长尾仓鼠SSR位点的筛选与扩增

利用从山西省11个地市共计13个县(市)野外捕捉的132只长尾仓鼠为试验材料,先提取其基因组DNA,然后应用查阅的近源种黑线仓鼠的6对SSR位点引物(已登记在GeneBank)对长尾仓鼠基因组DNA进行PCR扩增,并对扩增产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果表明,有5对引物扩增效果较好,可用于长尾仓鼠的遗传多样性研究。研究结果可对今后长尾仓鼠的遗传多样性分析提供一定的理论基础。     

利用RGA-PCR方法进行水稻抗瘟基因分子标记

用28对RGA引物对LTH近等基因系品种进行PCR扩增，其中11对引物扩增出特异性条带。将扩增到的33个特异性片段回收并进行重扩增，有11个片段产生单一条带。选择2个片段HS-1和HS-19进行探针标记。经Southern杂交发现。探针HS-1在含有Pi—ta^2抗瘟基因品种F-128—1、NO4中有特异杂交信号，表明该片段可能与抗瘟基因Pi—ta^2连锁或是其一部分。对特异性片段HS-1进行克隆、测序，全长为478bp，与Mago等从水稻中克隆的一个抗病基因同源序列RGA29有95％同源性。     

小麦抗白粉病基因Pm4b的RGA分析

为克隆抗性基因和发展Pm4b的特异分子标记奠定基础。利用10对RGA引物,对小麦抗白粉病基因的一些载体品种(系)进行扩增,将引物对R11F/R11R从Pm4b基因的载体品种VPM中扩增出的稳定多态性条带回收、克隆、测序,获得与小麦Pm4b基因的相关抗病基因的同源片段,并对不同的小麦Pm基因载体品系作了检测分析。该稳定多态性条带全长1 321 bp。序列分析表明这个片段属于RGA类序列。用该标记检测小麦不同Pm基因载体品种(系),发现该多态性片段仅出现在Pm4b基因载体品种中。该研究可为分离抗性基因和发展Pm4b的特异分子标记奠定基础。     

鹅源副黏病毒NA-1株F基因定点突变及其在Bac-to-Bac系统中的表达

根据已发表的鹅源副黏病毒(GPMV)NA-1株F基因序列设计2对引物,引物中含有突变位点,分3次扩增F基因片段,从而得到目的基因片段,再利用酶切位点将基因片段与转座载体pFastBac 1连接,获得重组质粒,命名为pFastBac 1-F′,从而使改造后的F′基因编码的氨基酸裂解位点为112Gly-Arg-Gln-Gly-Arg-Leu117。并将pFastBac 1-F′进行测序鉴定后转化到DH10Bac宿主菌,将目的基因定向插入到Bacmid质粒中,经筛选获得的重组Bacmid F′转染Sf 9昆虫细胞,并进行表达检测。结果,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测获得蛋白特异条带,相当分子量约63 kD。     

大麻性别相关AFLP分子标记筛选

利用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)分子标记,用8个EcoRⅠ-NNN和8个MseⅠ-NNN组成64对引物,对大麻10个品种混合组成的雌性、雄性植株基因池进行筛选,并将筛选到的引物在此10个品种中进行验证,引物E-ACT/M-CTA在10个品种的雄株中均扩增出1条特异条带,雌株中均没有此带,对此引物扩增得到的特异性条带回收、克隆、测序,获得1条大小为348 bp的雄性特异性条带,得到的序列进行GenBank序列比对,数据库中没有与此特异条带同源的序列.该条特异条带可作为分子遗传标记用于大麻早期性别鉴定的参考.     

利用单线虫多重PCR技术快速制备DNA分子量标准

基于单只线虫6对染色体及多重PCR技术建立一种特异性扩增特定长度核酸片段的方法,进而探索其在常规核酸分子量标准制备中的应用。利用多重PCR引物设计及特异性评估软件以秀丽线虫6对染色体为模板,分别设计扩增不同长度核酸片段的特异性引物对,并直接对单只秀丽线虫进行多重PCR扩增,采用20g/L琼脂糖凝胶电泳进行分离鉴定并采集图像,通过系统研究优化获得特异性高的1～6重PCR扩增产物,产物大小经鉴定与预期目的条带一致,6重PCR扩增产物条带与常规分子量标准DL 2 000相应条带完全吻合,说明采用该方法能够有效制备特定片段大小的分子量标准。     

草菇菌种退化相关分子标记的筛选

【目的】基于SRAP分子标记技术,筛选出与草菇(Volvariella volvacea)菌丝退化性状紧密连锁的分子标记,为进一步研究目标性状基因的克隆与功能奠定基础。【方法】以草菇正常生长菌株V51(对照)与其菌丝退化菌株(VNM1~10)为材料,采用群体分离分析法分别构建2种草菇的近等基因池。利用SRAP分子标记技术,寻找两类菌株的差异片段,回收差异片段后与pMD-18T载体连接,构建重组质粒pMD-VNMDF并转化E.coli DH5α感受态细胞,将筛选的阳性克隆测序。根据差异片段序列设计引物,将其转化成SCAR分子标记,并对草菇正常菌株V51及其菌丝退化菌株VNM进行扩增试验,验证该标记的真实性和可靠性。【结果】81对SRAP引物组合中有2对引物可扩增出稳定差异条带,其中引物对Me8-Em4PCR扩增出长度约300bp的差异条带(命名为VNMDF)存在于退化菌株中。对SRAP分子标记片段VNMDF回收、测序并进行序列分析发现,该片段长度为279bp,其核酸、氨基酸序列与编码26S蛋白酶体亚基的相似性分别达到81%和93%。利用SCAR特异引物对SCAR250可在菌丝退化菌株中稳定扩增出长度约250bp片段,与预期大小(279bp)一致,而在正常菌株中未扩增出此片段。【结论】获得了1条可能与草菇菌丝退化性状基因紧密连锁的SRAP分子标记,并将其成功转化为SCAR标记(SCAR250)。     

大麻性别相关AFLP分子标记筛选

利用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)分子标记,用8个EcoRⅠ-NNN和8个MseⅠ-NNN组成64对引物,对大麻10个品种混合组成的雌性、雄性植株基因池进行筛选,并将筛选到的引物在此10个品种中进行验证,引物E-ACT/M-CTA在10个品种的雄株中均扩增出1条特异条带,雌株中均没有此带,对此引物扩增得到的特异性条带回收、克隆、测序,获得1条大小为348bp的雄性特异性条带,得到的序列进行GenBank序列比对,数据库中没有与此特异条带同源的序列.该条特异条带可作为分子遗传标记用于大麻早期性别鉴定的参考.     

小麦抗叶锈基因Lr45的SCAR标记

 【目的】建立小麦抗叶锈基因Lr45 SCAR（sequenced characterized amplified region序列特征扩增区域）标记。【方法】以小麦抗叶锈病基因材料TcLr45和感病材料Thatcher为亲本,利用黑麦基因组特异的RAPD标记引物OPH20进行PCR扩增,对获得的与预期大小相同的1.5kb的特异片段进行克隆测序,并根据该序列设计一对特异PCR引物LRYR和LRYF,对TcLr45×Thatcher F2代单株构建的分离群体进行扩增,验证该标记与Lr45的连锁关系,Mapmaker 3.0软件绘制遗传连锁图。【结果】该标记在TcLr45中扩增出单一条带,片段大小为1 272 bp（命名为Ypsc20H1272）,而在感病亲本中则无扩增条带。F2代分离群体进行连锁分析,遗传距离为8.2 cM,该标记为与Lr45连锁的SCAR标记。【结论】将Lr45的RAPD标记转化成SCAR标记。     

黄鳝粘液雌雄差异的cDNA-SRAP分析

采用cDNA-SRAP技术对黄鳝雌雄粘液进行基因差异表达分析,筛选黄鳝体表粘液中与性别相关的分子标记。从64对引物组合中筛选出12对引物组合,共获得123个稳定清晰的扩增位点,并筛选出4条雌雄有差异的条带。这4条特异性条带经过回收、克隆、测序后,将测序结果进行Blast分析,结果发现在GenBank中只有片段1与白鳍豚硫酸盐/硫代硫酸盐CYSA样进口ATP结合盒蛋白有较高的同源性。根据片段1的序列设计1对引物进行半定量RT-PCR反应,结果发现,片段1在雌雄黄鳝体表粘液均可获得扩增条带,但其在雄性粘液中的表达量显著高于雌性。这可能是由于雌雄黄鳝粘液中所存在的表皮细胞和粘液腺细胞有差异所致。