CRISPR/Cas9系统及其在粮油作物遗传改良中的研究进展

CRISPR是细菌或古生菌对入侵到体内的病毒,通过核酸特异性识别、Cas9蛋白酶切割产生的一种天然免疫系统。基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术,通过sgRNA介导和Cas9蛋白切割实现对靶基因的定点编辑。因其操作简便、编辑效率高、适用范围广的特点,迅速成为研究植物、动物、微生物基因功能的重要手段。同时,随着大量基因组信息和相应数据库的广泛建立,CRISPR/Cas9技术利用反向遗传学,配合生物信息技术,成为遗传改良、创新特异种质的一种极有效的新手段。本文主要对CRISPR/Cas系统的基本原理、CRISPR/Cas9基因编辑技术的作用机制,以及CRISPR/Cas9技术在粮油作物遗传改良、品种选育研究中取得的进展进行了综述,为遗传育种工作者利用该技术进行遗传改良和品种优化升级育提供有效的参考。     

CRISPR/Cas9系统在稻米品质改良中的应用

目前稻米品质改良已成为水稻育种的重要目标。稻米品质主要包括外观、加工、蒸煮食味和营养品质,由极其复杂的基因调控网络决定。CRISPR/Cas9系统作为新发展的定向基因编辑系统为水稻品质改良提供了重要的技术支撑,该系统具有操作简单、编辑效率高、易于多基因编辑等优点。本研究结合CRISPR/Cas9基因编辑系统及稻米品质相关基因的研究进展,详细介绍了CRISPR/Cas9基因编辑系统在稻米品种改良中的应用,讨论了该技术在水稻品质改良中存在的问题和改进策略,旨在为利用CRISPR/Cas9技术创制优质水稻新品种提供参考。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物基因工程育种中的应用

作为传统基因工程育种技术,转基因技术在植物分子育种工作中的应用受到技术本身缺陷及其他风险因素的限制。CRISPR/Cas9基因编辑技术是近几年新发展起来的一种基因组定向编辑技术。本研究介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术的基本原理和研究进展,分别比较分析了CRISPR/Cas9系统与前两代基因编辑技术(ZFNs和TALENs)和传统转基因技术之间的差异。至今为止,CRISPR/Cas9基因编辑技术已经在多种植物中实现了定点突变诱导(插入,缺失或修饰等)。由于成本低廉、操作简易和突变诱导率高等特点,CRISPR/Cas9系统作为一项高效植物遗传改良和育种研究的分子操作技术手段,应用前景十分广阔。     

CRISPR/Cas9系统在作物基因组编辑中的研究进展

CRISPR/Cas9基因组编辑技术通过向导RNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的定点编辑,由于该技术简便、高效的特点,在作物基因组编辑中被广泛使用。本研究主要对CRISPR/Cas9系统的组成与分类,工作原理以及g RNA构建方法进行了系统的介绍,并针对该系统存在的脱靶效应,总结了相应策略。同时,总结了在作物基因组编辑中CRISPR/Cas9系统的应用及研究进展情况,并对CRISPR/Cas9系统在作物基因编辑研究的方向做了展望,为作物的基因功能研究和分子设计育种提供参考。     

CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑文库筛选在植物中的应用

CRISPR/Cas9系统通过对基因的定向编辑,对基因组编辑产生了革命性的影响,成功促进了突变体筛选在基因组水平上的新发展。虽然该系统构建突变体文库速度快,针对性强,且具有巨大的应用前景,目前在一些重要作物的研究中已取得了重要进展,但其在木本植物中的应用仍处于初级阶段。本研究总结了CRISPR/Cas9系统在植物基因编辑文库构建方面的应用,探究该系统如何应用于构建突变敲除体库。将构建基因编辑突变体文库作为深入研究基因功能的手段,本研究综述的信息将对推进木本植物相关研究提供有益的借鉴。     

利用CRISPR/Cas9技术创建OsCOL9水稻突变体

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑,为作物的遗传育种提供了新的方向。以感病水稻品种丽江为材料,抗病基因OsCOL9为靶基因,探索该系统对水稻内源基因定点编辑效率以及获得有研究意义的突变体。OsCOL9基因CDS序列全长1 266 bp,编码一个422 aa蛋白,分子量大小约为45.6 k Da,蛋白质结构的N端含有B-box结构域,C端含有CCT(CONSTANS、CONSTANS-Like、TOC1)结构域。设计4个长20 nt的guide RNAs(gRNAs)靶点,靶向编辑OsCOL9基因的CDS起始区域以及外显子的末端,分别由U3、U6a、U6b以及U6c启动子驱动,提取T1转基因植株的基因组DNA并对编辑位点附近的DNA片段进行序列分析。结果表明,T1材料中OsCOL9的碱基缺失数最多可达59 bp,突变次数最多可达11次,取得较好的基因编辑效果。同时本试验出现了脱靶效应,因此着重探讨了降低脱靶效应的方法。由于CRISPR/Cas9系统在进行基因编辑时没有外源基因的导入,加上该技术的快捷、简便,对生物技术与传统育种的结合具有重要实践意义。     

CRISPR/Cas9基因编辑系统在水稻育种应用的研究进展

土壤退化、气候变化、生物和非生物胁迫的不利影响,对保障中国粮食生产安全和稳定提出了新的挑战。为了更快地实现水稻育种目标,在育种改良中整合分子育种新技术是当务之急。CRISPR/Cas9基因编辑技术具有时间周期短、操作简便快捷、编辑效率高等优点,已成为植物科学和水稻分子育种的重要工具,在水稻种质资源创制和遗传改良中得到广泛应用。本研究在阐述CRISPR/Cas9系统工作原理的基础上,综述了其在水稻株型改良、产量性状、品质改良、抗病性和抗逆性改良、水稻雄性不育系创制以及无性繁殖等方面的研究进展,并对基因编辑技术在东北水稻育种中的应用前景进行了展望。     

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥REVOLUTA基因突变体的鉴定

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行定点编辑,为获得基因缺失突变体提供了新的工具。HD-ZipⅢ家族成员REVOLUTA(REV)是植物发育过程中的关键转录因子。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥REV进行特异性定点编辑,构建REV基因编辑表达载体,并利用农杆菌介导的花序浸染法将其转入拟南芥。经潮霉素抗性平板筛选和PCR扩增及测序鉴定,获得7棵转基因株系。对转基因植株REV基因的测序结果显示,有3株均成功在靶点1处产生编辑,且其中1株在靶点2处也成功编辑。该基因编辑突变体的获得为后续深入研究REV基因在拟南芥形态发育过程中的作用提供了新的遗传材料。     

转录后基因沉默在植物改良方面的应用

基因沉默是生物自身的一种表达调控机制。目前,在植物生物学领域,该技术普遍应用于培育抗毒作物、研究植物基因组功能、研究植物雄性不育、作物遗传改良等方面。PTGS技术是基因沉默技术中的一种,以RNA介导的PTGS为主,被广泛应用于植物转基因技术、基因组功能、植物的病毒防御以及遗传改良。除此之外,PTGS技术也会与其他基因工程技术联合,应用于植物改良。PTGS技术与CRISPR/Cas9技术相联合被应用于转基因植物改良,快速获得纯和转基因植物。详细介绍了PTGS技术应用于植物改良,总结了其联合CRISPR/Cas9应用于植物改良,以及目前PTGS技术可能面临的问题,有利于帮助理解和推动PTGS技术在植物改良的广泛应用,并为从事相关研究的科研工作者提供思路与指导。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在玉米分子育种中的应用概述

玉米是我国第一大粮食作物,有效提升玉米产量和品质对保障我国粮食安全起着至关重要的作用。简要论述了CRISPR/Cas9 基因编辑技术研究历程、编辑类型和作用原理,以及在功能基因验证、玉米产量、品质改良和抗逆育种方面的应用,说明了在玉米基因组水平上进行基因定向编辑改造对玉米分子育种具有重要研究和应用价值。通过借鉴相关国家对基因编辑作物进行监管的措施,为不断完善我国的监管政策提出了一些对策建议。     

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及其在作物品种改良中的应用

基因组编辑技术是用特殊的核酸酶对基因组进行精准修饰的一种新兴技术。2013 年研究人员发现了CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统,将其中的CRISPR/Cas9 系统成功改造成RNA引导的核酸内切酶,发展了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术。该技术能够对包括植物在内的几乎所有物种的基因组进行高效、精准的定点修饰,而且程序简易、操作方便灵活,加速了遗传工程、功能基因组学的研究,给生命科学的各个领域带来了革命性变化。本综述回顾了CRISPR/Cas9 的出现、改进与发展,简述了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术的作用机理,归纳总结了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术在作物品种改良、提高作物品质和产量中的应用,最后,分析了该技术在作物品种改良中的发展前景及应用价值,以期为合理利用该技术进行种质创新、品种改良提供理论依据。     

基于优化sgRNA系统提高海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑功效的研究

CRISPR/Cas9基因组编辑体系已经在多种作物中被建立,其最大的优势在于能简单高效定向创制突变体。然而,CRISPR/Cas9基因组编辑体系在实际操作过程中经常会出现没有编辑的情况,或者靶向编辑目的基因的同时也会引发不同程度的脱靶效应,这对CRISPR/Cas9基因组编辑技术的运用带来不利影响。本研究基于前期在海岛棉体细胞中建立的CRISPR/Cas9基因组编辑体系,通过对构建Cas9不同密码子优化方式、不同PAM位点个数和不同靶位点数量的编辑载体,来分析比较编辑效率和脱靶效应的差异。结果表明, 2种Cas9密码子不同优化方式的编辑载体产生的编辑效率和脱靶效应无显著差异;优化后的双PAM位点的编辑效率显著高于单PAM位点,且脱靶效率显著较低;大部分双靶序列编辑效率均高于单靶序列且脱靶效率较低。上述研究结果为今后优化CRISPR/Cas9介导的海岛棉基因组编辑体系奠定了重要的理论依据。     

基于棉花U6启动子的海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑体系的建立

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是基因功能研究的一种强有力的工具, 目前已在许多生物体中成功实现内源靶向基因的突变。利用已克隆的海岛棉新海16的2个U6启动子, 分别构建带有新海16内源基因(GbGGB和GbERA1)靶位点DNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。以新海16的胚性愈伤组织为供试材料, 制备海岛棉的原生质体。通过PCR方法大量富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段(包括GbU6::sgRNA和CAMV35S::Cas9两部分), 并利用PEG法转化海岛棉的原生质体。对原生质体基因组DNA进行酶切后PCR, 成功检测到内源靶基因的突变现象。对PCR产物进行克隆测序, 结果显示序列突变的类型主要以碱基替换为主, 少数为碱基缺失。结果表明基于海岛棉U6启动子的CRISPR/Cas9基因编辑系统能在海岛棉中实现靶向基因编辑的功能, 为棉花功能基因组学研究提供了重要的技术基础。     

CRISPR/Cas基因编辑系统及其在植物中的研究进展

靶向基因编辑系统是一种研究植物基因功能的工具。其中,CRISPR/Cas基因编辑系统的克隆策略相对简单,成本低廉,因而在生物学界获得了广泛的关注。为了更好地对其在植物中进行研究,笔者介绍了该系统的基本结构特征与作用机理,归纳了在拟南芥、烟草、水稻等植物中对该系统进行的报道,分析了该系统尚需改进的问题如脱靶效应,探讨了多种解决方法,如优化sgRNA序列长度、利用双Cas9切口酶、合成fCas9复合体以及应用RFNs二聚体等,以降低脱靶效应。     

Recent developments in genome editing and applications in plant breeding

Increasing genetic variation beyond natural variation is an important aim in plant breeding. In the past 70 years, random mutagenesis by irradiation or by chemicals has created numerous mutants which have been frequently used in breeding. However, their application is hampered by the mutational load due to many background mutations. In the past 10 years, new techniques for site‐directed mutagenesis have been introduced to plant breeding which are commonly referred to as “genome editing.” Among these, the CRISPR/Cas9 system turned out to be the most efficient and easy to apply. DNA is cleaved by a nuclease precisely at a target site where a mutation is likely to be beneficial. The DNA is healed by the cellular repair system either by error‐prone non‐homologous end joining or by homologous recombination, by which small DNA fragments can be inserted at the target site. In this review, we describe the application of targeted mutagenesis to crop plants and the modification of agronomically important traits, which could have direct impacts on plant breeding.     

Functional Identification of Cotton U3 and U6 Promoters in the CRISPR/Cas9 Genome Editing System

[Objective] The function of U3 and U6 promoters that were cloned from sea-island cotton were identified in order to provide more available U3 and U6 promoters for the construction of cotton CRISPR/Cas9 multi-sites gene editing system. [Method] Two CRISPR/Cas9 gene editing vectors were constructed, in which sgRNA were driven by GbU6-7P and GbU3-2P, respectively, and GGB, a negative regulator in drought tolerance, was used as target gene. The function of the vector were identified in cotton leaf protoplast of Xinhai 16. The core fragment of CRISPR/Cas9 gene editing vector were enriched by Polymerase chain reaction method and were delivered into protoplast through PEG transient transformation. Then genomic DNA were extracted from protoplast. Gene mutations were analyzed using Enzyme digest/Polymerase chain reaction and sequenced. Finaly the mutation efficiencies of the CRISPR/Cas9 system were calculated and the frequency distribution of the mutation in target site were drawn in order to confirm the authenticity of the mutation. [Result] All type of mutation in target loci were base substitution. [Conclusion]Both CRISPR/Cas9 gene editing systems based on GbU3-2P and GbU6-7P promoters could successfully edit the sequence of cotton GGB gene and cause gene mutation.     

利用CRISPR/Cas9技术创制大豆高油酸突变系

大豆是重要的油料作物,其种子脂肪酸中油酸含量是评价大豆油脂品质的重要指标之一。本研究设计了分别由AtU3d、AtU3b和AtU6-1启动子驱动、长20 bp的guide RNA (gRNA)靶点以靶向编辑GmFAD2-1A基因的外显子区,首先将这3个靶点一起组装到pYLCRISPR/Cas9-DB载体上,然后利用农杆菌介导的方法转化大豆材料华夏3号。通过PCR技术及测序分析对T1代转基因大豆植株靶点编辑情况进行检测,获得纯合GmFAD2-1A大豆突变体。GmFAD2-1A突变大豆植株在株高、主茎节数、单枝分枝数、叶形、花色、种皮色、种脐色、生育期等方面与对照大豆植株没有显著差异;而GmFAD2-1A突变体大豆种子油酸含量显著高于对照大豆品种华夏3号,说明GmFAD2-1A是油酸代谢过程中的关键基因。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功对控制大豆油酸基因GmFAD2-1A进行编辑,获得稳定的纯合GmFAD2-1A大豆突变体材料,为高油酸育种提供了新的种质资源并创建了方法。