中国少棘蜈蚣与家蚕和野桑蚕肌球蛋白轻链2的结构功能分析比较

从中国少棘蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans)毒腺cDNA文库中克隆的肌球蛋白轻链2(MLC2)基因的cDNA,其开放阅读框为606 bp(GenBank登陆号为FJ262953),编码201个氨基酸,与家蚕(Bombyx mori)和野桑蚕(Bombyxmandarina)的MLC2等长,序列一致性达52%。3种MLC2都包含:1个同位且完整的EF-H功能域和Ca2+结合位,1个N端poly-lys基序及相同的丝氨酸磷酸化修饰位点。三级结构预测显示中国少棘蜈蚣MLC2的三维结构相似于乌贼(Loligo pealei)的同源模型,而家蚕和野桑蚕的则与淡色库蚊(Culexpipiens pallens)的MLC2一样类似于扇贝(Aequipecten irradians)的同源结构。分析结果有助于进一步研究家蚕和野桑蚕MLC2的结构功能及其功能应用。     

野桑蚕羧酸酯酶基因(BmmCarE-2)的克隆及表达分析

羧酸酯酶参与昆虫对有机磷和氨基甲酸酯等杀虫剂抗性的产生。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆了一个野桑蚕羧酸酯酶全长基因(BmmCarE-2)。序列分析表明该基因包含1个1 623 bp的开放读码框,有57 bp的cDNA5′端非翻译区序列(5′UTR)和79 bp的cDNA3′端非翻译区序列(3′UTR),编码540个氨基酸,GenBank登录号为EU328351。序列比对分析表明BmmCarE-2与家蚕羧酸酯酶基因BmCarE-2(GenBank登录号:DQ311250)的氨基酸序列相似性最高,达98.9%。利用半定量RT-PCR进行组织表达分析表明,BmmCarE-2在野桑蚕幼虫的头部和脂肪体表达量较高,在丝腺和中肠稍低,而在血液中的表达量最低。     

老挝家蚕线粒体cox3基因序列分析及分子进化研究初探

对老挝家蚕品种L11的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)cox3基因(cox3)进行PCR扩增、克隆和序列分析。结果表明,在测定的909bp的片段中,含有ATPase 6基因及tRNA-Gly基因的部分序列和cox3全序列。其中,cox3读码框包括789个核苷酸,编码262个氨基酸。L11 cox3和已经公布的家蚕(中国家蚕品种夏芳、日本家蚕Aojuku、韩国家蚕Backojam)mtDNAcox3基因完全一致,但与日本野桑蚕、中国野桑蚕的氨基酸同源性分别为99%和98%。     

野桑蚕钠离子通道蛋白基因Bmmpara的克隆与选择性剪接

昆虫的钠离子通道蛋白是许多神经毒性药物的作用靶标。根据家蚕钠离子通道蛋白基因(GenBank登录号:EU688970)序列设计引物,分段RT-PCR克隆了野桑蚕钠离子通道蛋白基因Bmmpara(GenBank登录号:EU688972)。序列分析表明,Bmmpara基因的cDNA长5553bp,编码1851个氨基酸,与家蚕基因组序列比对,存在34个外显子,其中第2、22、27外显子存在选择性剪接。根据Bmmpara序列和家蚕基因组序列设计引物,采用PCR方法克隆到3段野桑蚕基因组序列,长度分别为1632、536和3220bp。进一步将Bmmpara编码氨基酸序列与野桑蚕基因组比对,发现有a(ENDLGRTKKKK)、b(GL-KAALCGRCVSS)、c(SLINFVAALCGAGGIQAFKTMRTLRALRPLRAMSRMQGMRV)3个选择性微外元,可能存在6种选择性剪接,构成野桑蚕钠离子通道蛋白不同亚型。     

中国野桑蚕滞育激素基因的克隆与序列分析

根据家蚕DH PBAN基因序列设计特异引物 ,以中国野桑蚕基因组DNA为模板进行PCR扩增 ,获得了1 5 85kb的目的片段 ,将其克隆进pMD18 T载体 ,测序和同源性比较结果表明 :该片段由 3个外显子、2个内含子组成 ,2个内含子均为典型的GT AG结构 :该片段编码中国野桑蚕滞育激素 (DH)及DH引导肽 ;中国野桑蚕DH及引导肽与家蚕及日本野桑蚕的DH及引导肽氨基酸序列完全相同 ,其基因cDNA序列的同源性分别为 99 3%、97 2 %。研究结果进一步显示了中国野桑蚕与家蚕之间的近缘关系。     

基于mtDNA ND1基因的家蚕进化分析

对中国青州野桑蚕mtDNA中ND1基因进行了克隆和序列分析。结果显示,野桑蚕ND1基因全长为933bp,编码310个氨基酸残基,A+T含量较高,达78.7%;同源性分析显示,不同来源的家蚕和野蚕ND1基因在核苷酸水平和氨基酸水平具有很高的相似性;以ND1基因的核苷酸序列及氨基酸残基序列进行了家蚕及野桑蚕的分子进化分析,进一步证明家蚕起源于中国野桑蚕。用mtDNA的ND1基因的核苷酸序列Blast家蚕的基因组序列,发现家蚕基因组中存在与ND1基因部分区域同源的序列,表明家蚕基因组中存在起源于线粒体的假基因。     

中国野桑蚕抗病毒蛋白基因(Lipase)的克隆与活性鉴定

从中国野桑蚕幼虫中肠细胞克隆获得了抗家蚕核型多角体病毒BmNPV的脂肪酶基因(Lipase)cDNA(GenBank:AY945212)。该基因cDNA大小906 bp,编码301个氨基酸,蛋白质分子质量约为28.9 kD。进一步克隆了其全长基因组,结果表明该基因由2 147 bp组成,包含4个外显子和3个内含子。该基因在野桑蚕体内的表达具有组织特异性,仅限于野桑蚕中肠组织表达,且在幼虫龄中表达水平较高,而在幼虫眠期和熟蚕期几乎没有表达。通过基因体外表达获得的重组蛋白Lipase,能够有效抑制BmNPV病毒对家蚕的感染,说明该蛋白具有较强的抗BmNPV的生物学活性。     

家蚕真核翻译起始因子3f基因结构与表达研究

在对家蚕5龄丝腺cDNA文库测序的过程中,发现一个编码家蚕翻译起始因子基因(eIF3f)的EST序列。利用电子克隆、3′RACE(3′rapid amplification of cDNA ends)方法克隆了家蚕eIF3f基因cDNA序列全长,命名为eIF3f(GenBank登录号为DQ868530)。家蚕eIF3f基因cDNA全长为1 009 bp,由870 bp的开放阅读框序列(openreading frame,ORF)、55 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和65 bp的3′端非编码区序列(3′-UTR)组成,编码289个氨基酸。氨基酸序列比较分析显示,家蚕eIF3f与其他物种的eIF3f都具有翻译起始功能所必需的JAB_MPN结构域。家蚕eIF3f基因组结构分析:该基因由5个外显子和4个内含子组成;5′调控序列存在E74A、DFD、DRI等多个潜在的转录因子结合位点,但没有TATA盒启动子序列。家蚕eIF3f基因的表达在不同组织和不同发育时期存在差异,eIF3f是一种负调控翻译起始因子。研究结果有助于进一步研究真核翻译起始因子的相关基因调控规律。     

野桑蚕细胞色素P450家族CYP4M5基因的克隆和诱导表达

细胞色素P450单加氧酶系在生物体对外源化合物的代谢和内源化合物的调节中都起着非常重要的作用,昆虫对杀虫剂产生抗性与单加氧酶系介导的代谢反应有关。以野桑蚕(Bombyxmandarina)中肠为材料,依据家蚕(Bombyxmori)基因组P450基因预测序列设计一对引物,采用RT-PCR方法克隆了一个P450家族基因的cDNA序列,命名为CYP4M5(GenBank登录号:EU273876)。序列分析表明,野桑蚕CYP4M5基因编码区长度为1 512 bp,编码503个氨基酸,相对分子质量约为58 kD,等电点7.8。同源性分析表明该基因与家蚕CYP4M5的同源性最高,达97.42%。分析鉴定了该基因在野桑蚕各组织中的mRNA表达水平以及溴氰菊酯诱导24 h后mRNA的表达水平,结果显示:在正常野桑蚕幼虫体内,CYP4M5在脂肪体中的表达水平最高;野桑蚕经5 ng/μL溴氰菊酯药液处理后,CYP4M5在中肠和脂肪体中表达量分别增加1.1倍和4.4倍。推测该基因可能参与野桑蚕对杀虫剂的解毒代谢作用。     

野桑蚕性信息素结合蛋白(PBP)亚家族基因的克隆与进化分析

蛾类的性信息素信号传递是研究昆虫化学通讯的模型,性信息素结合蛋白(pheromone-binding protein,PBP)亚家族是研究热点之一。克隆了野桑蚕PBP亚家族的3个基因,命名为pbp1、pbp2、pbp3(GenBank登录号:GQ246497、GQ468569、GQ468570)。分析野桑蚕和家蚕pbp基因的编码区,发现碱基突变主要以转换为主(14/18),氨基酸变异主要为同义突变(16/18),成熟蛋白质的理化性质变化小,二级结构无变化,推测野桑蚕向家蚕的进化过程中PBP亚家族的基因功能没有变化。对具有PBP亚家族3个已知基因的6个昆虫物种进行氨基酸遗传距离和同源性分析,结果表明野桑蚕和家蚕间PBP1、PBP2、PBP3的遗传距离分别为0、0.02、0,同源性分别高达100%、98.6%和100%,物种间基因的进化速率很慢,进化分析显示PBP亚家族在这几个物种分化前已经产生。     

野桑蚕线粒体ND5基因及其两端侧翼tRNA基因的克隆与序列分析

应用PCR技术,对中国山东青州野桑蚕mtDNA的ND5基因及其两端侧翼区域进行了克隆和序列分析。结果表明,在所测定的2．2kb左右的片段中,含有ND5基因的完整序列及Phe-tRNA(UUC)、Ser-tRNA(AGC)、Glu- tRNA(GAA)、His-tRNA(CAC)等4个tRNA基因,该片段的基因组结构与家蚕及其它地域来源野桑蚕的基因组结构基本一致,显示蚕类线粒体基因排列的保守性。ND5结构基因在不同家蚕及野桑蚕之间的比对分析表明,它们在核苷酸水平、氨基酸水平的同源性很高,相似性达96%以上。4个tRNA基因的碱基错配率较高,TψC环缺乏相对保守的T-ψ-C-Pu-A序列,各臂的碱基配对数、各环碱基数目变化较大。以ND5基因的核苷酸序列及氨基酸残基序列进行了家蚕及野桑蚕的分子进化分析,进一步证明家蚕起源于中国野桑蚕。     

中国野桑蚕和日本野桑蚕的RAPD研究

用RAPD PCR技术初步研究了中国野桑蚕与日本福冈野桑蚕之间的DNA多态性。结果表明 ,不同地域中国野桑蚕个体之间及其与日本福冈野桑蚕个体之间均呈现出丰富的DNA多态性。中国野桑蚕同家蚕共有带率达 3 5 5 % ,同日本福冈野桑蚕为 4 5 1% ,而日本福冈野桑蚕同家蚕为 3 2 % ;中国野桑蚕与家蚕的平均遗传距离为0 5 2 ,日本野桑蚕与家蚕的平均遗传距离为 0 6 3,与中国野桑蚕的为 0 5 8,而且与中国沈阳地区野桑蚕之间的遗传距离最近 ,为 0 4 8,以此创建了它们的系统进化树。     

野桑蚕和家蚕的环境适应性比较研究

野桑蚕和家蚕对不同组分人工饲料的食性比较研究表明 ,野桑蚕不取食无桑叶粉的人工饲料 ,4 8h不出现疏毛现象 ,其食性较家蚕单一。以完成虫态的积温研究二者对气象环境的适应性 ,发现野桑蚕对气象环境的适应性较家蚕强 ,野桑蚕完成不同虫态所需的有效积温较稳定。对野桑蚕和家蚕添食农药和紫外辐照处理 ,结果表明野桑蚕对不良的环境的耐受性较家蚕强 :添食相同浓度的农药 ,家蚕全部中毒死亡 ,而野桑蚕却部分存活 ,且正常化蛹 ;紫外线辐照可使野桑蚕提前老熟营茧     

几种绢丝昆虫遗传多样性的RAPD研究

选用重复性较好的 10个引物对 6种绢丝昆虫 2 3个个体进行扩增 ,共得到 2 45个RAPD标记。RAPD分析结果表明 :家蚕及野桑蚕种内各品种材料的遗传距离较大 ,天蚕、蓖麻蚕及柞蚕较小 ;家蚕与野桑蚕两者之间遗传距离小 ,反映出家蚕和野桑蚕亲缘关系较近 ;而天蚕、蓖麻蚕和柞蚕三者之间以及分别与家蚕和野桑蚕之间的遗传距离较大 ,亲缘关系远。聚类分析的结果与之相同。并且对家蚕的起源及绢丝昆虫遗传多样性的保护利用做了探讨。     

野桑蚕12S rRNA基因的克隆及序列分析

通过PCR技术,对中国山东青州野桑蚕mtDNA的12SrRNA基因进行了克隆和序列分析。结果表明,青州野桑蚕12SrRNA基因为788nt,在DNA水平上,与家蚕12SrRNA基因的同源性达到99%,与中国陕西安康、日本筑波来源的野桑蚕12SrRNA基因的同源性分别为97%、98%;分子进化分析显示,家蚕可能是起源于中国野桑蚕。