基于EST数据库的葡萄APETALA2基因cDNA克隆及其表达分析

APETALA2(AP2)是拟南芥生长发育特别是花器官发育过程中重要的调控基因。利用生物信息学方法以拟南芥APETALA2基因cDNA序列作为模板,对葡萄EST数据库进行同源检索筛选,电子克隆出葡萄AP2基因(Vv-AP2)cDNA序列。以香悦葡萄花cDNA为模板,根据电子克隆的葡萄AP2基因cDNA序列设计特异引物,分别利用RACE技术和特异PCR技术获得该基因3’末端和5’末端,序列拼接后获得葡萄的APETALA2基因的cDNA全长。该cDNA的全长为2 208 bp,命名为Vv-AP2。Vv-AP2核苷酸序列有一个1 536 bp完整的开放读码框(ORF),其5’与3’末端非翻译区分别为268 bp和376 bp。其中,3’末端含有28 bp的Ploy+(A)。该基因在GenBank基因数据库的注册号为FJ809943。氨基酸推导结果表明该cDNA共编码了511个氨基酸,具备完全保守的核定位信号序列(KKSR)以及2个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT-PCR和SYBR Green I实时定量RT-PCR初步分析了Vv-AP2在葡萄叶、茎、花序、花等不同器官中的表达水平。其中,Vv-AP2在花序和花中的表达量明显高于叶和茎。     

无核白及红地球葡萄VvMADS46基因的克隆及其无核调控功能分析

【目的】探究VvMADS46与葡萄无核性状产生的关系。【方法】采用实时荧光定量PCR分析VvMADS46在葡萄不同组织器官的表达,分析克隆VvMADS46基因序列,构建系统发育树,进行VvMADS46基因的亚细胞定位分析及过量表达番茄性状观察,研究其功能。【结果】VvMADS46在无核白和红地球的根、茎、叶、花序、花、卷须、果实等不同组织中均有表达,在花中的表达量较高,在果实中的表达量次之,而在茎、叶和卷须中的表达量较低;花后33、36、39、42 d4个时期无核葡萄无核白、火焰无核VvMADS46的表达量都显著高于有核葡萄红地球、巨峰;构建了VvMADS46基因的亚细胞定位载体,通过农杆菌侵染洋葱,发现了VvMADS46定位在细胞核上;克隆了VvMADS46基因,在NCBI数据库进行序列比对,得到其同源基因为AP3基因,筛选得到AtAP3、AeAP3、CmAP3、LjAP3、LrAP3、PhAP3、AcAP3和PtAP3,并构建了系统发育树;构建了VvMADS46基因的植物过量表达载体,采用农杆菌介导法转化模式植物番茄,发现转基因番茄植株明显矮小且种子显著变小。【结论】VvMADS46与葡萄胚珠败育、无核性状发生存在密切联系。     

‘南通小方柿’乙醇脱氢酶基因DkADH1的克隆及表达分析

以‘南通小方柿’果实为材料,采用同源克隆的方法,获得了柿乙醇脱氢酶基因DkADH1,其全长为1 377 bp,开放阅读框为1 137个核苷酸,编码379个氨基酸,具有ADH基因典型的结构域和功能域,与番茄、苹果等双子叶植物亲缘性较近。以‘南通小方柿’不同组织为材料,采用qRT-PCR方法对DkADH1及单宁生物合成途径中的相关基因的表达进行分析,同时测定了不同时期果实的单宁含量,结果表明在果实发育过程中,可溶性单宁含量逐渐降低,而不溶性单宁含量不断升高;DkADH1基因在茎、叶、花、果实等器官中均有表达,在果皮中表达量最高。随着果实的成熟,DkADH1表达量总体呈上升趋势。柿果实中单宁合成途径中的相关基因DkF3′5′H和DkMYB4随着乙醇处理果实时间的延长表达量呈下降趋势,推测‘南通小方柿’DkADH1能够抑制单宁合成相关基因的表达,从而降低果实可溶性单宁含量。     

辣椒花器官发育MADS-box基因的克隆与表达分析

采用RACE技术从辣椒（Capsicum annuum L.）花药中获得了一个控制辣椒花器官发育的MADS-box基因,命名为PPI（GenBank登录号：GU812276）。该基因全长952 bp,编码215个氨基酸,具有典型的MADS结构域和K结构域,与番茄花器官发育MADS-box基因TPI高度同源,同源性达88%。系统进化树分析表明,PPI基因属于花器官发育B类基因。RT-PCR表达分析表明,该基因在辣椒花瓣中的表达高于在花药、萼片以及子房等花器官中的表达,在营养器官叶片中没有表达。     

草莓LFY 同源基因的克隆及其表达分析

 以草莓（Fragaria × ananassa）品种‘花姬’为试材,通过PCR和RACE的方法克隆出LFY同源基因的cDNA全长序列,命名为FaLFY（GenBank收录号JN788260）,通过定量PCR的方法检测了该基因在草莓植株各组织和花器官中的表达。结果表明FaLFY编码区长度为1 236 bp,编码412个氨基酸,与其他物种的氨基酸序列都有一定的同源性,其中与蔷薇科玫瑰的LEAFY-1同源性最高,达到88%。实时定量RT-PCR结果表明,在不同的组织、不同的花器官中FaLFY的表达量存在差异,其中在花芽中的表达量最高,在营养生长的组织中基本不表达,在成熟花器官中同样不表达,说明该基因在草莓的成花进程中发挥重要作用。     

植物开花整合子基因FT的研究进展

开花是高等植物从营养生长向生殖生长的转变过程,与之相关基因的表达和调控是实现这一转变的分子基础。FT是植物开花调控途径的重要整合因子和调控开花的关键基因之一。FT基因编码的蛋白质产物是可以长距离运转的成花激素,在花形成过程中起着关键的作用。该文对与高等植物花发育相关的基因,特别是FT基因及其同源基因的功能、进化以及在植物花发育转换过程中的功能等研究现状进行了综述。     

番荔枝开花调控转录因子基因AsLEAFY的克隆与表达分析

利用同源克隆和RACE-PCR获得番荔枝LEAFY基因的全长cDNA序列,命名为AsLEAFY,Gen Bank登录号为KP866145。序列分析表明,克隆获得的番荔枝AsLEAFY基因长为1 236 bp,编码411个氨基酸,该氨基酸序列含有5′-N端脯氨酸富集区和中央酸性区,具有LEAFY(FLO)家族的典型结构特征。同源分析表明,该氨基酸序列与多种木本植物LEAFY类蛋白的同源性较高。进化树分析表明AsLEAFY与木本植物的亲缘关系高于草本植物。实时定量PCR结果表明,AsLEAFY在番荔枝花发育的整个过程中都有表达,在初期的花芽中表达量最高,在不同组织器官中表达量存在差异,在枝条去叶后的腋芽中的表达量最高。推测该基因在番荔枝花器官形成初期发挥重要作用。     

麝香百合花发育基因LLGLO1在花蕾中的时空表达

 为了获得百合花发育相关的B功能基因LLGLO1在调控百合花发育过程中的重要信息,以麝香百合（Lilium longiflorum）未开放的花蕾为试材,以LLGLO1基因的特异片段为探针,应用RNA原位杂交技术,对LLGLO1基因在花发育各个阶段的时空表达动态进行了研究。结果表明,LLGLO1基因在外轮花被、内轮花被、雄蕊和心皮等4轮花器官中均有表达,但表达强度随不同的发育阶段而变化。长度2.0和3.0 cm的花蕾中LLGLO1基因的表达量明显高于0.5和1.0 cm的花蕾,说明随着花器官的发育成熟,该基因在各轮花器官中的表达量逐渐增加。     

低温胁迫下枇杷不同发育阶段的花果转录组比较分析

研究比较了枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)不同发育阶段花果的低温响应机制。以花蕾、完全开放的花和花后2周左右的幼果为试验材料,–3℃低温处理12 h,以未经低温处理样品为对照,测定生理生化指标并进行转录组测序分析。低温胁迫导致细胞膜破坏,超氧阴离子产生速率、丙二醛和脯氨酸含量、抗氧化酶活性明显升高。总体上抗低温能力为花蕾花幼果。转录组测序分析共获得6 987个差异表达基因(DEG),对这些基因进行通路注释分析,发现大量与低温胁迫相关的代谢途径,其中碳水化合物代谢中的糖酵解/糖异生、乙醛酸和二羧酸代谢及磷酸肌醇代谢途径,氨基酸代谢中的色氨酸代谢和酪氨酸代谢途径,酯类代谢中的甘油磷脂代谢、α–亚麻酸代谢和甘油酯代谢途径,次生代谢中的异喹啉生物碱生物合成途径以及能量代谢中的硫代谢途径在3个花果发育时期低温与对照的比较组中显著富集,说明这几个途径都是枇杷花果响应低温胁迫的重要代谢途径。"苯丙烷类生物合成"途径在前两个时期比较组中富集水平较高,氨基酸代谢相关途径在幼果比较组中富集更多。另外,从低温处理相关差异表达基因中筛选到了53个AP2-EREBP基因,14个WRKY基因和15个NAC基因,并对其中12个低温响应相关转录因子基因进行了qRT-PCR表达分析,进一步证实了转录组数据的准确性。     

基于EST库的枳APETALA2基因cDNA克隆及其表达分析

 根据物种间同源基因相对保守的特点，利用生物信息学方法以拟南芥APETALA2 cDNA序列作为模板，对柑橘EST数据库进行同源检索筛选，克隆了柑橘APETALA2基因的cDNA序列，并以枳[Poncirus trifoliata (L.) Raf.]花cDNA为模板，根据以上cDNA序列设计特异引物，利用RACE技术分别获得该基因的5'和3'末端，序列拼接后获得枳的APETALA2 cDNA全长。该cDNA全长为1 980 bp，命名为Pt-AP2。Pt-AP2核苷酸序列有一个1 539 bp完整的开放读码框(ORF)，5'末端起始密码子ATG其始于290 bp，3'末端非翻译区为152 bp，其中含有27 bp的Ploy⁺(A)。该基因已在GenBank基因数据库注册，注册号为EU883665。推导该cDNA编码512个氨基酸，与苹果、矮牵牛和拟南芥中相应序列同源性分别为59.1%，59.7%和63.8%。序列分析表明, Pt-AP2除了具备完全保守的核定位信号序列（KKSR）外，还具有两个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT-PCR和SYBR Green I实时定量RT-PCR方法分析Pt-AP2在枳叶、茎、根、花和果等不同器官中的表达水平，结果一致表明Pt-AP2在各个器官中的表达水平不同, 花中的表达量最高，果实中的表达量最低。     

VvmiR397a及其靶基因VvLACs在葡萄果实发育中的作用分析

以‘魏可’葡萄（Vitis vinifera‘Wink’）为试材,克隆了葡萄VvmiR397a前体基因（594 bp）,其可折叠成典型的茎环结构;同时鉴定了其成熟体序列（21 bp）,并为其预测到5条靶基因VvLAC4、VvLAC7、VvLAC11、VvLAC14和VvLAC17,它们属于木质素合成的关键酶漆酶家族（Laccase,LACs）。靶基因的domains、motif序列分析及三级结构预测显示,漆酶蛋白序列均具有3个相同的Cuoxidase结构域,其motif元件类型及排列顺序、三级结构均相似,表明漆酶结构较为保守。推测其功能比较保守,74个漆酶基因的进化分析显示葡萄漆酶基因与杨树漆酶基因亲缘关系近于拟南芥,葡萄漆酶基因在木本植物中的保守性高于草本植物。VvmiR397a及VvLAC4、VvLAC11、VvLAC14和VvLAC17的启动子均具有赤霉素响应顺式作用元件（TATC-box、GARE、P-box）,表明它们可能响应GA参与葡萄生长发育的调控。荧光定量PCR表达分析显示,VvmiR397a能被GA诱导显著上调,且在幼果、花和成熟叶中具有高的表达,其他组织中表达相对较低,尤其在幼果中表达量最高,硬核期表达量最低;而其靶基因VvLACs表现出相反的表达模式,在硬核期有最高表达,而该期是葡萄果核木质素合成量最大的时期,表明VvmiR397a可能通过负调控VvLACs参与葡萄果核发育的调控。利用RLM-RACE和PPM-RACE验证了VvmiR397a对VvLACs的裂解作用,且在幼果中裂解作用最强,而在硬核期果实中裂解作用最弱,与VvmiR397a的表达趋势相似。     

葡萄果实始熟前后ABA积累关键酶基因VvNCED1和VvBG1转录水平的研究

以始熟期花后7 ~ 11周的‘玫瑰香’葡萄果肉为试材,利用荧光定量PCR分析了VvNCED1和VvBG1基因在5个时期的表达量。结果表明,VvNCED1基因在花后7 ~ 8周表达量很高,随后快速降低至最低值;随着果实着色,表达量略有升高。VvBG1基因在果实始熟前表达量较低,随着果实始熟启动和果实着色,表达量基本呈持续升高的趋势。结合果实ABA含量在始熟期前后一直升高的结果分析,认为果实始熟前ABA积累归因于VvNCED1基因的高水平表达,始熟后ABA积累主要归因于VvBG１基因的高水平表达。     

葡萄LIM家族基因特征及表达模式分析

为了明确LIM家族基因在葡萄非生物胁迫下的表达特性，在生物信息分析的基础上，以‘黑比诺’葡萄（Vitis vinifera‘Pinot Noir’）试管苗为试验材料，利用qRT-PCR技术检测了不同逆境处理对葡萄LIM家族基因成员表达的影响。结果显示，葡萄LIM基因家族有14个成员，可分为4个亚族，各亚族编码蛋白氨基酸数量差异较大，但亚族内差异较小；分析葡萄基因和拟南芥基因间的选择压发现，二者存在钝化选择关系；多序列比对发现，该家族基因成员含有1或2个锌指结构的保守结构域；保守基序分析结果表明，所有基因均包含motif2；基因结构显示VvLIM含有4 ~ 15个外显子；14个基因中有11个编码蛋白存在互作关系。该家族基因存在大量的光诱导元件和水杨酸等逆境胁迫相关元件。基因芯片表达数据表明，高表达的基因主要存在生长旺盛的组织中。qRT-PCR分析发现，VvLIM1在100 mmol ? L-1 NaCl、10% PEG和50 mg ? L-1 SA胁迫下表达量与对照相比显著上调，且随处理时间的延长表达量显著增加。     

葡萄miR159及其靶基因VvGAMYB在花发育过程中的作用分析

以‘魏可’葡萄(Vitis vinifera L.‘Wink’)为试材,克隆得到一个葡萄赤霉素信号途径中的MYB转录因子基因Vv GAMYB。该基因开放阅读框(ORF)长1 680 bp,编码559个氨基酸,该蛋白序列含有GAMYB基因家族保守的R2R3 DNA结合域以及Box1、Box2、Box3保守域。洋葱表皮细胞的瞬时表达结果显示,VvGAMYB定位于细胞核中。VvGAMYB和其下游基因Vv LFY在葡萄花发育过程中的表达都呈现先上升后下降的趋势,而赤霉素处理促进了VvGAMYB和VvLFY的表达,从而使开花提前。VvGAMYB是miR159的靶基因,其作用受到miR159的调控。miR159和VvGAMYB的表达负相关,赤霉素处理下调miR159表达从而也降低了对VvGAMYB的裂解作用。由上述结果可以看出,VvGAMYB通过赤霉素开花途径参与葡萄的开花过程。在这一过程中,赤霉素抑制miR159裂解VvGAMYB的作用,从而上调VvLFY的基因表达,参与了调控葡萄开花过程。     

葡萄VvACO1的表达及在拟南芥和番茄中的遗传转化

采用RT-PCR方法从葡萄（Vitis vinifera）叶片中克隆到1个ACC氧化酶（ACC Oxidase,ACO）基因,命名为VvACO1。序列分析表明,VvACO1的开放阅读框长度为957 bp,编码318个氨基酸,具有亮氨酸拉链、Fe²⁺结合基序和抗坏血酸结合位点等ACO蛋白的典型结构域;与烟草和番茄的ACO蛋白的相似度分别为87%和84%。组织特异性及乙烯诱导表达结果表明,VvACO1在葡萄叶片、卷须、幼茎、果实、花序、须根以及腋芽等组织中差异表达,并受到乙烯利的诱导上调表达。过表达VvACO1的番茄开花期及果实成熟期提前,过表达VvACO1的拟南芥叶片光合效率和叶绿素a的荧光强度明显下降。     

不同酿酒葡萄品种白藜芦醇合酶基因的克隆和序列分析

以红葡萄品种“赤霞珠”、“品丽珠”、“黑比诺”和白葡萄品种“雷司令”为试材,采用改良CTAB法提取葡萄叶片组织中的DNA,并扩增得到4个酿酒葡萄品种的白藜芦醇合酶基因部分片段.结果表明:红葡萄品种“赤霞珠”、“品丽珠”、“黑比诺”的扩增产物均为1 419 bp,白葡萄品种“雷司令”扩增产物为1 417 bp.通过序列多重比较分析,所得到的4个白藜芦醇基因片段与Genbank中河岸葡萄(AF128861)的该基因序列同源性较高(90％以上),外显子区同源性高于内含子;红色葡萄姊妹品种之间、红色葡萄不同品种之间、红色葡萄与白色葡萄品种之间的序列同源性依次递减.     

葡萄白粉病菌应答基因VpSTART的克隆及表达分析

 在前期获得葡萄白粉病菌应答基因VpSTART的EST基础上,采用RACE和RT-PCR技术克隆该基因cDNA全长序列。VpSTART全长1 321 bp,3′端非编码区114 bp,包含一个1 206 bp开放阅读框,编码401个氨基酸。VpSTART蛋白分子量为45.3 kD,与欧亚种葡萄、玉米、拟南芥、蒺藜状苜蓿和蓖麻的蛋白同源性分别为99%、64%、58%、46%和25%。实时荧光定量PCR表明,VpSTART在‘商–24’葡萄花序、卷须和茎中表达量较高;感白粉病的‘湖南–1’葡萄叶片接种白粉病菌后VpSTART表达量与对照没有显著差异,而抗白粉病的‘商–24’葡萄接种12 h后VpSTART表达量增加,在24 ~ 96 h表现显著性差异;用SA、MeJA和Eth等不同信号分子分别处理‘湖南–1’和‘商–24’葡萄叶片1 ~ 48 h后,VpSTART基因的表达受SA负调控,受MeJA和Eth正调控。     

干旱对葡萄果实发育过程中黄烷醇类多酚积累及LAR 表达的影响

 以酿酒葡萄‘赤霞珠’（Vitis vinifera L.‘Cabernet Sauvignon’）为试材,采用避雨棚和断根沟措施,模拟土壤干旱,探讨了葡萄果实发育过程中干旱对果实中黄烷醇类多酚积累及其合成关键酶隐色花色素还原酶（leucoanthocyanidin reductase,LAR）基因表达的影响。结果表明：土壤干旱导致葡萄单粒质量降低,纵、横径减小,促进黄烷醇类多酚积累,特别是在幼果期,土壤干旱明显促进黄烷醇类多酚的积累。Real-time PCR、Western blot结果证实,土壤干旱促进VvLAR1和VvLAR2转录,诱导果实中LAR1、LAR2新蛋白合成,进而导致LAR酶活性增强,黄烷醇类多酚积累。     

葡萄果实采后衰老及其相关基因表达的分析

对8 个葡萄品种果实采后衰老情况以及相关基因的表达进行了分析,发现欧美杂交种葡萄‘藤稔’、‘夕阳红’和‘信侬乐’VvNCED1、VvACO1、VvPG 基因表达水平高,葡萄果实耐压力、耐拉力下降明显,落粒数增加,其耐贮性较低;欧亚杂交种葡萄‘红地球’、‘黄意大利’和‘美人指’VvPOD2、VvMnSOD 基因表达水平高,果实的耐压力、耐拉力相对下降较慢,落粒数较低,其耐贮性也较高。表明葡萄贮藏过程中衰老相关基因的表达量能够反映出葡萄的耐贮性好坏。     

外源6-BA对‘美乐’葡萄花色苷合成的影响

【目的】探究6-BA对葡萄花色苷合成的影响。【方法】以酿酒葡萄’美乐’为试材,喷施不同浓度的6-BA,以喷施清水为对照,研究6-BA对花色苷含量、组分及其生物合成途径相关基因表达的影响。【结果】100和200 mg·L^-16-BA处理提高了果实着色百分率和内源激素ABA的含量,其中200 mg·L^-1处理促进了花青素的积累,其含量是对照组的4.82倍,相关性分析表明200 mg·L^-1处理组的蔗糖与花色苷含量呈显著正相关。100和200 mg·L^-16-BA处理组的葡萄果实CHS1、F3’H、F3’5’H和UFGT基因的表达量在花后90 d显著提高,6-BA处理组通过影响F3’H和F3’5’H基因的表达量来影响不同花色苷的含量,从而影响果皮色泽。【结论】在果实着色后期,低质量浓度的6-BA通过提高内源激素ABA、可溶性总糖的含量以及相关基因的表达量,促进了花色苷的积累,其中200 mg·L^-16-BA处理效果更佳。