BvGLP1过表达增强了转基因小麦对根腐病的抗性

类萌发素蛋白(germin-like protein, GLP)是一类含有cupins结构域的糖蛋白, 在植物基础抗性等方面起着重要作用。本研究人工合成了甜菜GLP基因BvGLP1, 并利用基因重组技术构建了受韧皮部特异表达启动子RSS1P驱动的BvGLP1基因单子叶植物表达载体pA20-RSS1P::BvGLP1。通过基因枪介导法将其转入小麦品种扬麦18中, 对转基因扬麦18的T₀至T₃代植株中BvGLP1进行了PCR、半定量RT-PCR和荧光定量QPCR检测, 并对转基因小麦进行根腐病和纹枯病抗性鉴定。结果表明, BvGLP1已转入转基因小麦扬麦18, 并能在转基因小麦中遗传、转录表达; 5个转BvGLP1基因小麦株系的根腐病抗性比受体品种扬麦18有显著提高, 说明BvGLP1过表达增强了转基因小麦对根腐病的抗性。     

抗纹枯病、根腐病的转SN1基因小麦的获得与鉴定

SN1是源于马铃薯的一种抗菌肽, 可以抑制多种植物病原菌的生长。小麦纹枯病(主要病原菌为禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis)和根腐病(主要病原菌为平脐蠕孢菌Bipolaris sorokiniana)是小麦的主要土传真菌病害。本研究利用基因工程技术构建了SN1基因的单子叶植物表达载体pA25-SN1, 它受玉米泛素(ubiquitin)启动子的控制;采用基因枪法将pA25-SN1转化小麦推广品种扬麦18幼胚愈伤组织4 000块, 获得203株再生植株, 通过PCR检测出阳性植株55株, 转化率为1.38%。对转SN1基因小麦T₀~T₂代植株, 进行外源基因的PCR、Southern blot、RT-PCR、荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析和小麦纹枯病菌与根腐病菌接种及其抗病性鉴定。结果表明, 转入的SN1基因已经整合到转基因小麦的基因组中, 能够在转基因小麦中遗传、转录与表达。SN1基因的表达提高了转基因植株对小麦纹枯病和根腐病的抗性, 其抗病性可以遗传。     

抗纹枯病、赤霉病的转TaPIEP1基因小麦的分子鉴定与选育

小麦纹枯病(主要病原为禾谷丝核菌)和赤霉病(主要病原为禾谷镰刀菌)已成为我国小麦生产的重要病害。TaPIEP1是从小麦中分离到的1个病原诱导的基因,其编码蛋白是可与GCC-box顺式元件结合、转录激活型的ERF转录因子。本研究以8个转TaPIEP1基因小麦株系的T₄和T₅代植株为试材,进行了外源转TaPIEP1基因的PCR检测、Southern杂交、RT-PCR与Q-RT-PCR的分析以及纹枯病菌、赤霉病菌接种与抗性鉴定。结果表明,外源TaPIEP1基因在转基因小麦中能够稳定遗传,以单拷贝或双拷贝整合到7个转基因小麦株系基因组的不同位点;外源TaPIEP1基因在转基因小麦中能超量表达;与受体扬麦12相比,TaPIEP1表达水平高的8个转基因小麦株系对纹枯病抗性显著提高,4个株系中一些材料对赤霉病抗性显著提高,3个株系中一些材料兼抗纹枯病和赤霉病,说明TaPIEP1正向参与了小麦对纹枯病和赤霉病抗性反应,利用该基因通过基因工程可创制抗纹枯病、赤霉病的小麦新种质。     

组织特异表达启动子RSS1P在转TiERF1基因小麦中的应用

从水稻叶片中克隆了一个韧皮部组织特异表达的水稻蔗糖合酶启动子(RSS1P),将RSS1P与中间偃麦草乙烯反应因子基因TiERF1相融合构成组织特异表达的TiERF1基因表达盒,取代pAHC20中Ubi::bar基因表达盒,构建成无选择标记的韧皮部组织特异表达的pA20-RSS1P::TiERF1载体。利用基因枪将pA20-RSS1P::TiERF1与pAHC20载体混合、共轰击小麦品种扬麦12的幼胚愈伤组织,获得转RSS1P::TiERF1基因小麦。对该转基因小麦T₀和T₁代植株进行PCR、PCR-Southern、半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析,证实外源RSS1P::TiERF1基因已转入受体,并且具有可遗传性;转入的RSS1P::TiERF1基因仅在根、茎、叶中表达,以根部表达量最高,在种子内不表达。纹枯病抗性鉴定和主要农艺性状考察结果表明,与受体扬麦12相比,转RSS1P::TiERF1基因小麦对纹枯病的抗性有明显提高,与转Ubi::TiERF1基因小麦的抗病性相当,而且转RSS1P::TiERF1基因小麦的农艺性状没有明显改变,说明可以利用RSS1P启动子创造更实用的转基因小麦新种质。     

过表达TaPK-R1基因增强了小麦对纹枯病的抗性和耐冻性

小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)和倒春寒是小麦生产中重要的生物和非生物胁迫因子,本研究目的是利用转基因技术改良小麦的纹枯病抗性和耐冷性。利用构建的转基因载体pAHC25-MYC-TaPK-R1,通过基因枪介导法,将小麦AGC蛋白激酶基因TaPK-R1导入春小麦品种扬麦20,获得TaPK-R1过表达的转基因小麦。对T1至T4代植株进行PCR、RT-PCR、qRT-PCR、Western blot分析,筛选到3个转基因小麦株系,外源TaPK-R1基因能够在其植物体内遗传和超量转录,并翻译成蛋白质。利用致病力不同的R. cerealis菌株R0301和WK207,分别对3个转基因株系T1至T2代和T3至T4代进行纹枯病抗性鉴定,发现TaPK-R1过量表达提高了转基因小麦的纹枯病抗性,3个转基因株系各世代的纹枯病平均病级为1.16~2.11, 病情指数为23.20~42.10,而对照扬麦20的纹枯病病级为2.55~3.60,病情指数为51.00~72.00。用?9℃低温处理三叶一心期小麦幼苗24 h,对照扬麦20的存活率为17%,3个转基因小麦株系的存活率分别为52%、79%和96%。上述结果表明,TaPK-R1过量表达能显著增强小麦对纹枯病的抗性及对冻害的耐受性, 所获得的3个转基因小麦株系可作为潜在的抗源材料。     

过量表达拟南芥NPR1基因提高小麦纹枯病的抗性

拟南芥NPR1基因是植物重要的抗病调控因子,转基因过表达该基因可以赋予植物广谱抗性.为明确该基因在小麦抗纹枯病基因工程中的应用潜力,本研究构建了由玉米ubiquitin启动子驱动的拟南芥NPR1表达载体,采用基因枪介导法导入到小麦品种扬麦12号中,获得20株转基因植株.对14个外源基因纯合株系的半定量RT-PCR和测序分析结果显示,外源拟南芥NPR1基因已经导入转基因小麦并有不同水平的表达,部分转基因株系拟南芥NPR1基因发生重排；纹枯病抗性鉴定结果表明,转基因株系中拟南芥NPR1基因的正确表达可以减轻纹枯病菌引起的病症发展,提高转基因小麦的纹枯病抗性.     

转Gastrodianin基因提高小麦赤霉病和纹枯病的抗性

天麻抗真菌蛋白Gastrodianin在体外可以抑制多种病原真菌的生长。为检验转Gastrodianin基因小麦对真菌病害的抗性,采用基因枪法将由ubiquitin启动子驱动的Gastrodianin基因导入小麦品种扬麦158和Alondra, 获得14株纯合的转基因株系。外源基因的PCR检测、染色体荧光原位杂交、半定量RT-PCR分析结果表明,外源Gastrodianin基因在转基因小麦T₅代植株中已经纯合并有不同水平的表达;赤霉病和纹枯病抗性鉴定结果显示,Gastrodianin基因的表达能抑制病原菌在转基因植株中生长,从而减轻病原菌引起的病症发展,且两种病害的减轻程度与Gastrodianin基因的表达水平正相关。     

转AcAMP-sn基因抗全蚀病小麦新种质的创制与鉴定

抗菌肽是一类具有广谱抗菌性的小分子多肽,在植物防卫反应中起着重要作用。本研究人工合成了洋葱抗菌肽基因AcAMP-sn,利用基因重组技术构建了该基因的单子叶植物表达载体pAHC25::AcAMP-sn,使AcAMP-sn基因的表达受玉米Ubiqutin启动子控制。采用基因枪介导法,将AcAMP-sn基因导入小麦品种扬麦18,利用PCR、半定量RT-PCR及荧光实时定量RT-PCR检测、分析转基因小麦T0~T4代目的基因及其表达量,并对转基因植株进行全蚀病的抗性鉴定。PCR检测结果表明,导入的AcAMP-sn基因能够在转基因小麦中遗传。与受体扬麦18相比,在5个转基因小麦T4代株系中,AcAMP-sn基因的表达量及全蚀病抗性均显著提高,且全蚀病菌的相对含量明显下降,说明AcAMP-sn基因的过表达可以增强转基因小麦对全蚀病的抗性。     

小麦TaPIM1基因的克隆及其转基因烟草的抗病性分析

TaPIM1是从小麦中克隆获得的1个病原诱导的小麦MYB基因,编码由323个氨基酸残基组成的蛋白TaPIM1。TaPIM1具有R2R3类MYB转录因子的典型结构,即2个保守的MYBDNA结合域(R2和R3)、核定位位点和酸性激活区。TaPIM1的全长氨基酸序列与已克隆MYB蛋白的一致性仅为43.69%以下,为植物MYB转录因子家族R2R3亚群的一个新成员。小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)侵染可快速诱导抗病小麦中TaPIM1基因的上调表达,说明TaPIM1可能参与小麦对纹枯病菌、根腐病菌的防御反应。将TaPIM1基因构建到由组成型强启动子CaMV35S控制的双子叶转化载体pBI121上,通过农杆菌介导法将其转入烟草W38品系。通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,鉴定出转TaPIM1基因烟草T0代株系M66、M102、M110等12个株系。对转基因烟草T1代株系进行PCR、RT-PCR分析和青枯病菌抗性分析,结果表明,TaPIM1超量表达的转基因烟草株系M66、M102和M110对青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的抗性显著高于未转基因烟草对照,TaPIM1正向调控烟草对某些病原菌的防御反应。     

抗根腐病的TaMYB86过表达转基因小麦的创制与分子功能鉴定

小麦根腐病是一种难以防治的小麦土传病害。TaMYB86是一个小麦中受根腐病菌诱导表达的MYB编码基因。本文构建了TaMYB86的过表达转基因载体pUbi:MYC-TaMYB86,利用基因枪介导法将其转入推广小麦品种扬麦16。对转TaMYB86基因小麦T0-T3代植株进行分子特征分析和抗病鉴定。PCR检测结果表明,外源TaMYB86已转入3个转基因小麦株系中; qRT-PCR结果显示,TaMYB86在3个转基因小麦株系中的表达量显著高于在未转基因扬麦16中,约为未转基因扬麦16中的5~6倍,表明TaMYB86可在转基因小麦中过量转录; Western杂交结果表明,引入的TaMYB86可在上述3个转基因小麦株系中翻译表达。对转TaMYB86基因小麦与未转基因扬麦16进行根腐病菌接种与抗病鉴定表明,3个转TaMYB86基因小麦株系在T1-T3代的根腐病病情指数分别为31.75、50.00、45.00; 37.75、37.50、38.50; 41.75、31.25、37.50; 在3次鉴定中未转基因扬麦16的根腐病病情指数分别为75.04、54.17、65.38,转TaMYB86基因小麦T1~T3代的根腐病抗性均显著高于未转基因扬麦16 (P < 0.01)。与未转基因扬麦16相比,转TaMYB86基因小麦中3个下游防卫基因(PR10、PR17c和Chit1)的转录水平也显著上调。以上结果说明,TaMYB86过表达可显著增强转基因小麦的根腐病抗性,在小麦防御根腐病过程中起正向调控作用。     

转Rs-AFP2基因小麦的分子分析及其纹枯病抗性

Rs-AFP2属于r-硫堇类抗菌肽,主要通过形成离子通道直接破坏细胞来杀灭病原菌。本研究通过基因枪介导法结合对目标基因的分子检测,证明已将外源Rs-AFP2基因转入小麦推广品种扬麦12中。通过逐株抗纹枯病接种鉴定、PCR、PCR-Southern blot、Southern blot和 RT-PCR/荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析,对转Rs-AFP2基因小麦T₁至T₄代植株跟踪检测。结果表明,Rs-AFP2在转基因小麦中能够稳定遗传,以单拷贝整合到小麦基因组中,遗传方式符合孟德尔遗传规律,并能在转录水平上表达。对转Rs-AFP2基因小麦的抗病性、主要农艺性状以及Rs-AFP2表达活性分析结果表明,与受体扬麦12相比,Rs-AFP2表达活性高的转基因小麦植株对纹枯病抗性有明显提高,其抗病性可以遗传,而主要农艺性状没有明显差异,证明可以利用Rs-AFP2基因和基因工程途径创制抗纹枯病小麦新种质。     

转Rs-AFP2基因小麦的分子分析及其纹枯病抗性

Rs-AFP2属于r-硫堇类抗菌肽,主要通过形成离子通道直接破坏细胞来杀灭病原菌。本研究通过基因枪介导法结合对目标基因的分子检测,证明已将外源Rs-AFP2基因转入小麦推广品种扬麦12中。通过逐株抗纹枯病接种鉴定、PCR、PCR-Southern blot、Southern blot和 RT-PCR/荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析,对转Rs-AFP2基因小麦T₁至T₄代植株跟踪检测。结果表明,Rs-AFP2在转基因小麦中能够稳定遗传,以单拷贝整合到小麦基因组中,遗传方式符合孟德尔遗传规律,并能在转录水平上表达。对转Rs-AFP2基因小麦的抗病性、主要农艺性状以及Rs-AFP2表达活性分析结果表明,与受体扬麦12相比,Rs-AFP2表达活性高的转基因小麦植株对纹枯病抗性有明显提高,其抗病性可以遗传,而主要农艺性状没有明显差异,证明可以利用Rs-AFP2基因和基因工程途径创制抗纹枯病小麦新种质。     

小麦-偃麦草杂种后代及小麦种质资源对纹枯病的抗性

为鉴定小麦-偃麦草杂种后代以及我国小麦品种和育种中间品系对纹枯病的抗性,并且解析偃麦草染色体与纹枯病抗性的关系,在徐州和南京两个试点,采用田间病圃法对321份普通小麦品种或品系和56份小麦-偃麦草杂种后代材料进行了纹枯病抗性鉴定。在徐州试点没有发现高抗纹枯病的种质,但是有52份材料表现中抗反应型,包括34份普通小麦材料,其中萧农8506-1、小偃81、冀植4001、农大195、徐州8913和京东3066A-3的相对抗病指数高于0.7。在南京试点,全部普通小麦材料都不抗纹枯病,只有5份小麦-偃麦草种质表现中抗反应型。部分小麦-偃麦草种质的病情指数不但显著低于感病对照品种苏麦3号和扬麦158,而且还低于抗病对照品种安农8455和宁麦9号,如小麦-中间偃麦草4Ai#2或4Ai#2S附加系、代换系和易位系材料TA3513、TA3516、TA3517和TA3519及小麦-长穗偃麦草第4部分同源群染色体代换系SS767,说明中间偃麦草4Ai#2染色体和长穗偃麦草4J染色体可能与纹枯病病情指数降低有关。基因组原位杂交分析结果表明,4Ai#2染色体属中间偃麦草的J^s基因组,而长穗偃麦草与纹枯病抗性相关的第4部分同源群染色体属J基因组。虽然纹枯病与眼斑病的发病部位和症状非常相似,但抗眼斑病基因Pch1 (Madsen)和Pch2 (Cappelle-Desprez)对纹枯病无效。