柑橘中黄龙病菌效应子SDE70的表达特征及寄主互作蛋白解析

柑橘黄龙病菌主要致病种亚洲种（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’，Las）具有完整的Sec依赖型分泌系统，可分泌致病因子（效应子）作用于寄主靶标蛋白或基因，调控寄主的抗（感）病反应。为了研究黄龙病菌Sec依赖型效应子在柑橘中的致病机理及其寄主靶标基因，本研究中从感病‘锦橙’中克隆了Las病原菌Sec依赖型效应子基因SDE70（CLIBASIA_02470）。生物信息分析显示，SDE70蛋白全长132个氨基酸，N端20个氨基酸为典型信号肽。大肠杆菌碱性磷酸酶活性分析显示，该信号肽具有胞外分泌功能。亚细胞定位显示，SDE70::GFP融合蛋白在洋葱细胞质和细胞核中积累。定量PCR分析发现，耐黄龙病酸柚显症叶脉中SDE70表达量显著低于未显症叶脉，相反，易感黄龙病‘锦橙’显症叶脉中表达显著高于未显症叶脉；‘锦橙’根中SDE70表达量显著高于叶脉，而幼叶叶脉中显著低于老叶。SDE70在不同品种不同症状发育时期以及不同组织中表达差异显著。利用酵母双杂交试验筛选获得26个与SDE70互作的柑橘蛋白。GO富集分析表明，42.3%的蛋白质与细胞内生物合成过程有关；65.4%的靶标蛋白位于细胞质或质膜上；34.6%的靶标蛋白具有核糖核苷酸结合的分子功能。进一步酵母点对点杂交试验验证3个与SDE70效应子强相互作用的靶标蛋白（CsTRAPP、CsARF、CsRub1），其主要参与植物囊泡转运、类泛素化等过程，暗示SDE70效应子极有可能调控柑橘信号转导和胞质运输途径影响寄主抗（感）病反应。     

黄龙病菌胁迫下‘锦橙’CsCalS5表达和胼胝质沉积的初步分析

胼胝质合成酶是控制胼胝质合成的关键酶,在植物生长发育和抗逆胁迫中具有重要作用。克隆并分析‘锦橙’胼胝质合成酶基因CsCalS5及其启动子序列,实时荧光定量PCR检测CsCalS5的组织表达模式以及植物生长调节剂、黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的诱导表达模式,并通过组织切片观察感染黄龙病和柑橘溃疡病‘锦橙’叶脉胼胝质的沉积。结果显示,CsCalS5启动子序列中含有脱落酸和病原菌的响应元件;CsCalS5编码1952个氨基酸含有保守结构域FKS1和β-1,3-葡聚糖合成酶功能域的跨膜蛋白;CsCalS5在‘锦橙’的茎中高表达,且受脱落酸的诱导;黄龙病菌侵染后叶脉韧皮部的胼胝质沉积明显,患病叶片CsCalS5的表达量是健康对照的4.02倍;柑橘溃疡病菌侵染叶片后,叶脉韧皮部胼胝质沉积无明显增加,且CsCalS5的表达量与健康对照无显著差异。综上,黄龙病菌可能通过上调‘锦橙’CsCalS5的表达促进韧皮部胼胝质的沉积,从而增强其防御能力,且这种抗性可能受到脱落酸的调控。     

柑橘响应黄龙病侵染的韧皮部蛋白2基因CsPP2B15的克隆与表达分析

黄龙病病原菌诱导柑橘筛孔胼胝体过度积累是其致病的一个重要因素。柑橘韧皮部蛋白（Phloem Protein,PP）在筛孔胼胝体积累中起着重要作用。为研究柑橘韧皮部蛋白响应黄龙病亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas）侵染的功能,克隆获得了一个响应黄龙病侵染差异表达的PP基因CsPP2B15的编码区和长1.5 kb的启动子序列,并以高感品种锦橙和耐病品种酸柚老叶和嫩叶为材料,进行基因表达分析。结果发现,CsPP2B15在高感品种锦橙嫩叶中受CLas诱导显著上调表达,而在耐病品种酸柚嫩叶中受CLas诱导显著下调表达,且在叶肉中的表达量显著高于叶脉。嫩叶和嫩梢被认为是柑橘响应黄龙病侵染的早期原初侵染部位。因此,CsPP2B15可能在CLas侵染柑橘早期中起重要作用。CsPP2B15启动子的顺式作用元件预测分析发现,CsPP2B15启动子含有许多与逆境和激素有关的顺式作用元件。进一步构建了CsPP2B15启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色和GUS酶活性测定均表明,CsPP2B15启动子具有较强的韧皮部组织特异性。     

杧果细菌性角斑病病原菌XC01菌株的全基因组测序及序列分析

【目的】由柑橘黄单胞菌杧果致病变种引起的杧果细菌性角斑病是杧果生产上的重要病害,解析杧果细菌性角斑病病原菌(柑橘黄单胞菌杧果致病变种)XC01菌株的基因组序列信息,为深入研究病菌的致病机制提供序列背景信息。【方法】利用PacBio RS II测序平台对柑橘黄单胞菌杧果致病变种XC01菌株进行全基因组测序,并对测序数据进行序列拼接、基因预测与功能注释、COG/GO聚类分析等。【结果】柑橘黄单胞菌杧果致病变种XC01菌株整个基因组大小为3 865 165 bp,GC含量为68.9%,编码3 442个蛋白基因,共有3 297个基因具有明显的生物学功能,其中150个基因参与碳水化合物代谢,582个基因参与到寄主与病原互作机制中。序列提交至GenBank数据库,登录号为CP016836。【结论】本研究首次报道了杧果细菌性角斑病病原菌的全基因组序列,分析了基因组的基本特征,初步解释了该菌株致病的关键基因,为深入开展该病菌侵染植物的作用机制提供重要的理论基础。     

响应黄龙病侵染的柑橘乙醇脱氢酶基因CsADH1的克隆与表达分析

对前期在感染黄龙病的‘晚锦橙’中发现的明显差异表达的柑橘乙醇脱氢酶（CsADH1）基因进行克隆测序分析，结果表明，CsADH1 的 CDS 序列长为 1 143 bp，编码 380 个氨基酸。蛋白质结构预测显示，CsADH1 含有乙醇脱氢酶 GroES（ADH_N）和 ADH_zinc_N 保守结构域。进化树分析显示，CsADH1 蛋白与拟南芥、蓖麻和中国莲的 ADH 蛋白亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示，CsADH1 蛋白定位在细胞质中。以感病‘晚锦橙’的根和叶脉为材料，qPCR 分析显示 CsADH1 在感病根和叶脉中均上调表达，且根中的表达水平是叶脉中的 10 倍。离子胁迫试验和外源植物生长调节剂诱导试验表明，Zn、水杨酸（SA）、生长素（IAA）和脱落酸（ABA）均显著诱导 CsADH1 上调表达，并且根中的表达水平明显高于叶中。本结果表明，CsADH1 可能在柑橘根响应黄龙病菌侵染中起着重要作用。     

柑橘黄龙病菌侵染对‘纽荷尔’脐橙组织结构的影响

【目的】了解‘纽荷尔’脐橙受柑橘黄龙病菌侵染后植株组织微形态结构的变化,以便进一步探明柑橘黄龙病对寄主的破坏特点及作用机制。【方法】通过电镜扫描、石蜡切片等技术观测感染柑橘黄龙病和健康脐橙的叶片、果蒂组织微形态结构,利用紫外可见分光光度计测定二者叶片光合色素、丙二醛(MDA)含量和过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性变化,分析柑橘黄龙病侵染对寄主组织结构和生理生化的影响。【结果】柑橘黄龙病菌侵染后的脐橙叶片厚度变薄、气孔萎缩,栅栏组织细胞由长条形变为椭圆形、细胞间隙增大、排列松散,果蒂的韧皮部部分维管束堵塞。患病叶片的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量分别是健康叶片的19.87%、22.13%和47.71%,MDA含量增加了120.39%,POD、CAT和SOD酶活性显著提升。【结论】柑橘黄龙病菌侵染后植株叶片叶绿素含量降低,严重影响光合作用,同时细胞受损程度加大,寄主抵御病原菌入侵和扩展能力减弱。     

柑橘黄龙病菌在寄主体内含量动态变化研究

【目的】探索柑橘黄龙病流行规律,可以为果园柑橘管理提供指导,对延长柑橘黄龙病树的经济寿命具有重要意义。【方法】利用TaqMan qPCR荧光定量检测技术,从2017年8月至2018年10月监测江西赣州柑橘果园中黄龙病病原物的时间动态变化,结合气候数据分析柑橘黄龙病病原物与气候之间的相关性。【结果】柑橘黄龙病亚洲种含量年动态变化中,2017年8—11月和2018年5—7月有2个高峰,2018年4—5月和2018年7—8月会有2个低谷,整体呈现树冠北面枝条病菌含量高于南面,且症状严重程度与病菌含量呈反比。气候数据分析柑橘黄龙病菌含量与月下雨天数和月平均最高气温无相关性。【结论】果园中柑橘黄龙病亚洲种含量变化呈现一定规律消涨趋势,与以往的研究结果有相同之处,在10月存在高峰;柑橘体内亚洲种含量变化与温度和下雨天数这2个气候因子无相关性。     

赣州橘园根系内生丛枝菌根真菌群落多样性鉴定及其受黄龙病菌侵染的影响

【目的】鉴定赣州橘园黄龙病菌侵染和健康柑橘根系内生丛枝菌根真菌(AMF)的多样性,并明确黄龙病菌的侵染对于AMF群落的影响。【方法】使用AMF 18S小亚基核糖体特异引物AMV4.5NF/AMDGR对黄龙病菌侵染和健康柑橘根系DNA扩增建库,通过454高通量测序和生物信息学分析挖掘赣州橘园根系AMF多样性及其受黄龙病菌侵染的影响。【结果】从赣州橘园的柑橘根系中鉴定到80个AMF种,其中包括44个已知的AMF种和36个新种。进化分析发现,球囊霉属AMF占总AMF数的78.75%,是赣州柑橘根系内生AMF群落的优势菌属。鉴定到类球囊霉属的12个AMF,其中Paraglomus.N2和Paraglomus.N7的丰度位于总AMF的第二和第三,说明类球囊霉属AMF在赣州柑橘AMF群落中占有重要地位。PCoA分析表明黄龙病菌侵染显著改变了柑橘根系AMF的群落结构,而AMF群落的α多样性指数无显著性变化。通过丰度差异分析鉴定到6个在黄龙病菌侵染后丰度差异显著的AMF种,表明黄龙病菌侵染可能通过改变AMF菌种组成和相对丰度来影响其群落结构。【结论】全面揭示了赣州橘园根系内生AMF多样性,并且黄龙病菌侵染可通过改变菌种组成和相对丰度来影响AMF群落结构。     

柑橘响应黄龙病菌侵染的NAC基因的克隆及表达分析

挖掘柑橘抗黄龙病（Huanglongbing,HLB）基因是抗病育种的基础和关键。以感染黄龙病菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas)早期（2个月）锦橙根和叶片中脉比较转录组数据为基础，筛选到9个响应柑橘黄龙病侵染诱导的NAC基因，从中选3个差异表达水平较高的基因克隆，分别命名为Cs NAC21/22、Cs NAC68和Cs NAC78。生物信息分析表明3个基因均符合NAC基因家族的特征；烟草亚细胞定位结果表明，Cs NAC68定位在细胞核，Cs NAC21/22和Cs NAC78定位在细胞核和细胞质。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明，3个候选基因在易感HLB的锦橙、耐病的马蜂柑和高耐病的九里香的组织和病原菌诱导表达特征呈现明显差异。以健康植株为对照，Cs NAC68和Cs NAC78主要在锦橙的根中响应CLas感染，显著上调表达，Cs NAC68在九里香叶肉和马蜂柑根中响应CLas感染，显著上调表达；Cs NAC21/22主要在锦橙根和马蜂柑叶肉中显著下调表达。以‘锦橙’叶片为试材通过q RT-PCR分析候选基因响应SA、J...     

柑橘黄龙病相关水杨酸羧基甲基转移酶基因CsSAMT-1的克隆与表达分析

为研究水杨酸羧基甲基转移酶(Salicylic acid carboxyl methyltransferase,SAMT)在柑橘防御黄龙病(Huanglongbing,HLB)中的作用,克隆获得Cs SAMT~(-1)基因,并以易感HLB锦橙和耐HLB酸柚为试材进行基因表达分析。q RT-PCR结果表明,易感病锦橙中CsSAMT~(-1)在感染HLB后上调表达,且在叶脉中的表达量显著高于叶肉;而耐病酸柚中CsSAMT~(-1)呈组成型表达。外源水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理锦橙和酸柚,均可诱导CsSAMT~(-1)上调表达。HLB侵染前,耐病酸柚叶脉中SA和水杨酸甲酯(MeSA)含量分别为11.85和18.18 ng·g~(-1),显著高于锦橙(0.82和0.01 ng·g~(-1));HLB侵染后,锦橙中SA和MeSA含量明显上升,酸柚中SA含量明显下降,MeSA含量基本保持原有水平。研究表明,Cs SAMT~(-1)可能通过调节SA和Me SA信号分子转换来增强对柑橘黄龙病的抗性。     

盐胁迫下枣叶片蛋白质组差异的分析

【目的】为了探明盐胁迫下枣蛋白表达的差异,【方法】以较耐盐碱的‘七月鲜’枣品种的扦插苗为材料,经过临界浓度(0.60%)的钠盐(NaCl)处理,取其叶片进行蛋白质双向电泳,经ImageMaster 2D分析,【结果】结果表明,处理与对照之间总蛋白的整体分布模式非常相似,在pH 3~10和MW50~90 kD内的蛋白点分布最多,处理与对照之间量变倍数大于1.5倍的差异点有26个,其中6个蛋白受胁迫上调,20个蛋白受胁迫下调。在上调的蛋白质点中,3个点受盐胁迫诱导增加了近4倍,2个蛋白质点相对丰度增加了2倍以上,表现出强烈的盐诱导特性。说明他们可能在枣的抗盐机制中发挥重要作用。在下调的蛋白质点中,2个点相对丰度降低至对照的5倍左右,表现出强烈的盐抑制特性,说明其可能是对盐胁迫比较敏感的2个蛋白质或多肽,并且在枣的抗盐性机制中也发挥比较重要的作用。【结论】在临界浓度钠盐胁迫下,枣叶片蛋白质表达有显著差异。     

湖北海棠植物络合素合酶MhPCS基因克隆及表达分析

【目的】为了探明植物络合素酶参与植物解毒重金属的作用,【方法】以湖北海棠(Malus hupehensis)为试材,克隆其植物络合素合酶基因(MhPCS)编码区序列,并研究该基因的表达特点。【结果】结果表明MhPCS基因编码区全长为1 494 bp,编码497个氨基酸。序列分析表明,MhPCS编码的氨基酸序列由2个典型的植物络合素合酶亚家族结构域组成,具有3个相邻的Cys-Cys元件(331-332、351-352和369-370位氨基酸)和植物络合素合酶蛋白的特征位点(Cys-56、Cys-90/91和Cys-109)。【结论】湖北海棠MhPCS与杜梨PbPCS蛋白同源性最高(94%),属于系统发生树的同一分支。MhPCS基因为组成型表达,各器官表达水平存在差异,其中根的表达量最高;100μmol.L-1CdSO4处理48 h内,MhPCS基因的表达量迅速上升;不同金属离子对其上调表达的诱导能力为:Cd2+>Cu2+>Pb2+。这为揭示重金属胁迫下湖北海棠环境适应的分子机制奠定了基础。     

苹果褪绿叶斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

【目的】为了制备苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的抗血清,【方法】将ACLSV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因克隆到原核表达载体pEHISTEV和pEHISEGFPTEV,转化大肠杆菌Rosetta,切胶回收诱导表达的CP融合蛋白免疫新西兰长耳兔,制备ACLSV的抗血清。【结果】利用原核表达载体pEHISTEV和pE-HISEGFPTEV在Rosetta中分别表达出了分子质量为25 ku和55 ku的ACLSV CP融合蛋白。切胶回收25 ku的融合蛋白免疫新西兰长耳兔。经ELISA测定,所制备的抗血清效价为1∶1 024,Western blot及组织印迹分析表明抗血清能与ACLSV CP发生特异性的免疫反应。【结论】该血清特异性强,效价高,可用于苹果叶片、果实和枝条等样品中A-CLSV的检测。     

铁肥虹吸输液方法对矫正苹果缺铁失绿症的影响

【目的】为了探索苹果叶片缺铁失绿矫正新方法,【方法】通过田间试验和盆栽试验,分别研究了铁肥虹吸输液对矫正苹果缺铁失绿症的影响,铁肥虹吸输液和强力高压注射对叶片和根中铁含量的影响及铁在树体内的运输与分布。【结果】结果表明,铁肥虹吸输液能够在较短时间内使黄化的叶片复绿,显著增加叶片中叶绿素含量。虹吸输液增加叶片中铁含量显著多于强力高压注射,强力高压注射增加根中铁含量显著高于虹吸输液,虹吸输液铁肥靠叶片蒸腾拉力进入树体,强力高压注射的铁肥靠压力进入树体。【结论】铁肥虹吸输液是矫正苹果缺铁失绿症一种新的高效、简单易行方法。     

应用2D-DIGE技术分析柑橘衰退病毒诱导的甜橙差异表达蛋白

【目的】为了研究柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)诱导甜橙差异表达蛋白的分离和鉴定,【方法】以接种了CTV的甜橙植株为实验组,健康植株为对照组,利用双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术分析CTV诱导的甜橙差异表达蛋白。【结果】以t检验P<0.05和相对表达量≥1.5的水平作为判别标准,获得了91个CTV诱导的差异表达蛋白点,在实验组中含量高于对照组的蛋白56个,含量低于对照组的蛋白35个。通过MALDI-TOF质谱分析成功鉴定从中选择的37个蛋白点,其中19个蛋白功能明确,16个为预测或假定具有某种蛋白功能,包括与抗氧化相关的硫氧还蛋白、铁氧还蛋白、超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化酶,与代谢相关的磷酸甘油酸酯水解酶、木葡聚糖内糖基转移酶、变味蛋白,分子伴侣热激蛋白,折叠酶肽酰脯氨酰顺反式异构酶,以及与光合代谢相关的蛋白等。【结论】CTV的侵染影响到甜橙各种复杂的生物学过程。