稳定表达猪传染性胃肠炎病毒N蛋白的ST细胞株的构建及其亚细胞定位

为研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N蛋白的表达对宿主细胞功能的影响,本研究通过构建TGEV N基因的重组表达质粒p EGFP-N,将其转染于猪睾丸(ST)细胞中,并在活细胞状态下直接观察GFP-N蛋白在ST细胞中的表达与定位。结果显示,转染后4 h~5 h出现荧光蛋白表达,24 h达到高峰,TGEV的N蛋白主要定位于细胞质中,进一步的激光共聚焦共定位显示TGEV N蛋白主要定位于ST细胞的内质网上面。以G418筛选4周后,转染细胞形成稳定的细胞株,RT-PCR和western blot验证TGEV N蛋白的m RNA及其蛋白在ST细胞中稳定表达,提示本研究建立了稳定表达的TGEV N蛋白的ST细胞株,为进一步研究TGEV N蛋白对ST细胞的生理功能的影响及其在TGEV致病过程中的作用奠定了基础。     

猪氨基肽酶N病毒结合受体核心区对TGEV在ST细胞中复制影响的研究

为研究与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)结合的猪氨基肽酶N (pAPN)受体核心区对TGEV复制以及细胞功能的影响，本研究检索并分析p APN与TGEV的结合位点，结果显示，敲除p APN aa668～aa963对其酶活性无影响。因此，利用CRISPR/Cas9技术构建p APN与TGEV结合位点敲除细胞系，经PCR和western blot鉴定结果显示，正确构建一株敲除p APN aa668～aa963的ST细胞系，即敲除p APN 15-21外显子，命名为KO-ST-15。采用CCK-8和细胞划痕方法检测KO-ST-15细胞的增殖和细胞迁移活性，结果显示，敲除p APN 15-21外显子对ST细胞增殖和迁移活性均无显著影响。利用RT-q PCR和IFA检测KO-ST-15感染TGEV后病毒复制拷贝数和N蛋白的表达，结果显示，敲除p APN 15-21外显子可极显著抑制TGEV在ST细胞系中的复制(P<0.001)。利用RT-q PCR检测KO-ST-15感染TGEV后炎症相关基因转录水平变化，结果显示，TGEV感染后KO-ST-15中的IL-6、IL-8和NLRP3 (NOD-...     

猪传染性胃肠炎病毒ORF7蛋白在ST细胞中定位及其对病毒复制影响的研究

为研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)ORF7蛋白的亚细胞定位及其在TGEV复制中的作用。本研究通过RT-PCR扩增TGEV ORF7基因,将其与真核表达载体pEGFP-C1和pEGFP-N1相连接,构建表达载体pGFP-ORF7(GFP融合在TGEV ORF7的-NH2端)和pORF7-GFP(GFP融合在ORF7的-COOH端)。分别将这两个质粒转染至ST细胞,western blot检测融合蛋白GFP-ORF7和ORF7-GFP的表达。通过生物信息学分析和激光共聚焦确定TGEV ORF7蛋白的亚细胞定位。在此基础上,通过细胞病变观察和荧光定量PCR检测TGEV ORF7蛋白对TGEV复制的影响。结果显示,本研究正确构建了真核表达载体pGFP-ORF7和pORF7-GFP,western blot检测结果表明融合蛋白GFP-ORF7和ORF7-GFP均正确表达,TGEV ORF7蛋白大小约为9 ku;结合生物信息学分析和激光共聚焦共定位结果显示TGEV ORF7特异性的定位于ST细胞的内质网中,其定位和其N端的信号肽序列有关;荧光定量PCR检测结果显示,过表达ORF7蛋白后TGEV mRNA转录水平降低99%,表明ORF7蛋白参与调控TGEV的复制。本研究为TGEV ORF7蛋白功能的研究提供了参考依据。     

猪热休克蛋白40(Hsp40)的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

克隆猪热休克蛋白40 (heat shock protein 40,Hsp40)基因并构建其原核表达载体,以纯化的猪Hsp40蛋白为抗原免疫兔制备抗猪Hsp40多克隆抗体。参照GenBank收录的猪Hsp40全基因序列,设计1对特异性扩增其CDS区全序列的引物,利用RT-PCR方法扩增猪Hsp40基因;扩增产物经双酶切后定向克隆至原核表达载体pCzn1-His,测序无误后转化Arctic Express (DE3) RP感受态高效表达宿主菌,优化其表达条件(时间、IPTG浓度、温度)后,将可溶性的猪Hsp40重组蛋白用His-Band Ni^+层析柱进行纯化,用纯化的His-Hsp40重组蛋白免疫兔以制备多克隆抗体。采用抗原亲和纯化法对制备的多抗进行纯化,并采用间接ELISA法检测抗体效价。利用Western blot检测重组蛋白的免疫原性和反应原性,以及抗体的特异性。结果显示,克隆得到的猪Hsp40基因片段长度为1 485 bp,表达出的可溶性His-Hsp40重组蛋白相对分子质量约为57 800,制备出的猪Hsp40蛋白多克隆抗体效价为1∶512 000,且该多抗能够特异性识别His-Hsp40重组蛋白和猪肺泡巨噬细胞中的Hsp40蛋白。结果表明,成功克隆了猪Hsp40基因,表达并纯化了猪Hsp40蛋白,制备的兔抗猪Hsp40蛋白多克隆抗体能够有效地应用于猪Hsp40蛋白抗原的检测。     

猪圆环病毒2b型Cap蛋白多克隆抗体制备及其生物学特性分析

为了使猪圆环病毒2b型(PCV2b)Cap蛋白在猪圆环病毒病等疾病的诊断和防制方面取得更有效的应用,本试验将编码PCV2b Cap蛋白的ORF2基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,并构建pET-32a-ORF2重组质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21受体菌后,通过IPTG诱导表达重组蛋白,将重组蛋白用镍柱进行纯化并免疫大白兔,制备兔抗PCV2b Cap蛋白的多克隆抗体。利用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光及病毒交叉反应等试验对制备的多克隆抗体进行生物学特性检测。ELISA检测结果显示,该抗体效价可达到1:2¹⁶;Western blotting检测结果显示,该多克隆抗体可与PCV2b产生特异性的反应条带,说明其具有较好的反应活性;间接免疫荧光试验结果显示,该多克隆抗体能识别感染PK-15细胞中的PCV2b,说明该多克隆抗体具有鉴别诊断PCV2b的能力;病毒交叉试验结果显示,该多克隆抗体能与PCV2b反应,而不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PRoV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等猪源病毒发生交叉反应,表明该多克隆抗体具有高度特异性。本试验制备的抗PCV2b Cap蛋白多克隆抗体为PCV2b病原特性研究及该病的临床检测奠定基础。     

化脓隐秘杆菌溶血素蛋白的原核表达及其溶血活性鉴定

为研究化脓隐秘杆菌致病机制及其病原学诊断方法,本研究克隆了编码化脓隐秘杆菌溶血素蛋白的plo基因,并构建重组表达质粒pET-plo,转化大肠杆菌Rosetta (DE3)感受态细胞中诱导表达.SDS-PAGE检测结果显示,表达的重组蛋白约为62 ku,western blot分析表明表达的重组蛋白可以与鼠抗化脓隐秘杆菌血清发生反应.采用重组蛋白免疫新西兰白兔制备的多克隆抗体效价达到1∶128 000,western blot和琼脂双扩散试验表明制备的多克隆抗体能够与天然PLO蛋白发生反应.溶血试验表明重组蛋白能够溶解红细胞,制备的多克隆抗体能有效中和重组蛋白的溶血活性.     

猪NLRP3蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

为了获得猪源NLRP3重组蛋白以及针对猪NLRP3蛋白的多克隆抗体,本试验采用原核表达技术对猪源NLRP3蛋白的主要抗原区域进行了截短表达与鉴定,并以重组蛋白为免疫原免疫兔制备兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体。结果显示,经RT-PCR方法扩增到大小为864 bp的NLRP3蛋白的主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-32α原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导获得了大小为50 000的重组蛋白;重组蛋白经纯化后Western blot检测其可与抗His标签单克隆抗体发生特异性反应;以纯化蛋白为免疫原制备的兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体的抗体效价达1∶25 600,Western blot检测其可与NLRP3重组蛋白发生特异性反应。结果表明,获得了具有良好反应活性的NLRP3重组蛋白与多克隆抗体,为研究NLRP3蛋白的结构与功能、NLRP3蛋白与猪炎症性疾病的相互作用机制奠定了基础。     

利用番鸭整合素α4亚基多克隆抗体对MDRV感染雏番鸭淋巴细胞归巢的研究

为研究番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染鸭后肠淋巴细胞归巢中的细胞定位,本研究通过RT-PCR方法扩增番鸭肠道α4编码基因,构建重组表达质粒p ET-His-α4,将其转化E.coli BL21 (DE3)表达了r His-α4,以其为抗原免疫福建黄兔,制备了抗r His-α4多克隆抗体,该多克隆抗体的间接ELISA和琼扩效价分别为1∶52 000和1∶32。利用制备的多抗对MDRV感染的番鸭淋巴细胞进行western blot和间接免疫荧光检测,结果显示体外淋巴细胞在感染MDRV后,α4蛋白的表达量呈增长趋势;雏番鸭感染MDRV后盲肠的α4+淋巴细胞增加的同时CFSE+淋巴细胞也显著增加,表明MDRV感染后诱导淋巴细胞大量表达了α4整合素,导致淋巴细胞向肠道黏膜组织归巢。本研究制备的番鸭r His-α4兔源多克隆抗体可以用于番鸭整合素α4的检测,同时也为进一步阐明MDRV感染诱导淋巴细胞归巢的分子机制研究奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒陕西分离株S蛋白抗原位点的真核表达

猪传染性胃肠炎(TGE)是严重危害全世界养猪业健康发展的一种高度传染性病毒病,其病原猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的S蛋白携带有主要的B淋巴细胞识别的抗原决定簇,是诱导机体产生保护性中和抗体的主要抗原。本研究以提取的TGEV陕西分离株感染的ST细胞的RNA为模板,采用RTPCR方法扩增编码S蛋白上包含C、B、D、A 4个抗原位点的基因片段,将目的片段连接到真核表达载体pcDNA3.1/V5-HisB上,构建重组表达载体,转染293T细胞后,通过Western blot检测目的基因的表达。结果成功克隆到编码S蛋白C、B、D、A 4个抗原位点的基因片段,以TGEV阳性猪血清和抗His标签单抗的Western blot结果均显示,目的基因在293T细胞中获得表达。本研究为TEG核酸疫苗的研制奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因在昆虫细胞中的表达

为获得具有天然活性的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组S蛋白,制备针对猪传染性胃肠炎S蛋白A、D抗原位点的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本研究将TGEV S基因A、D抗原位点经PCR扩增并克隆入p Fast Bac HBM-TOPO载体,经转座、转染后获得重组杆状病毒,并对重组杆状病毒进行间接免疫荧光(IFA)及Western blot分析,结果显示,TGEV S基因A、D抗原位点在杆状病毒中成功表达,其表达产物为TGE诊断试剂的制备、基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

抗猪传染性胃肠炎病毒重组S蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组S蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,间接ELISA方法进行筛选和有限稀释法3次克隆,获得2株稳定分泌抗TGEV重组S蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为C7C882和B5G8G7,其染色体平均计数均为88±10对,制备腹水抗体效价分别为1:2×105和1:104,分泌抗体亚类均为IgM型.2株杂交瘤细胞上清与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪伪狂犬病病毒(PrV)均无交叉反应,与TGEV感染细胞经间接免疫荧光检测均呈黄绿色荧光.     

火鸡组织滴虫ME 1基因的原核表达及其定位分析

为研究火鸡组织滴虫(Histomonas meleagridis)胞质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)依赖性苹果酸酶(ME 1)的抗原性及其在火鸡组织滴虫中的定位，本研究根据本实验室前期对火鸡组织滴虫ME 1基因的测序结果设计引物，以虫体cDNA为模板，经RT-PCR扩增火鸡组织滴虫ME 1 (HmME 1)基因，结果显示Hm ME 1基因全长1 182 bp，将其克隆至p ET28a(+)构建重组表达载体后转化BL21 (DE3)，经IPTG诱导表达后，利用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白r Hm ME 1，经SDS-PAGE和western blot鉴定，结果显示，r Hm ME 1以可溶形式存在，相对分子量约为46 ku，且纯化的r Hm ME 1条带单一，浓度为0.4 mg/mL。将该纯化的r Hm ME 1免疫小鼠，制备该重组蛋白的鼠抗血清(多克隆抗体)，采用间接ELISA方法检测多克隆抗体的效价，结果显示制备的多克隆抗体效价为1∶409 600。采用western blot分别检测r Hm ME 1与制备的鼠源r Hm ME 1阳性血清和鸡源火鸡组织滴虫阳性血清的反应...     

口蹄疫病毒3C蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

扩增口蹄疫病毒(FMDV) 3C蛋白编码基因,将其克隆到原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达; 3C重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,通过ELISA和Western blot检测多克隆抗体的效价和特异性,并将该抗体通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot应用于3C的检测。ELISA结果显示,制备的3C蛋白多克隆抗体效价达1∶256 000; IFA结果显示,该抗体能够检测到3C蛋白在细胞中的定位; Western blot结果显示,该多克隆抗体能够检测到在细胞中过表达的3C蛋白。本研究制备的FMDV 3C蛋白多克隆抗体为FMDV及其3C蛋白的相关研究提供了重要的物质基础。     

猪肺炎支原体P52蛋白的原核表达及抗血清制备

为表达猪肺炎支原体(Mhp)P52蛋白及制备其血清,本实验利用PCR从Mhp J株扩增P52基因,克隆到表达载体pET-30a中,获得重组质粒pET-P52,经IPTG诱导,通过SDS-PAGE和western blot检测重组蛋白表达及其免疫学活性.以该重组蛋白为抗原免疫兔制备抗血清,采用间接ELISA检测抗血清效价,并利用抗血清通过间接免疫荧光检测P52基因在AD-293细胞中的表达情况.结果表明,PCR扩增目的基因为1 202 bp,SDS-PAGE检测重组蛋白大小约52 ku,其表达量占菌体总蛋白的28%.Western blot检测表明,目的蛋白能与Mhp阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫活性.间接免疫荧光检测到P52基因在AD-293细胞中表达.本研究为构建P52蛋白腺病毒载体疫苗奠定了基础.     

猪Lp-PLA2多克隆抗体制备

制备猪脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)多克隆抗体,有利于研究猪Lp-PLA2与炎症发生的相关性。本试验利用基因克隆技术构建猪Lp-PLA2原核表达载体,表达重组蛋白,并对表达条件进行优化;使用Ni-NTA树脂亲和层析纯化该蛋白质,免疫家兔,制备猪Lp-PLA2多克隆抗体;并用western blot对获得的抗体进行免疫检测。电泳结果显示猪Lp-PLA2原核表达载体构建成功;SDS-PAGE结果表明,猪Lp-PLA2在1 mol/L IPTG、37℃条件下,表达于菌体中;western blotting显示,该抗体与猪源Lp-PLA2有良好的交叉反应。因此,该多克隆抗体的制备为进一步利用猪作为动物模型研究炎症性疾病奠定了基础。     

血红蛋白β亚基对猪流行性腹泻病毒增殖抑制作用的研究

本实验室前期蛋白质组学研究结果显示,猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)后,导致血红蛋白β亚基(HBB)的表达量升高。为进一步从蛋白水平验证前期的实验结果并研究HBB对PEDV增殖作用的影响,本研究将PEDV感染Vero-E6细胞,感染24 h后经western blot检测结果表明,PEDV感染能够促进HBB的表达。进一步采用RT-PCR从Vero-E6细胞总RNA中扩增HBB基因并将其克隆至真核表达载体pCAGGS中,构建HBB真核表达重组质粒pCAGGS-HBB,并将其转染至Vero-E6细胞。经western blot检测结果表明,HBB在Vero-E6细胞中获得高效表达。在HBB过表达后感染PEDV,经western blot、TCID_(50)及荧光定量PCR检测结果表明,过表达HBB能够显著抑制PEDV的增殖。本研究对于进一步阐明HBB对PEDV增殖作用的影响机制提供了实验依据。     

猪CCL2的原核表达及其多克隆抗体的制备

CCL2作为一种典型的促炎因子，在病毒感染、各类肿瘤、自身免疫疾病等许多病症的发生、发展中都有着举足轻重的意义，然而猪的CCL2研究鲜有报道。本研究使用PCR方式扩增CCL2基因，将其克隆于大肠杆菌原核表达系统的pET-28a(+)表达载体中，成功构建重组表达质粒pET-28a(+)-CCL2,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，再经0.1mmol/L的IPTG诱导表达，SDS-PAGE结果表明猪CCL2蛋白在大肠杆菌中获得可溶性表达。将CCL2蛋白纯化后免疫新西兰大白兔，4次免疫后收集血清，通过ELISA方法检测其效价达到1∶128 000。Western blot和IFA测定结果显示本研究获得的猪CCL2多克隆抗体具有较好的特异性。本研究获得的猪CCL2蛋白和针对CCL2的兔多克隆抗体为未来研究猪CCL2的在疾病中的相关作用及生物学功能提供了试验材料。     

猪星状病毒1型衣壳蛋白的截短表达及多克隆抗体的制备

为制备猪星状病毒1型(PAstV1)Cap蛋白高变区特异性多克隆抗体,本研究根据PAstV-GX1株Cap蛋白Cs(aa420～aa669)基因序列设计引物,PCR扩增该片段(Cs)后克隆于pET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET32a-Cs,将其转化E. coli BL21感受态细胞,经终浓度1 mmol/L的IPTG在37℃诱导6 h后经SDS-PAGE检测表达产物,结果显示在大约47 ku处出现目的蛋白,且该蛋白以可溶性形式表达。将重组Cs蛋白经Ni柱纯化后乳化,按100μg/只免疫6周龄BALB/c小鼠,三免后5 d采血分离血清,经western blot和间接免疫荧光检测结果显示,获得的Cap蛋白高变区多克隆抗体可特异性识别PAstV-GX1感染的PK15细胞表达的病毒蛋白。本研究首次制备的PAstV Cap蛋白高变区纯化蛋白及其多克隆抗体为后续PAstV病原学研究奠定了基础。     

猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株E2蛋白的表达及抗体制备

表达去除SD0803E2基因跨膜疏水区的sE2蛋白并制备其抗体,为猪源BVDV诊断奠定基础。RT-PCR扩增SD0803株sE2基因,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-sE2,转化BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。采用间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光等方法鉴定获得的抗体。结果显示,抗体效价最高可达1∶256 000;制备的抗体可与rsE2蛋白特异性结合;该抗体可特异性识别BVDV感染MDBK细胞表达的E2蛋白,显示抗体高度的特异性。成功构建pGEX-4T-1-sE2原核表达质粒,诱导其表达的蛋白免疫家兔,成功制备的猪源BVDV SD0803株E2抗体。     

犬p27蛋白在犬乳腺肿瘤中的表达分析

为分析犬p27蛋白在犬乳腺肿瘤组织中的表达情况,本研究构建了原核表达重组质粒pET-p27,进行重组蛋白的表达,并将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔,制备了抗犬p27蛋白多克隆抗体。将制备的犬p27抗体对临床84例犬乳腺肿瘤组织中的犬p27蛋白表达情况进行了检测。结果显示,制备的抗体效价达1∶12 800以上;western blot检测显示,该多克隆抗体能够与重组蛋白发生特异性反应;免疫组织化学试验表明,犬p27蛋白在犬恶性乳腺肿瘤组织中表达率低于犬良性乳腺肿瘤组织,提示犬p27的表达水平可能与犬乳腺肿瘤的恶性程度相关,本实验为进一步研究犬p27蛋白的生物学功能奠定了基础。