,克隆了QDC01几丁质酶基因,命名为ahchi(GenBank:JX863407)。应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析,结果显示,ahchi开放阅读框(ORF)长2 100 bp,无内含子,其编码的蛋白由699个氨基酸组成,分子量为74.875 kD,等电点为5.81。序列比对和同源性分析结果表明,该基因与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila subsp.hydrophila)ATCC 7966T几丁质酶基因(GenBank登录号:CP000462)的相似性最高,为98%;相应的氨基酸序列同源性为98%。系统进化分析以及Ahchi的保守结构域分析表明,Ahchi属于Ⅰ型几丁质酶,糖苷水解酶19家族。采用限制性内切酶(BamHⅠ和HindⅢ)双酶切法构建了原核表达载体pET-30a(+)-ahchi,并经IPTG诱导在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功表达。在基础产酶发酵条件下,菌株QDC01所产粗酶液酶活力达0.21 U/mL,采用文献报道的优化产酶发酵条件,菌株QDC01所产粗酶液酶活力可达0.58 U/mL,是前人报道的产几丁质酶嗜水气单胞菌SWCH-6所产酶活力的1.49倍,同时也高于已报道的气单胞菌(Aeromonas sp.)CJ-5的酶活力(0.41 U/mL),为微生物源几丁质酶开发应用提供了又一优良种质资源。     

龙眼成花逆转相关基因表达的cDNA-AFLP分析

摘要：以龙眼正常成花花芽和成花逆转花芽为试材,应用cDNA-AFLP技术,研究龙眼正常成花与成花逆转花芽cDNA的差异表达,并利用RT-PCR技术验证,探讨了龙眼成花逆转的分子机制。通过64对引物组合的cDNA-AFLP分析获得了2 560条扩增片段。选择其中有明显差异的片段进行回收、测序,获得了14条核苷酸序列。其中有13个片段在GenBank数据库中发现同源序列,1个功能未知。通过核酸和氨基酸比对分析,与龙眼成花逆转相关的112基因片段同源于银灰杨（Populus tremula x Populus alba）中编码Nek激酶家族(NIMA related protein kinases)基因（83 ％）, 331的核苷酸序列（80％）同源于与拟南芥（Arabidopsis thaliana）中编码内切-1,4-β-葡聚糖酶(EGases)的基因,313的核苷酸序列（78%）同源于与柑橘（Citrus sinensis）中的几丁质酶（chitinase CHI1）基因。     

鹅生长激素基因的克隆和组织表达

根据鸡的生长激素基因(GH)序列设计引物对鹅总RNA进行RT-PCR反应，将扩增片段进行克隆和测序。结果获得了包括从ATG开头到TGA结尾的651bp的鹅GH基因编码区序列。鹅与鸡的GH基因的编码区高度保守，同源性达92％，演译成氨基酸后同源性达96％；与人和鼠GH基因编码区序列同源性分别为63．81％和74．31％，演绎成氨基酸后同源性分别为52．51％和72．81％。同时用RT-PCR和Northern-blot对鹅12种组织表达差异分析表明鹅GH基因只在垂体和下丘脑中表达。在心脏、肺、肝脏、小肠、胃、腿肌、脾、肾脏、脂肪和睾丸中都不表达。     

青稞OMT1基因克隆及原核表达分析

类黄酮O-甲基转移酶(FOMT)是一种在植物甲基化黄酮代谢合成中有着重要作用的酶,但在中国青藏高原的特色作物青稞中研究较少。为了更好了解该酶及编码基因在青稞中的生理功能及作用,以高总黄酮青稞品系94-19-1为材料,通过RT-PCR扩增、克隆得到青稞OMT1基因的ORF序列。结果表明,该基因ORF长1 071 bp,编码356个氨基酸,预测蛋白分子量为38.65 KDa,等电点为5.33。序列比对分析发现,所克隆的基因与NCBI数据库收录的大麦Hv OMT1基因有99.44%的一致性,氨基酸序列存在5个残基差异,编码的蛋白序列具有OMT蛋白家族典型的保守结构域。进一步将该基因连接到原核表达载体转化大肠杆菌,最终成功将该基因所编码的蛋白在大肠杆菌诱导表达,并利用亲和层析柱分离技术,将该表达蛋白进行了纯化。这为进一步研究该酶蛋白功能和选育高品质青稞品种奠定了基础。     

草地螟中肠肉碱-脂酰肉碱转位酶基因(LstiSLC25)的克隆及表达

利用甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)围食膜多克隆抗体免疫筛选草螟(Loxostege sticticalis)中肠cDNA表达文库,得到编码肉碱-脂酰肉碱转位酶(LstiSLC25)基因的全长cDNA克隆.该cDNA克隆全长1 474 bp(GenBank登录号EU924506),开放阅读框长897 bp,编码299个氨基酸,预测分子量和等电点分别为32.1 kD和9.46.序列含有3个典型的溶质运转重复结构,具有溶质运载蛋白家族的典型特征.将该基因与pET30载体重组后,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli获得了表达.     

嗜水气单胞菌aer毒素基因的克隆及核苷酸序列分析

以自行分离的嗜水单胞菌分离株AHCS02为研究对象,分析其产生的aer毒素基因结构.根据GenBank中aer毒素的基因序列（M16495）,设计扩增编码aer毒素成熟蛋白基因的引物,以AHCS02的基因组DNA为模板,PCR扩增出长度为1 332 bp的核苷酸片段,进行pMD18-T载体克隆.酶切鉴定后进行序列测定和分析,结果表明扩增的片段与M16495的同源性达92%,将测得的序列登录GenBank数据库,所得的序列编号为AY136943.分析推导其核苷酸编码的氨基酸序列显示：其编码443个氨基酸,为aer毒素成熟蛋白的基因,与M16495相比,氨基酸差异主要集中在422氨基酸残基至436氨基酸残基的位置上,在这个位置上共有8个氨基酸残基发生变化,其中在435和437氨基酸残基之间有一个氨基酸密码子丢失,氨基酸的同源性达95.5%.证明aer毒素基因的5＇端保守,3＇端变异较大.     

内生解淀粉芽胞杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglS)的克隆与表达及酶学特性分析

β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶普遍存在于植物内生芽胞杆菌中,为了探讨其功能,以内生解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TB2菌株基因组为模板,克隆了β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因(bglS).测序结果表明,该基因的ORF全长732 bp,编码一条243个氨基酸的蛋白,理论分子量约为27.33 kD,等电点约为6.89,其ORF序列已登录GenBank(Accession No.EU368224).Blast同源性分析结果表明,该基因的ORF序列与植物互作生防解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens FZB42,GenBank Accession No.CP000560)的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因核苷酸序列的一致性达97.3%,氨基酸序列的一致性达97.1%.将β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因全长克隆至pUC18载体上,利用基因自身的启动子构建重组表达载体pUC-bglS,并导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中表达.SDS-PAGE分析表明,BL21::pUC-bglS菌株表达了27 kD左右的蛋白;该酶的最适反应温度为55℃,在50℃以下保温60 min后残余80%以上酶活;最适反应pH为6.2,在pH4.4～6.8 4℃保温30 min残余85%以上的酶活;Ca2+和Fe肛可提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性,而Cu2+、Zn2+、Mg2+和Mn2+对其活性具有显著的抑制作用.实验结果为进一步研究植物内生解淀粉芽胞杆菌TB2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的功能和应用打下了基础.     

含粘质沙雷氏菌几丁质酶SchiA基因的植物转化质粒pBGll12构建和水稻遗传转化

将一个2．8kb的CaMV35S启动子／SchiA编码区／Nos终止区融合基因插入到植物转化载体pCAMBIAl301的多克隆酶切位点,得到1个14．6kb的新植物转化质粒pBGlll2,用花器介导法转化水稻(Oryza sativa),经PCR检测,初步证实已将目的基因整合到受体植物的基冈组中。一部分转基因T3代潮霉素抗性阳性植株对水稻纹枯病(Rhizoctonia solani)和稻瘟病(Pyricularia oryzae)的抗性较非转化对照增强。RT—PCR表明抗病性植株为阳性,而不抗病的植株为阴性。将RT—PCR产物测序后,用BLAST软件分析序列可知,该序列为细菌几丁质酶基因核苷酸序列而不是植物几丁质酶基因的核苷酸序列。T4代转基因水稻的几丁质酶活力高于对照未转基因植株,表明转入的外源几丁质酶基因能正常表达。     

含粘质沙雷氏菌几丁质酶SchiA基因的植物转化质粒pBG1112构建和水稻遗传转化

摘要:将一个2.8 kb的CaMV35S启动子/SchiA编码区/Nos终止区融合基因插入到植物转化载体pCAMBIA1301的多克隆酶切位点，得到1个14.6 kb的新植物转化质粒pBG1112,用花器介导法转化水稻（Oryza sativa ），经PCR检测，初步证实已将目的基因整合到受体植物的基因组中。一部分转基因T3代潮霉素抗性阳性植株对水稻纹枯病(Rhizoctonia solani )和稻瘟病（Pyricularia oryzae）的抗性较非转化对照增强。RT-PCR表明抗病性植株为阳性，而不抗病的植株为阴性。将RT-PCR产物测序后，用BLAST软件分析序列可知，该序列为细菌几丁质酶基因核苷酸序列而不是植物几丁质酶基因的核苷酸序列。T4代转基因水稻的几丁质酶活力高于对照未转基因植株，表明转入的外源几丁质酶基因能正常表达。     

黄冠梨几丁质酶基因家族cDNA全长序列克隆与分析

根据已知植物几丁质酶基因序列的保守区域,设计特异性引物,以梨黄冠品种叶片为材料,提取RNA,进行反转录,克隆获得5个几丁质酶基因cDNA片段,进一步通过RACE技术获得该基因的全长cDNA序列,依次命名为PyChi1、 PyChi2、 PyChi3、 PyChi4、 PyChi5,序列提交GenBanK,登录号为：FJ589783、 FJ589784、 FJ589785 、 FJ589786、FJ589787。序列分析结果表明,所获得5个几丁质酶基因,都具有完整的ORF和Poly(A)结构,与其他植物几丁质酶基因具有较高的相似性;5个基因的核酸序列的同源性约在35%~53%之间,PyChi1和PyChi4的氨基酸同源性最高,约85%,而与PyChi5约77%;在几丁质酶基因家族,分别属于Chitinase ClassesⅠ-Ⅴ,为5个不同类型的成员;不同类型的几丁质酶基因在核酸和氨基酸序列以及功能结构方面都存在着存在着显著的差异,主要表现在肽链特性和基因结构等方面。这为进一步研究梨几丁质酶的结构和功能奠定了基础。     

哈茨木霉A25-2纤维二糖水解酶I基因的克隆及其编码催化功能域的序列在绿色木酶HP35-3中的表达

本研究从哈茨木霉（rrichoderma harzianMm）A25—2总RNA中利用RT—PCR的方法扩增到其纤维二糖水解酶I基因的cDNA序列,并对该基因编码的氨基酸序列进行分析,得到cbhI基因中编码催化功能域的序列。将催化功能域编码序列克隆到表达载体pCP—GH中,用PEG—CaCl2介导的原生质体转化方法将重组质粒转化到绿色木霉（Trichoderma viride）HP35—3中,筛选得到12个转化子。以P-NPC为底物,测定了该12个转化子的酶活力,获得比活力最高的转化子Tv／CDHI-CBM-5,其纤维二糖水解酶活力是HP35—3的3．8倍。SDS—PAGE分析表明,绿色木霉表达了导入的含A25—2纤维二糖水解酶I催化功能域的编码序列。     

水稻几丁质酶基因的克隆及序列分析

采用ＰＣＲ技术从水稻基因组ＤＮＡ中扩增出２个编码几丁质酶基因片段ＲＣＨ１０和ＲＣＨ８,片段大小分别为１０２３ｂｐ和９７６ｂｐ。将ＰＣＲ产物直接做ＮＤＡ序列分析,证明扩增出的２个片段具有编码Ⅰ类几丁质酶的基本结构,即（１）Ｎ－端信号肽区;（２）ｈｅｖｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ结构区;（３）可变间隙区;（４）催化结构区。其中ＲＣＨ１０的核苷酸序列与文献报道相比同源性为９７％,氨基酸序列同源性为９３％;ＲＣＨ     

猫白介素-18基因的分子克隆、序列分析及其表达研究

根据GenBank中报道的猫白介素-18基因（IL-18）序列，对用ConA刺激的实验猫外周血单核细胞（PBMCf）进行了RT-PCR扩增；将扩增得到的PCR产物纯化后克隆入pMD18-T中得到重组质粒pTIL-18，进行核苷酸序列测定，并与不同物种的IL-18基因进行了序列比较。结果该基因全长579bp，编码192个氨基酸。在推导的猫IL-18氨基酸序列中，无信号肽序列和潜在的N-联糖基化位点，但存在4个Cys残基。与不同物种IL-18相比，猫IL-18与犬、羊、牛和猪IL-18核苷酸和推导的氨基酸序列有较高的同源性，与小鼠和鸡IL-18有明显的种属差异。将pTIL-18双酶切，回收目的基因片段亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-18，转化大肠杆菌BL21（DE3），并用IPTG进行了诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为27.5 kDa的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描，目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。     

Overlap-PCR克隆秦川牛HCRTR1基因及其在大肠杆菌中的表达分析

通过Overlap-PCR方法克隆了秦川牛的HCRTR1基因编码区全长,获得1278 bp编码区全长序列,将其克隆至pMD-18T载体上,经测序表明获得的cDNA序列与GenBank公布的序列同源性均为98%。提取阳性克隆的质粒经BamHI和HindⅢ双酶切后,回收到1278 bp的目的片段,定向克隆到pET32a（+）表达载体上,连接产物转化Bl21(DE3)感受态大肠杆菌,对长出的菌落进行菌落PCR和质粒酶切鉴定正确后,用IPTG诱导目的蛋白的表达。SDS-PAGE表明秦川牛HCRTR1基因在大肠杆菌中不表达,生物信息学分析表明,HCRTR1基因的表达产物为具有7个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体,可能是此类蛋白在原核系统的表达将会影响细菌本身存活,因此原核表达系统也成为研究此类蛋白的瓶颈。     

含两种抗真菌基因植物表达载体的构建

近年来,植物抗真菌病害基因工程研究日益受到重视．并取得了显著进展,目前主要是通过转几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因来提高这两种酶在植物体内的表达水平,以此增强抗真菌病害的能力。体外抑菌实验表明：β-1,3-葡聚糖酶能够抑制某些真菌的生长,而一旦与几丁质酶共同作用时,其抑菌作用会大大增强。本实验将几丁质酶和葡聚糖酶     

丝瓜多酚氧化酶PPO基因家族的克隆与表达分析

多酚氧化酶(PPO)是参与酚类物质氧化的主要酶类之一,在果蔬褐变中发挥重要作用。为探究丝瓜中PPO基因家族的功能,以闽丝3号丝瓜为试验材料,通过转录组测序和RT-PCR方法获得了3个丝瓜PPO基因家族的c DNA序列,依次命名为Lc PPO1(Gen Bank登录号为KM506756)、Lc PPO2(Gen Bank登录号为KR819890)和Lc PPO3(Gen Bank登录号为KX092429);Lc PPO1基因全长2 026 bp,包含一个1 794 bp的ORF,编码598个氨基酸;Lc PPO2基因全长2 071 bp,ORF为1 722 bp,编码574个氨基酸;Lc PPO3基因全长2 189 bp,ORF为1 779 bp,编码593个氨基酸;3个基因均无内含子,其编码的蛋白与甜瓜、黄瓜同源蛋白的相似性较高。生物信息学分析表明,3个基因编码的酶蛋白均无信号肽,无跨膜结构域,为亲水性稳定蛋白,Wolf Psort预测其亚细胞定位于叶绿体。Lc PPO具有PPO蛋白的典型特征,分别具有PPO1-DWL、PPO1-KFDV 2个结构域和一个能够结合2个铜离子(Cu A、Cu B)的中央域酪氨酸酶。实时荧光定量PCR分析显示,Lc PPO家族的3个基因在丝瓜根、茎、叶、花和果实中均有表达。在丝瓜采后储藏期间,3个PPO基因初期表达上调,后期表达量受到抑制;在丝瓜鲜切条件下,Lc PPO1和Lc PPO2基因表达量总体呈先上升后下降趋势,Lc PPO3基因鲜切后表达量均低于采后0h。Lc PPO基因家族基因表达、PPO活性、总酚与丝瓜褐变关系密切,其中Lc PPO1、Lc PPO2在普通丝瓜果肉褐变过程中可能发挥着重要作用。本研究结果为进一步揭示丝瓜褐变的发生机理和丝瓜品种遗传改良奠定了一定的理论基础。     

茶树海藻糖-6-磷酸合成酶基因(CsTPS)的克隆及表达分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶.目前,TPS基因的研究多数集中于细菌和真菌等,而对植物的研究较少.本实验通过对茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)全器官转录组文库序列比对,获得一条与其他物种同源性较高的编码TPS基因的EST序列,通过RACE扩增后获得茶树TPS基因cDNA全长序列,命名为Cs TPS(GenBank登录号JQ742017).该基因cDNA全长3 125 bp,包含一个2799 bp的开放阅读框,编码932个氨基酸.多序列比对分析结果表明,Cs TPS基因编码的蛋白具有明显的TPS和TPP两个结构域.系统进化分析表明,其编码的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)和番茄(Solanum lycopersicum)等植物的TPS同源性较高,且CsTPS与拟南芥TPS1(AtTPS1)的同源性高于TPS2(AtTPS2)和TPS3(AtTPS3).qPCR分析显示,CsTPS基因在茶树不同组织器官中呈现差异性表达.低温诱导促使老叶和嫩叶中的CsTPS基因上调程度明显大于根系,表明CsTPS基因可能参与了茶树抗寒机制.     

诸葛菜OvCYP86MF基因的克隆及其特性分析

为进一步阐明细胞色素P450基因CYP86MF在诸葛菜发育中的分子机理,本文根据已知同源基因保守序列设计特异引物,利用RT-PCR和RACE技术从诸葛菜中获得一个细胞色素P450基因(OvCYP86MF)全长cDNA序列,该序列全长为1876bp,含有1605bp的完整开放阅读框,可编码534个氨基酸,分子量和等电点分别为61.4kDa和6.90,具有细胞色素P450蛋白的典型特征,即保守结构域FNAGPRLCIG;原核表达显示该基因的融合蛋白在体外可以诱导表达;DANSTAR和Clustal W软件分析表明该基因的全长cDNA序列及其编码氨基酸序列与十字花科物种拟南芥相似性很高,达到80%以上,亲缘关系最近;与CYP86C亚家族成员在氨基酸水平上的相似性均高于50%,因此推断该基因属于CYP86C这个亚家族。Northern杂交分析表明该基因在花蕾中特异表达。