利用RecTE基因重组体系构建hrpS基因缺失型冠菌素工程菌株

冠菌素 (coronatine, COR) 是一种新型植物生长调节剂，能有效调控植物生长，增强植物抗逆性。目前冠菌素主要通过微生物菌株发酵的方式获得，而菌株自身产率低是限制冠菌素应用的最大问题。为了开发冠菌素高产菌株，本研究以模式菌株丁香假单胞菌番茄致病变种Pseudomonas syingae pv. tomato DC3000为出发菌株，利用RecTE基因重组体系对菌株Pst DC3000中hrpS基因进行了敲除，并成功筛选到基因重组菌株H1-20。对H1-20菌株进行发酵培养，结果表明，H1-20菌株中冠菌素的产量达到了22.67 mg/L，是出发菌株冠菌素产量的2.36倍。本研究通过RecTE基因重组体系，成功地构建了冠菌素工程菌株H1-20，为产冠菌素菌株提供了更多选择，为后续进一步开展冠菌素高产菌株改造工作奠定了基础。     

武夷菌素防治大豆菌核病的作用机制

武夷菌素是一种核苷类农用抗生素,具有高效、广谱、低毒等优点,对大豆菌核病具有良好的防治效果。武夷菌素防治大豆菌核病包括抑制核盘菌和诱导大豆抗病性两方面的作用。本文分别从核盘菌生长发育、生理毒性和基因表达三个层面介绍了武夷菌素抑制核盘菌的作用机制,同时,从植物防御过程中的胼胝质沉积、防御相关酶活变化和激素信号传导途径三方面综述了武夷菌素诱导大豆抗病的作用机制。此外,本文分析并展望了今后深入研究武夷菌素防治大豆菌核病作用机制的工作重点。     

武夷菌素产品的创制与应用

武夷菌素是具有我国自主知识产权的生物农药，先后创制了1%、2%、3%武夷菌素系列产品。作为一种低毒、高效、广谱的核苷类微生物次级代谢产物，对多种作物的真菌性病害具有很好的防治效果。本文总结了四十年来，武夷菌素在产品创制、高产菌株选育、发酵工艺、提取工艺以及田间应用等方面的研究进展，展望了武夷菌素产业化发展过程中存在的问题并分析了接下来的研究重点。     

武夷菌素产生菌CK-15中转录调控因子wysR3的功能研究

wys R3是武夷菌素产生菌Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis CK-15中可能的调控因子。为了验证wys R3是否参与武夷菌素生物合成基因的转录调节,构建了用于过表达wys R3的基因重组质粒p SETC-R,并通过接合转移的方法转化至武夷菌素产生菌S.wuyiensis CK-15中,构建过表达菌株。过表达菌株生长速度明显缓慢;通过摇瓶发酵和HPLC检测分析发现,武夷菌素产量与野生型菌株相比没有发生明显变化;DNS法测定发酵液中糖含量也没有发生明显变化,说明该基因与武夷菌素的产量和糖含量在该种条件下没有直接关系,但是影响菌株表型生长。     

乙基伊维菌素高产菌株选育及其发酵工艺优化

基因工程菌Streptomyces avermitilis AVE-H39产生的甲基和乙基伊维菌素 (methyl and ethyl ivermectins),为新型高效低毒的阿维菌素 (avermectin) 衍生物,具有很好的开发应用前景。活性测试结果显示,乙基伊维菌素对朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus和松材线虫Bursaphelenchus xylophilus等农林作物害虫的活性优于甲基伊维菌素。鉴于菌株S. avermitilis AVE-H39的乙基伊维菌素产量低,制约了产业化开发,本研究经过多轮诱变选育,筛选获得了一株乙基伊维菌素发酵单位高的突变菌株,并通过Plackett-Burman 试验设计及Box-Behnken 设计-响应面法 (response surface methodology, RSM)对该突变菌株的发酵培养基进行改良。经优化后的发酵条件为:玉米淀粉149.8 g/L,黄豆粉38.1 g/L,(NH₄)₂SO₄ 3.04 g/L,甘露醇30.0 g/L,酵母抽提物20.0 g/L,CaCO₃ 3.0 g/L,CoCl₂ 0.01 mg/L,FeSO₄ 0.002 mg/L,转速220 r/min,pH 7.2,装液量30 mL/250 mL,接种量5%,发酵温度28 ℃。在此条件下,乙基伊维菌素的发酵效价达到最大值,为4 965 mg/L。研究结果将为开发以乙基伊维菌素为主成分的新型十六元大环内酯农药奠定基础。     

武夷菌素高产菌株选育及应用研究进展

武夷菌素是一种具有自主知识产权的高效、广谱、低毒生物农药,对粮食、蔬菜和果树及经济作物的真菌病害具有良好的防治效果。本文分别从传统育种和基因工程育种两个方面,介绍了武夷菌素高产菌株的选育研究历程,尤其详细介绍了基因工程育种体系的构建。同时,综述了武夷菌素的田间防治效果,分析了研究和应用过程中存在的问题并提出了解决途径。     

加拿大专家认为草甘膦有可能刺激枯萎病的滋长

工作在加拿大政府部门的专家们认为：除草剂草甘膦有可能刺激毒枝菌素的滋长，而这种毒枝菌素又导致感染小麦作物真菌的滋长，因此农民们被忠告应少用草甘膦除草剂。此点将可能成为加拿大推广基因修饰小麦作物的一个主要障碍。因为加拿大正处于基因小麦批准过程中，而第一个报批的基因修饰小麦就是耐草甘膦的小麦。     

乙基多杀菌素

理化性质：乙基多杀菌素是从放线菌刺糖多孢菌（saccharopolyspora spinosa）发酵产生的．是多杀菌素（spinasad）的换代产品。其原药的有效成分是乙基多杀菌素-J和乙基多杀菌素-L的混合物（比值为3：1）,     

中生菌素的抗生作用

 本文研究了中生菌素对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、丝状真菌的抗生作用。结果表明,中生菌素是一种抗菌谱比较广的农用抗生素。其对菌体细胞膜无明显的影响。100 ppm时引起部分菌体原生质凝聚。同位素标记前体物掺入实验表明,中生菌素15.6 ppm对白菜软腐病菌DNA、RNA的合成影响很小,但强烈抑制菌体蛋白质的合成。用化学测定法分析了中生菌素对枯草杆菌细胞内大分子物质含量的影响,得到了和前体物掺入法相似的结果。说明了中生菌素的作用机制是抑制菌体蛋白质的合成。     

中生菌素对水稻悬浮细胞过氧化物酶基因转录表达的影响

用白叶枯菌（HB84—17）、10μg／ml中生菌素和10μg／ml中生菌素＋白叶枯菌处理水稻抗、感白叶枯病近等位基因系CBB4和沈农1033悬浮细胞，采用斑点杂交的方法研究了中生菌素对水稻悬浮细胞过氧化物酶基因转录表达的影响。结果表明，白叶枯菌、中生菌素和中生菌素＋白叶枯菌处理都能诱导悬浮细胞中过氧化物酶基因的转录表达。对于CBB4，白叶枯菌处理3h时过氧化物酶基因开始诱导转录表达，6h达到高峰，诱导表达时间持续至24h；中生菌素处理3h时开始大量表达，6h达到，高峰，大量表达持续至72h。对于沈农1033，白叶枯菌处理48h时过氧化物酶基因才开始诱导转录表达；中生菌素处理，3h就开始大量转录表达，并持续至48h。中生菌素＋白叶枯菌处理的感、抗病品种过氧化物酶基因的诱导转录表达强度和模式与单用中生菌素处理相同。     

基于QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法检测依维菌素在杨梅上的残留

为评价依维菌素在杨梅上的残留风险,开发了依维菌素在杨梅上的残留分析方法,并结合田间试验对依维菌素在浙江、福建、江西和云南4地杨梅上的残留消解状况进行了研究。采用改进的QuEChERS方法,结合超高效液相色谱-串联质谱 (UPLC-MS/MS) 对伊维菌素在杨梅上的残留量进行分析。结果表明:在0.001~0.5 mg/L范围内,依维菌素的质量浓度与对应的峰面积间呈良好线性关系,相关系数 (r) 为0.999 9。在0.005~1 mg/kg添加水平下,依维菌素在杨梅中的平均回收率为80%~95%,相对标准偏差为9.9%,表明该分析方法的准确度和精密度均符合残留分析的要求。方法检出限 (LOD) 为0.15 ng,定量限 (LOQ) 为0.005 mg/kg。田间试验结果表明,依维菌素在杨梅上的平均初始残留量为0.21~0.88 mg/kg,半衰期为2.1~6.1 d,表明依维菌素属易降解农药,但由于其在杨梅上初始残留量相对较高,因此应对其潜在的残留风险予以关注。     

伊维菌素和丁氟螨酯复配最佳配比筛选及田间药效评价

本研究采用药膜法测定了伊维菌素、丁氟螨酯对朱砂叶螨的室内毒力。采用共毒因子法、共毒系数法对最佳配比进行筛选并加工成5%伊维菌素·丁氟螨酯水乳剂进行田间防效试验。结果显示:伊维菌素∶丁氟螨酯=1∶1时,共毒系数(CTC)高达265.66。伊维菌素·丁氟螨酯配比的数学模型为Y=-1.3787 X2+79.264 X-881.41,R2=0.9154,理论最佳配比为1∶1,CTC=257.77。田间防效显示:5%伊维菌素·丁氟螨酯水乳剂药效良好,有效成分用量为25~50mg/L时,药后3、10、20d防效均高于80%。     

低剂量乙基多杀菌素对小菜蛾解毒酶的影响

为探讨低剂量乙基多杀菌素对小菜蛾Plutella xylostella（L.）解毒酶的影响,采用叶片浸渍法,测定了乙基多杀菌素和多杀菌素对小菜蛾敏感种群的毒力,并比较了低剂量（LC25和LC50）处理6、12、24、48和72 h时小菜蛾体内羧酸酯酶（CarE）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多功能氧化酶系（MFOs）活性的变化动态。结果表明:乙基多杀菌素对小菜蛾的杀虫活性优于多杀菌素,处理48 h后其LC25和LC50浓度分别为0.018和0.048 mg/L,经此低剂量浓度处理后,小菜蛾CarE活性波动较大,6~24 h,处理组CarE活性高于对照组,且均呈先升后降趋势,24~72 h,处理组CarE活性均低于对照组,并且具有一定的时间效应;对GST具有明显的诱导作用,GST活性均高于对照组;对MFOs具有明显的抑制作用,除在48 h时相差不大外,其他时间MFOs活性均显著低于对照组。结果表明,GST可能参与了乙基多杀菌素在小菜蛾体内的代谢。     

天维菌素酰化衍生物的合成及杀虫杀螨活性

以天维菌素B、天维菌素B单糖苷和天维菌素B苷元为原料,经选择性C-5羟基保护,在C-13、C-4′和C-4″位引入不同酰基基团,合成了3个系列共23个天维菌素B酰化衍生物,并通过1H NMR、13C NMR和高分辨质谱对所有目标化合物的结构进行了表征。生物活性测定结果表明,所有衍生物对小菜蛾Plutella xylostella、朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus以及松材线虫Bursaphelenchus xylophilus均表现出不同程度的毒杀活性,其中天维菌素B C-4″位衍生物的活性优于C-4′位衍生物及13位衍生物。化合物8e对小菜蛾和松材线虫的毒杀活性最优,LC50值分别为9.2 mg/L和0.42 mg/L,化合物8b对朱砂叶螨的毒性最高,LC50值为0.0019 mg/L,均优于对照药天维菌素B。     

武夷菌素生物合成调控基因wysPⅢ的功能

为了深入研究武夷菌素生物合成调控机理,通过筛选对武夷菌素产量有影响的基因,明确基因的功能,利用分子育种技术来获得武夷菌素高产菌株。本研究通过基因敲除和过表达技术,获得了wysPⅢ基因的缺失突变株、互补菌株和过表达菌株,验证了该基因在武夷菌素生物合成过程中的功能和武夷菌素产量的关系。结果表明:wysPⅢ基因的过表达菌株生长速率加快,产孢时间提前,而缺失突变株较野生菌株生长变慢,产孢量下降,孢子颜色由正常的深灰色变为灰白色,菌丝变稀疏,但是构建好的菌株与野生型菌株相比,武夷菌素产量没有显著变化。由此可知:wysPⅢ基因调节菌株的生长和产孢特征,而不影响武夷菌素的产量,过表达菌株生长速率加快可缩短武夷菌素发酵时间,降低生产成本。     

武夷菌素(BO—10)技术交流会在哈尔滨召开

中国农科院植保所微生物研究室开发的武夷菌素(BO-10),在1990年末通过验收和成果鉴定后,于1991年5月转让给黑龙江省肇东市生物制品厂投入正式生产,并被列为全国生物制剂协作网推广药剂。1991年6月11-12日黑龙江省植保站主持在哈尔滨召开了《武夷菌素     

温度与光照对阿维菌素系列化合物毒力发挥的效应

系统研究了阿维菌素(avermectin)系列化合物在不同温度和光照下对小菜蛾的毒力效应.结果表明,该系列化合物对小菜蛾幼虫毒力在一定温度范围内符合正温度系数规律.阿巴菌素(abamectin)对小菜蛾幼虫的触杀毒力在16～28℃范围内提高了16倍左右,在22～28℃范围内增幅较大;依维菌素(ivermectin)在16～31℃范围内提高了19倍左右,并在22～25℃范围内增幅较大;埃玛菌素(emamectin)在16～31℃范围内提高了10倍左右.胃毒毒力结果表明,阿巴菌素在16～28℃范围内提高了30多倍;伊维菌素在16～31℃范围内提高了近40倍.另外,埃玛菌素表现出了极高的胃毒作用且随温度变化的幅度较大,其毒力在16～28℃范围内可提高1000倍以上.采用正交旋转组合设计方法研究表明,阿巴菌素对小菜蛾的毒力与浓度及施药后无光照时间有正交互关系,而与紫外光照时间和光照强度有负交互关系.     

武夷菌素产生菌CK-15遗传操作系统的优化

旨在优化武夷菌素产生菌不吸水链霉菌武夷变种CK-15的遗传操作系统,实现武夷菌素生物合成基因的高效敲除。以自杀性质粒pKC1132为载体,优化了外源DNA通过接合转移进入菌株CK-15的方法,确立了构建基因敲除突变株的最佳方案,最终成功得到了武夷菌素生物合成基因的双交换突变株。获得了菌株CK-15稳定高效的遗传操作系统,为进一步研究武夷菌素生物合成机理和对武夷菌素利用组合生物合成改造奠定基础。     

中生菌素可溶性粉剂助剂的研究

依据不同乳化剂对中生菌素原粉稀释液的表面张力及治疗白菜软腐病的效果,选用适合作为中生菌素可溶性粉剂的乳化剂Ｅ４。在０．１０ｇ／Ｌ的使用浓度下,Ｅ４高生菌菌素的治疗效果。综合分析７种载体对Ｅ４的饱和吸附量及对中生菌素活性的影响,选出Ｅ４的理想载体Ｃ３。     

武夷菌素对番茄灰霉菌的抑制作用及对番茄抗病性相关酶活性的影响

采用凹陷载玻片法测定了武夷菌素对番茄灰霉菌分生孢子萌发的抑制作用,在离体番茄叶片上测定了被武夷菌素处理后的番茄灰霉菌菌丝和分生孢子致病性的变化以及武夷菌素对番茄幼苗体内抗病性相关酶活性的影响。结果表明:武夷菌素对番茄灰霉菌的分生孢子有较强的抑制作用,其EC₅₀为14.1μg／mL。浓度为100μg／mL的武夷菌素可完全抑制孢子的萌发。武夷菌素能使灰霉菌菌丝和分生孢子的致病性明显下降,同时还能诱导番茄体内抗病性相关酶(SOD、POD、PPO、PAL)活性的增强,提高番茄幼苗的抗病性。