西藏青稞品种藏青13高氮处理的SSH文库构建及分析

为了分析青稞高氮处理相关基因的表达,以藏青13为实验材料,通过抑制差减杂交构建了青稞高氮处理下的差减c DNA文库。在随机挑取的281个阳性克隆中,测序获得219条高质量的EST,含有212条非重复且与Genbank中的基因或蛋白具有较高的同源性的序列。对其进行Blast2Go功能注释可将差异表达的基因定位到细胞组件、分子功能和代谢过程3大类内。通过KEGG代谢途径分析,212个比对结果中的117个ESTs有详细的KO功能注释,定位到17个具体的代谢途径上,且主要定位在光合作用碳固定途径和氮素代谢途径。此外,分析还发现这些基因主要是编码参与结构和功能代谢合成途径中的一些酶,且参与信号转导、转录调节和光合作用等生理过程,说明这些基因很可能参与到青稞在高氮处理下的抗性反应中。     

青稞转录组SSR位点及其基因功能分析

为了探讨青稞转录中SSR位点信息及其所在基因的生物学功能,使用MISA软件分析青稞转录组中SSR的分布频率和重复基元的基本类型,通过BLASTX对含有SSR的Unigene与nr、COG、Swiss-Prot和KEGG等公共数据库进行比对和功能注释。结果表明,在青稞转录组拼接得到的58 065个Unigene中发现9 576条序列中含有11 930个SSR位点,SSR发生频率为16.49%,平均每6.63kb出现1个SSR位点,共有119种重复基元(motif)。青稞转录组SSR出现频率最高的是三核苷酸重复基元(64.19%),其次是二核苷酸重复基元(24.05%)。AG/CT和AGG/CCT、CCG/CGG、AGC/CTG分别是二核苷酸重复和三核苷酸重复中的优势重复基元。在转录组中SSR重复次数以5~12次为主,基序长度主要集中在12~25bp,平均长度为21.15bp。9 576个含SSR的Unigene与nr、COG、Swiss-Prot和KEGG等公共数据库进行BLASTX比对,分别得到7 987、5 559、5 588和2 077个注释。通过基因功能注释发现青稞转录组中含SSR的序列主要与生物的基础代谢相关。     

利用转录组测序对不同贮藏温度处理玉米种子的苗期差异表达基因分析

利用常温与低温贮藏3个月的玉米杂交种种子进行标准发芽试验,取发芽7 d玉米幼苗进行转录组测序分析,通过GO、KOG、KEGG数据库分析处理差异表达基因的功能和参与的调控路径。以常温贮藏处理为参考,对转录组测序数据进行比较,低温贮藏处理共获得35个差异表达基因,其中上调基因28个、下调基因7个。在GO功能注释分析中,有26个差异基因被注释,可为分为18个功能分类。KOG功能注释分析发现,这些差异表达基因共获得19个功能注释,涉及到8个功能类别。KEGG通路分析发现,共有23个差异表达基因注释到13个代谢通路中,其中,谷胱甘肽代谢、抗坏血酸和肌醇代谢、甘油磷脂代谢等通路显著富集。低温贮藏处理玉米种子活力指数显著高于常温贮藏处理。通过两个处理转录组分析,RNA-seq数据揭示,谷胱甘肽、抗坏血酸和肌醇、甘油磷脂等中涉及的基因优先表达于低温贮藏处理中,表明LTS可以促进谷胱甘肽代谢,从而提高植物抗氧化性,同时可以提高玉米抗逆性。     

西藏青稞品种甘农大7号白粉菌诱导早期应答基因SSH文库的构建及分析

以接种白粉菌后24 h甘农大7号材料的叶片为实验组(tester),未接种白粉菌材料的叶片为驱动组(driver),分别提取c DNA,利用抑制差减杂交技术,构建"甘农大7号"白粉菌诱导早期应答基因差减文库。对所获得的EST序列去污染后,通过与核酸和蛋白数据库进行序列同源性比对,发现其中有219条非重复序列与已知序列同源性较高。对这些序列进行GO和KEGG功能分析,发现这些注释的基因主要在信号转导、基础物质代谢等方面发挥作用。本结果为后续探究青稞品种甘农大7号抗白粉病的分子机制提供了方向及理论依据。     

利用抑制差减杂交分离芝麻耐湿性相关基因

为分离芝麻耐湿性相关基因,以敏感品种鄂芝2号和耐湿品种2541为实验材料,通过抑制差减杂交(SSH)构建了芝麻湿害胁迫的差减cDNA文库。在随机挑取的162个阳性克隆中,测序获得146条高质量的EST,含有106条非重复序列(Unigenes)。其中82条非重复序列与GenBank中的基因或蛋白具有较高的同源性,占全部序列的77.36%。对有功能注释的39条同源序列分析发现,其涉及植物的基础物质、能量代谢、信号转导、转录调控和解毒防御等方面,说明这些基因很可能参与到芝麻的耐湿性反应中。     

小麦近等基因系幼穗二棱期转录组分析

抽穗期是与小麦适应性直接相关的一个很重要的性状,直接或间接影响小麦的产量和抗性。为明确控制抽穗期的关键表达基因,以抽穗期分别为196d和184d的小麦近等基因系Y57和96-2为材料,对其二棱期幼穗分别构建转录组测序文库,利用Illumina HiSeq 2500平台进行RNA-seq测序;将获得的clean read与中国春参考序列比对,得到unique read,采用FPKM法计算基因表达量,对差异表达基因进行功能注释、GO和COG功能分类以及KEGG通路分析。结果表明,供试材料经过测序获得质量不低于30的碱基比例(Q30)均高于85.5%;Y57和96-2分别有60 246 194和60 963 580条clean read,其中63.11%和69.51%能与参考基因组序列匹配。共筛选到395个差异表达基因,有382个基因得到功能注释;有298个基因获得GO功能注释,主要涉及细胞组分、结合、细胞反应和代谢过程;COG注释的基因主要涉及一般功能、信号转导机制和转录;KEGG功能注释分析发现,显著富集在光合作用-天线蛋白通路上的基因均上调表达。编码丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A的基因在Y57中几乎不表达,而在96-2中表达量较高。进一步分析发现,多个与生长发育、抽穗开花相关的转录因子在两个材料中的表达差异显著。此结果可为深入研究抽穗期相关基因和穗发育调控机制奠定基础。     

西藏青稞品种喜玛拉雅10号干旱胁迫的SSH文库构建及干旱诱导表达基因分析

为了研究西藏青稞抗旱的分子机制,以西藏耐旱青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum HK.f.)品种喜玛拉雅10号为材料,利用抑制性差减杂交技术(SSH)构建青稞苗期叶片干旱胁迫诱导基因表达的正向差减文库。挑取600个阳性克隆进行PCR验证,并对验证后的单克隆进行测序分析,共获得420个有效序列。去除冗余序列和嵌合序列后,获得220条高质量EST序列,其中183条singlets,37条contigs。BlastN分析表明,其中189个EST序列可以在GenBank的unigene中找到同源序列,31个未能找到unigene同源序列;BlastX分析表明,62个EST序列unigene与未知功能蛋白或假定蛋白有较高的相似性;158条EST序列与已知功能蛋白有较高的同源性。获得的EST序列多数不仅与植物的非生物胁迫相关,也与植物的生物胁迫反应相关,说明植物在胁迫反应中有明显的共同机制。其中与大麦表达序列高度同源的EST占58%;这些基因涉及参与信号转导和转录调节的基因(11.96%),编码保护、防御和胁迫耐受蛋白的基因(9.78%),跨膜转运相关基因(5.43%),光合作用基因(6.52%),参与结构和功能代谢合成途径中的一些酶(30.43%)等代谢过程。实验结果表明,青稞在干旱复水条件下可诱导一系列特异基因的表达,如参与抗旱反应相关酶和蛋白基因锌指蛋白、衰老相关蛋白、CAS、细胞色素P450、热激蛋白、胁迫诱导蛋白,以及LEA蛋白、脱水蛋白、P5CS等保护蛋白基因。用KOBAS系统将56个EST定位到32个Pathways中,初步分析发现,谷氨酸盐代谢途径(Glutamate metabolism)、精氨酸和脯氨酸代谢途径(Arginine and proline metabolism)、泛素蛋白介导的蛋白质水解代谢(Ubiquitin mediated proteolysis)途径可能与青稞抗旱相关性较大。     

基于单分子实时测序的油莎豆全长转录组分析

油莎豆以其适应性广、产量和含油量高而成为我国的新型油料作物。为解析油莎豆的遗传基础，服务于 育种和分子生物学研究，采用单分子实时测序技术构建了油莎豆高质量的全长转录组，混合样本的组织来源包括 块茎、匍匐茎、根、芽、叶片、叶鞘、花、花茎等。研究基于23.20 Gb高质量的原始数据提取获得环形一致序列319 568 条，其平均长度和测序深度分别为2101 bp和43×；通过聚类、校正和去冗余最终得到高质量的序列57 849条，合计 121.79 Mb；转录组的完整性约为79.58%，其中约有76.20%的为全长转录本；通过比对NR、Swissprot、GO、KOG、egg⁃ NOG、Pfam、KEGG等数据库，共获得52 424条序列的注释信息，注释比例约为90.62%；此外，研究还预测获得3759 条lncRNA、43 060个SSR位点以及2300条转录因子序列。这些结果不仅增加了我们对油莎豆遗传特性的认知，同 时还为下一步开展基因表达谱分析、功能基因的挖掘与利用等奠定了坚实的基础。     

茶谷蛾成虫触角转录组及嗅觉相关基因分析

为筛选茶谷蛾嗅觉相关基因,采用IlluminaHiSeq 4000高通量测序平台分别对茶谷蛾雌雄成虫触角进行转录组测序及生物信息学分析,共获得茶谷蛾触角转录组37 708条unigenes。通过同源性比对,在NR数据库成功注释16 027条unigenes;有11 701条unigenes得到GO注释,根据其功能可分为细胞组分、分子功能和生物过程三大类40亚类;有6 047个unigenes得到KOG注释,按照功能分为25类;根据KEGG数据库,有12 009条unigenes注释到283个通路。根据注释信息,挖掘到238个候选嗅觉相关基因,包括108个气味结合蛋白基因,55个气味/嗅觉受体基因,26个味觉受体基因、25个离子型受体基因、11个化学感受蛋白基因、4个感觉神经元膜蛋白基因、4个感官知觉基因、4个化学感受受体基因和1个气味降解酶基因。通过基因差异表达分析,筛选出12个气味结合蛋白基因、9个气味/嗅觉受体基因、4个信息素结合蛋白、3个味觉受体基因、1个化学感受蛋白基因和1个离子型受体蛋白基因。本研究获得了茶谷蛾触角转录组数据,并鉴定出候选嗅觉相关基因,为进一步研究茶谷蛾的基因功能及嗅觉感受机制奠定分子基础。     

波罗蜜叶绿素缺失突变体嫩茎转录组分析

为探究叶绿素合成缺失对波罗蜜嫩茎发育的影响,以波罗蜜叶绿素缺失突变体（chlorophyll deficient mutant, CDM）嫩茎为材料进行转录组分析;经de novo组装后获得295 869个Unigenes,使用NR、NT、Swissprot、KEGG、KOG、Pfam和GO数据库进行序列比对,共注释了174 291个Unigenes。过滤低丰度基因后,筛选出22 988个差异基因。与对照（CK）相比,CDM中上调基因有379个,下调基因有22 609个。GO分类结果表明,共有3712个基因获得注释,并将其划分为分子功能（molecular function）、细胞组分（cellular component）和生物学过程（biological process）三大类,共48个功能组;此外,有2080个Unigenes参与到19条KEGG通路上,其中在黄酮类生物合成途径中有30个Unigenes。该研究通过转录组测序,分析叶绿素合成缺失对波罗蜜嫩茎发育的影响,为木本植物茎发育的研究提供数据基础。     

大麦在网斑病菌侵染后的转录组学分析

近年来，由子囊菌亚门真菌网斑病菌(Pyrenophora teres)引起的大麦网斑病在我国大麦（Hordeum vulgare L.)主产区大面积发生并流行，导致大麦产量和品质下降。为探索大麦响应网斑菌侵染的分子机制，以抗网斑病种质材料BYT-CYA3（B）和敏感型材料美41/I（M）为研究对象，利用转录组测序技术（RNA-Sep），分析了2个材料在接种网斑病菌后不同时间点的基因表达差异。结果表明，对比网斑病菌侵染后不同时间点的转录组测序数据，共鉴定出35 545个差异表达基因；网斑病侵染大麦3 h、6 h、12 h、24 h和72 h时，抗病材料与敏感型材料间富集到GO和KEGG途径的差异表达基因数目有明显区别；共获得435个网斑病菌侵染诱导表达基因；共筛选出182个主要参与过氧化物酶体（peroxisome）、代谢途径（metabolic pathways）、MAPK信号传导途径-植物（MAPK signaling pathway-plant）、植物-病原体相互作用（plant-pathogen）、植物激素信号转导（plant hormone signal transduction）、次生代谢物生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）等生物学过程的差异表达基因，推测这些基因与大麦响应网斑病菌侵染有关。随机从中选取10个基因进行了荧光定量PCR检测，并对其转录组测序结果进行定量分析，发现荧光定量PCR结果与转录结果趋势一致。本试验从分子水平初步探索了大麦对网斑病菌侵染的响应机制，为深入研究抗病基因提供了候选基因。     

基于RNA-seq技术分析野生大麦穗部发育基因的表达谱及其转录动态

为明确野生大麦穗部发育过程中基因表达的动态变化,以来自以色列的野生大麦Mehula 1-2为材料,对其在穗部发育的4个关键时期（开花后3、8、13和18 d)进行RNA-seq分析,并与栽培大麦穗部的基因表达谱进行了比较。结果表明,在野生大麦穗发育的4个时间点共鉴定到17 163个基因,其中11 273个为差异表达基因,包括635个转录因子相关基因;功能富集分析表明,这些差异基因主要富集到物质合成、代谢过程、物质运输、抗逆等相关过程或通路上;野生大麦和栽培大麦穗部基因的表达谱比较分析发现,两者共同表达的基因显著富集到细胞器、催化、代谢、调节及抗逆等相关通路上,而在特异表达基因方面,栽培大麦主要集中于甲基转移酶、次生壁生物合成、核糖体蛋白等相关基因,野生大麦主要集中于逆境抗性、花青素合成、钙调蛋白等相关基因。本研究发掘的与穗部发育相关的关键基因,丰富了大麦穗部遗传改良基因资源,为进一步解析野生大麦穗部发育关键基因的表达特性和调控机制奠定了基础。     

白粉病菌侵染条件下小麦酵母双杂交文库的构建及可用性检测

为解析白粉病菌侵染小麦以及小麦防御的分子机制,以抗白粉病种质N9134为材料,剪取白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici,Bgt)接种48 h后的叶片,提取总RNA,利用SMART技术进行反转录合成双链cDNA(ds-cDNA),并进行均一化处理和SfiI酶切处理,处理后的ds-cDNA分别连接pGADT7-SfiI三框载体,将连接产物转化至感受态细胞HST08中构建文库。通过滴度测定和PCR鉴定其库容量和基因重组率,最后收集细菌并提取质粒。经鉴定,该文库库容量大于1.0×10~6 cfu·mL~(-1),插入片段主要分布在400～2 000 bp之间,重组率为100%,冗余度为3%。利用酵母双杂交系统筛选cDNA文库,获得2个与热休克蛋白HSP40-70互作的蛋白质,分别为DnaJ类蛋白(DnaJ-like)和E3泛素蛋白连接酶AIP2(AIP)。综上表明,文库构建质量较好,为后续筛选抗逆关键基因奠定了基础。     

大麦驯化的主要性状及其相关基因

大麦(Hordeum vulgare L)是位于小麦、水稻和玉米之后的世界第四大主要作物。从野生物种转变为栽培种的驯化过程中,大麦的许多性状发生了改变。大量研究发现,这些驯化过程中变化的主要性状,都是相关基因突变导致功能丧失的结果,而且已克隆的驯化基因多数为转录因子。本文对非脆穗轴、六棱穗和裸颖果等大麦驯化的主要性状及其相关基因的研究进展进行了综述,以期为相关研究提供参考。     

大麦 PHT1基因家族的鉴定及表达特性分析

植物磷转运蛋白1(phosphase transporter protein 1,PHT1)家族在植物磷吸收和转运中发挥着重要作用。为研究大麦 PHT1基因家族成员的特性,利用生物信息学方法在全基因组范围内对大麦 PHT1家族成员进行鉴定,结果共鉴定到14个大麦 PHT1（ HvPT1～ HvPT14）基因,分布在2H、4H、5H和7H染色体上。根据系统发育关系、基因结构和保守蛋白基序,可将14个大麦 PHT1基因分为3个亚群。基于RNA seq数据对大麦品种GN121(磷高效基因型)根和叶片中12个 PHT1基因的表达模式进行分析,发现在低磷胁迫处理下,根中 HvPT1、 HvPT7、 HvPT10和 HvPT12基因以及叶片中 HvPT13基因均上调表达。进一步利用荧光定量PCR技术对大麦品种GN121和GN42（磷低效基因型）根中10个 PHT1基因的表达模式进行分析,发现两个品种根中 HvPT7、 HvPT8、 HvPT10、 HvPT12和 HvPT14基因在磷恢复后第3 d的表达量均显著低于低磷处理第22 d的表达量,推测这5个基因在低磷胁迫下参与磷的吸收和转运;此外 HvPT5基因在磷恢复后第3 d的GN42根中表达量显著下降,而在GN121根中的表达量显著上升,说明 HvPT5基因的表达与品种类型有关。     

荔枝快速碱化因子基因的克隆与表达分析

从已构建的荔枝果皮cDNA文库中挑取克隆测序,获得一条荔枝快速碱化因子(LcRALF)基因(GenBank登录号:EU024484).该基因的cDNA全长为666 bp,含1个381 bp的开放读码结构,编码126个氨基酸.生物信息学分析表明,该基因的氨基酸序列与拟南芥、烟草等物种的RALF基因一致性较高,具有RALF基因氨基酸序列的典型特征.RT-PCR分析表明,该基因在荔枝果皮中特异表达,且在新采收的荔枝果皮中表达量最高.随着果皮的衰老该基因表达量逐渐下降.     

大麦阶段性低温诱导白化突变体的转录组分析

叶色突变体是研究叶绿素代谢、叶绿体发育和光合作用的重要材料。本研究从大麦鄂啤2号(野生型)⁷Li离子突变体库中筛选获得一份大麦阶段性低温诱导白化突变体(SLTW),该突变体受低温诱导后,于五叶期叶片开始出现白化现象,温度升高后于拔节期逐步恢复为绿色。与野生型相比,该突变体叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均显著下降。SLTW突变体与野生型的转录组比较分析表明,差异表达基因显著富集到类胡萝卜素合成、四吡咯结合、血红素结合、铁结合、氧化还原过程、光合作用等通路上。叶绿素合成基因(ID号为HORVU.MOREX.r2.2HG0174230)和类胡萝卜素代谢基因(ID号为HORVU.MOREX.r2.5HG0354290)在SLTW突变体与野生型中的表达量均差异显著,且均检测到SNP突变,推测这些基因可能与大麦阶段性白化有关。编码光合作用-天线蛋白、细胞色素P450、跨膜转运(ABC转运)蛋白及转录因子也可能是调控大麦阶段性白化的潜在候选基因。     

柱花草编码CP12蛋白的cDNA克隆及其序列分析

叶绿体蛋白12(chloroplast protein 12,CP12)是一个存在于叶绿体与光合作用相关的蛋白。以亲本柱花草热研2号叶片为材料,根据豌豆CP12及柱花草响应低温的cDNASSH文库中CP12克隆片段设计引物,采用RT-PCR,从柱花草cDNA中克隆获得柱花草热研2号CP12基因全长序列,并在GenBank登陆(登录号:HQ906668),命名为SgCP12。柱花草热研2号CP12基因全长426bp,包含399 bp的ORF。通过生物信息学分析结果表明,CP12的C端具有高度保守的结构域。同源性分析表明,该基因与豌豆的CP12基因氨基酸序列同源性最高。