家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子的克隆和序列分析

利用ＰＣＲ方法扩增了家蚕核型多角体病毒苏州株（ＢｍＮＰＶｓｕ）的ＩＥ－１启动子全序列并进行克隆和序列分析，结果表明ＢｍＮＰＶｓｕ的ＢｍＮＰＶｓｕ启动子符合真核生物启动子特点，在其序列中有典型的增强子类似元件、加帽位点、ＴＡＴＡ盒等基序。与ＧｅｎＢａｎｋ报道的其它几种ＮＰＶ病毒基因组中的ＩＥ－１启动子序列进行同源性分析表明ＢｍＮＰＶｓｕ与ＩＥ－１（家蚕核型多角体病毒Ｔ_３株）、ＡｃＭＮＰＶ（首蓿尺蠖核型多角体病毒）、ＯｐＭＮＰＶ（黄衫毒蛾核型多角体病毒）、ＬｄＮＰＶ（舞毒蛾核型多角体病毒）的同源性分别为９９．５％、９６．４％、６６．２％和５０．２％。根据各ＮＰＶ基因组中ＩＥ－１启动子序列分析了几种ＮＰＶ的进化关系。     

基因库（GenBank）的电子邮件检索

１９８２年，美国国立卫生研究院（ＮＩＨ）、美国国立医学图书馆（ＮＬＭ）和美国国家生物技术信息中心（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ＮＣＢＩ）等机构开始建立ＤＮＡ序列数据库（ＧｅｎＢａｎｋ）。这些数据每１８个月增加一倍，由于大量的表达序列标识（ＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇｓ，ＥＳＴ）收入基因库，现在基因库中的数据每１５个月就增加一倍，并且有加速的趋势。 基因库中的基因数据出自３００００多种不同的物种，现在每月有６００多种新的物种加…     

传染性支气管炎病毒Holte株S1基因的克隆及鉴定

为给鸡传染性支气管炎（ＩＢ）基因工程疫苗的研制提供基因储备,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出ＩＢＶＨｏｌｔｅ株Ｓ１基因ｃＤＮＡ,其长度与理论值１７６２ｂｐ相符;Ｓ１基因内部位点经ＨａｅⅢ酶切所产生的片段,亦与理论值５４９、３４３、３２４、１９１、１８０、１７１ｂｐ６个片段大小一致。将Ｓ１基因ｃＤＮＡ克隆入ｐＵＣ１８,并对Ｓ１基因两翼进行了序列分析。结果表明,所克隆的Ｓ１基因与ＧｅｎＢａｎｋ中收录的ＩＢＶＨｏｌｔｅ株Ｓ１基因完全相符。     

PRRS病毒BJ-4株全基因组序列测定与分析

采用分段设计引物,分段扩增、克隆、序列测定与拼接的方法,对猪繁殖与呼吸综合征（ＰＲＲＳ）病毒ＢＪ－４株进行了全基因组序列测定和分析。设计合成２２对引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增得到 ２２条片段,分别与 ｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙ载体连接,转化大肠杆菌ＪＭ１０９。筛选阳性重组子进行测序,然后将测得的序列顺次拼接得到ＰＲＲＳ病毒ＢＪ－４株全基因组序列。序列测定结果表明ＰＲＲＳ病毒ＢＪ－４株基因组全序列共长１５５０４个核苷酸,含有８个开放阅读框,５’端１９０ｂｐ先导序列,３’端有 ２５６ｂｐ ＵＴＲ,其中包括…     

马铃薯SGAs合成代谢途径末端SGT酶基因克隆及序列分析

 糖苷生物碱（ＳＧＡｓ）是一类存在于茄科植物和百合科植物的重要次生代谢物,与植物抗逆性和产品品质有密 切关系,同时在医药上具有广泛的药理学活性。茄啶：糖基转移酶（ＳＧＴ）为ＳＧＡｓ合成代谢途径末端关键酶,研究 其基因结构及其编码的酶蛋白特性,对于调控植物体内ＳＧＡｓ合成及其通过微生物发酵生产ＳＧＴｓ有重要的作用 和意义。通过生物信息学分析方法预测３个糖基转移酶ｃＤＮＡ 编码的酶蛋白结构和特性。以马铃薯块茎表皮总 ＲＮＡ 为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ 的方法扩增出３个糖基转移酶（ＳＧＴ１、ＳＧＴ２和ＳＧＴ３）基因片段并克隆到ｐＭＤＲ１９ Ｔ 载体。阳性克隆经ＰＣＲ 鉴定后进行测序,序列分析结果表明,克隆到的sgt １、sgt ２ 和sgt ３ 三个同源的序列片段 （１４６７～１５１８ｂｐ）,编码４８８～５０５ 个氨基酸;所得序列与ＧｅｎＢａｎｋ 中注册的高等植物ＳＧＴ 酶基因核苷酸序列 （Ｕ８２３６７．２、ＤＱ２１８２７６．１和ＤＱ２６６４３７）的同源性均在９９．１２％以上,氨基酸同源性达到９９％以上,３个基因都具 有ＵＤＰＧ 糖基转移酶保守结构域及许多重要功能位点;ＰＩ为５．５２～５．６２。三级结构预测表明,该氨基酸同糖基转 移酶单体结构模型相似,都为糖基转移酶家族成员,具有合成类固醇糖苷生物碱的功能,基因序列已注册到Ｇｅｎ Ｂａｎｋ,序列注册号分别为：sgt １,ＪＮ６９５００５;sgt ２,ＪＮ６９５００６;sgt  ３,ＨＭ１８８４４７。     

马铃薯块茎GBSSⅠ基因的DNA克隆及其序列特征分析

 以马铃薯普通栽培种“甘农薯２号”块茎为材料,利用ＲＮＡ 提取试剂盒提取总ＲＮＡ,通过ＲＴ－ＰＣＲ 技术和ＤＮＡ 序列测定分析,证实获得了马铃薯颗粒结合淀粉合成酶（ＧＢＳＳＩ）基因的ｃＤＮＡ 序列。该ｃＤＮＡ 全长１８２４ｂｐ,包括６０７个氨基酸和１个终止密码子序列,且与原序列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＸ５８４５３）同源性为９９．７８％,但与其他科植物ＧＢＳＳ基因的同源性较低,注册该基因到ＧｅｎＢａｎｋ中,注册号为ＥＵ４０３４２６。利用生物信息学相关软件分析预测ＧＢＳＳＩ基因ｃＤＮＡ 序列编码的蛋白质功能和结构,结果发现,该蛋白与其他１５种植物ＧＢＳＳ蛋白一样,具有３个完全保守区域,并具许多重要功能位点,且与农杆菌淀粉合成酶具有相似三级结构模型,表明该蛋白具淀粉合成功能。     

牛轮状病毒重组株的血清学和基因型特性

从母牛接种过Ａ组ＢＲＶ株ＮＣＤＶ－Ｌｉｎｃｏｌｎ（Ｐ１：Ｇ６）苗的两个吡邻牛场分离到两株牛轮状病毒（ＢＲＶ），编号为ＮＳ－１和ＮＳ－２，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ试验表明，ＮＳ－１和ＮＳ－２有相的的Ａ组ＲＮＡ电泳模式，而且全部基因片段同源，体外中和试验表明，ＮＳ－１株病毒能被Ｇ６特异性单克隆抗体（ＭｃＡｓ）和抗ＢＲＶＢ６４１株（Ｐ５：Ｇ６）豚鼠高免血清（ＧＰＡＳ）中和，但不被Ｇ１０特异性Ｍ     

减蛋综合征病毒套式PCR检测技术的研究

从ＧｅｎｅＢａｎｋ的１段含六邻体蛋白基因、蛋白酶基因、ＤＮＡ结合蛋白基因的序列中，应用Ｐｒｉｍｅｒ软件设计了２对引物。用这２对引物在分别对反应体系成分和聚合酶链反应（ＰＣＲ）试验条件进行优化后，成功地建立了减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）套式ＰＣＲ检测技术。对鹌鹑源ＥＤＳＶＱＡＶｃ－９４株、ＡＶ－ｘｂ西北分离株、ＡＶ－１２７国际标准株扩增结果，第一轮ＰＣＲ得到约２９０ｂｐ的特异性片段，第二轮ＰＣＲ得到约９０ｂｐ的片段，与预期２８９ｂｐ、８９ｂｐ的设计相符合。而传染性腔上囊病病毒（ＩＢＤＶ）疫苗株Ｂ８７、鸡亲城疫病毒（ＮＤＶ）Ⅳ系疫苗株（ＬａＳｏｔａ）和正常尿囊液等对照的扩增结果均未显示任何扩增条带，有很好的特异性。所建立的套式ＰＣＲ检测方法具有特异、快速的优点，其灵敏度比常规ＰＣＲ灵敏１００倍，可检测出０．０１ｆｇ的     

应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GPS基因

将猪繁殖与呼吸综合征症病毒ＣＨ－ａｌ株囊膜糖蛋白（ＧＰ５）一向克隆到杆状病毒转移载体ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＢ中,与太毒线性ＤＮＡ（Ｂａｃ－Ｎ－Ｂｌｕｅ＾ＴＭＤＮＡ）共转染昆虫细胞ｓｆ９,经过三轮蚀斑纯化后,获得重组杆状病毒ｒＢａｃ＝ＧＰ５。用该重组病毒感染ｓｆ９细胞后,应用间接免疫荧光试验、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表明,ＧＰ５基因在杆癍病毒系统中获得了高效表达,表达产物因糖基     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中的表达

将含有传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）广东地方分离株Ｄ４１的Ｓ１基因ｃＤＮＡ（从ＡＴＧ到Ｓ前体蛋白裂解位点）的片段克隆到具有多角体启动子（ＰＸＩＶ）和人工合成启动子（Ｐｓｙｎ）的杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸ－ＩＶＶＩ＋Ｘ３中，构建了重组转基因载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３－Ｓ１．Ｄ４１。用该重组转移质粒与无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒ＴｎＮＰＶ－ＳＶＩ－ＧＤＮＡ（ｏｃｃ－，ｇａｌ＋）共转染草地夜蛾（Ｓｆ９）细胞，筛选并纯化出既能表达Ｓ１基因又能形成多角体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ＩＢＶＳ１－ｏｃｃ＋（ｏｃｃ＋，ｇａｌ－）。通过间接ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ等方法在感染了重组病毒的Ｓｆ９细胞中成功地检测到分子量约６２０００的Ｓ１基因表达产物。虽然该重组Ｓ１糖蛋白可能由于Ｎ－糖基化不完全而分子量小于天然蛋白，但它可以像正常病毒粒子一样，被鸡抗ＩＢＶＤ４１株血清特异识别。     

应用多联PCR对引发猪繁殖障碍有关病毒的检测Ⅰ.JEV、PPV、PRRSV、PRV多联PCR引物设计

首先在ＧinＢank查出日本乙型脑炎病毒（ＪＥＶ）、伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）、猪繁殖与 呼吸系统综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）和猪细小病毒（ＰＰＶ）基因组的所有已知序列,对各病毒基因区域进行同源性分析,结果各病毒基因组的结构特点,发现并确定了ＰＲＶ的gＨ基因区、ＪＥＶ的多聚蛋白基因区、ＰＲＲＳＶ的结构蛋白区和ＰＰＶ的ＶＰ２基因区为各自病毒保守序列。利用Ｇoldkey软件对上述保守的特殊序列进行引物设计,要求Ｇ＋Ｃ含量     

禽白血病／肉瘤病毒群特异性抗原P_（27）~（gag）的分离和纯化

本试验用差束离心和非线性蔗糖密度梯度离心法从感染雏鸡血浆中分离和提纯了禽成髓细胞性白血病病毒（ＡＭＶ）。并以ＳＤＳ法裂解病毒，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＡＭＶ结构蛋白成分，最后选用（ＬＫＢ）水平板式电泳系统，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ比较大量地分离提纯了Ｐｇａｇ２７。用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和琼脂扩散试验检验其抗原活性，并且用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定其分子量和纯度。结果表明，提纯的病毒蛋白具有抗原活性，且达到电泳纯。     

PRRS病毒核衣壳蛋白在大肠杆菌中的高效表达

用表达非融合蛋白的原核表达载体ｐＢＶ２２０,通过ＰＣＲ技术的引物设计对ＰＲＲＳ病毒ＢＪ－４株核衣壳蛋白（Ｎ）基因起始密码子上游进行了改造和修饰,在其上游加入了 ＥｃｏＲＩ酶切位点。将 ＰＲＲＳ病毒 Ｎ基因插入载体 ｐＢＶ２２０ ＰＬＰＲ启动子和Ｓ－Ｄ序列下游合适距离的位置,成功地构建了含有ＰＲＲＳ病毒Ｎ基因的原核重组表达载体ｐＢＶ－Ｎ。ｐＢＶ－Ｎ转化大肠杆菌ＤＨ５ａ,经温度诱导后菌体裂解物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析发现,在约１５ｋＤ处出现一条特异性的目的蛋白条带,分子量大小与ＰＲＲＳ病毒Ｎ蛋白相符,而诱…     

牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株的抗原差异

用单克隆抗体（ＭＡｂ）作酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、免疫荧光试验（ＩＦＡ）、病毒中和（ＶＮ）试验及兔疫沉淀试验证明了牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）致细胞病变株８７－２５５２（现地分离）与ＮＡＤＬ和Ｓｉｎｇｅｒ（原型株）之间的抗原差异。两个抗ＢＶＤＶ８７－２５５２株的ＭＡｂ（Ｄ１１和Ｂ７）能强烈中和现地分离株，并对该病毒的４８－ＫＤａ糖蛋白呈特异性。这两个ＭＡｂ有不同的亚型，Ｄ１１为免疫球蛋白Ｇ１     

狼尾草属牧草rDNA的ITS序列分析

 对来自福建、江苏、海南等１５份狼尾草属牧草的５．８ＳｒＤＮＡ、ＩＴＳ１及ＩＴＳ２片段进行克隆及序列分析,并登录于ＧｅｎＢａｎｋ数据库,采用ＤＮＡＭＡＮ、ＣＬＵＳＴＡＬＸ、ＭＥＧＡ 等软件分析其遗传关系聚类图。结果显示,克隆的目的片段长度为５７３～５８６ｂｐ,聚类结果总体能较好地反应狼尾草属牧草之间的遗传距离,其中杂交狼尾草和细茎杂交狼尾草可能存在着同种异名的现象。     

PCR法检测血清I型马立克氏病病毒及其敏感性试验的研究

以人工合成的针对血清Ｉ号马立克氏病病毒（ＭＤＶ１）Ａ抗原基因（ｇＡ）部分序列的两端寡聚核苷酸为聚合酶链反应（ＰＣＲ）的引物，分别对马立克氏病病毒血清Ｉ型（京－１株，ＭＤ１１／７５Ｃ株）；２型（ＳＢ－１株）；３型（火鸡疱疹病毒的ＦＣ１２６株）毒株和ＧＡ株ＢａｍＨＩ Ｂ片段的ＰＡＣＹ１８４克隆重组质粒ＤＮＡ进行基因扩增反应及其敏感性试验。结果表明，该引物不仅对ＭＤＶ１具有较强的特异性，而且由此引物引导     

抗鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体中和株的建立

将纯化的鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）组织毒免疫的ＢＡＬＢ／ｃ鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，用ＥＬＩＳＡ，病毒中和试验检测分泌抗体，获得了６株稳定分泌抗ＩＢＤＶ单隆抗体的杂交瘤细胞，命名为ＮＩＢ－１，ＮＩＢ－２，ＮＩＢ－３，ＮＩＢ－４，ＮＩＢ－５，ＮＩＢ－６；６株ＭＣＡｂ均具ＥＬＩＳＡ特性和免疫沉淀特性，亚类鉴定表明，前４株属于ＩｇＧ２ａ，后２株属于ＩｇＧ１。杂交瘤细胞冻存６个月后复苏，均     

猪繁殖与呼吸综合征病毒北京分离株的ORF7克隆与序列分析

将北京地区猪系列与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）分离ＢＪ－２和ＢＪ０４的ＯＲＦ７及部分３端编码区（ＵＴＲ）的ＲＴ＿ＰＣＲ扩增产物克隆连接于ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ质粒载体上,重组质粒经ＥｃｏＲⅠ酶切鉴定后进行了双链测序。测定垢基因序列与欧已知序列比较发现,ＢＪ－２和ＢＪ－４株与美洲ＶＲ－２３３２株非常接近,在其长度为５５５ｂｐ的ｃＤＮＡ序列中,仅与ＶＲ－２３３２株分别相差１和２个核苷酸,其中ＯＲＦ７的核     

传染性法氏囊病病毒变异株主要免疫原基因cDNA的克隆及鉴定

采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），从１株传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）本地分离株ＧＺ９０２中扩增到编码ＩＢＤＶ主要免疫蛋白ＶＰ２的ｃＤＮＡ片断，大小约为１３５０ｂｐ。将该ｃＤＮＡ片断插入ｐＢｓＫ质粒中，用重组质粒转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，成功获得重组质粒转化菌。对重组质粒ＤＮＡ进行酶切鉴定，证明插入的ＤＮＡ片断与ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段大小相符。对ＧＺ９０２高可变区进行了序列分析。其核苷酸序列与３株ＩＢ－ＤＶ变异株Ａ、ＧＬＳ、Ｅ的同源性分别达到９８．９％，９６．２％和９５．５％。而与其他Ⅰ型毒株的同源性较低。比较从ＤＮＡ序列推导出的氨基酸序列，发现ＧＺ９０２高可变区的两个亲水区均发生了一个氨基酸的变化，而在２４９和２５４位上的氨基酸分别为Ｋ和Ｓ，与以上３个变异株相同，但与所有标准Ⅰ型毒株不同。这两个氨基酸可以作为ＩＢＤＶ变异株的标志。     

禽流感病毒核蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地扩增了我国禽流感病毒分离株Ａ／Ｘｉｎｇｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）的核蛋白（ＮＰ）基因,其限制性内切酶图谱和核苷酸序列与鸭源的标准Ｈ１４Ｎ５毒株几乎完全一致,与其它毒株则有较大差异,说明该鸡源分离株与鸭源毒株有非常近的亲缘关系。将ＮＰ基因定向克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３中,再与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－ＢｌｕｅＤＮＡ）共转染于Ｓｆ９昆虫细胞中,经过三次蚀斑筛选,获得重组病毒ｒＢ２。用其细胞表达产物裂解后作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ,结果表明ＮＰ基因在杆状病毒系统中获得了表达。同时用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与现行标准禽流感琼扩抗原具有相同的生物学活性。