ABC-ELISA法检测犊弓首蛔虫IgG抗体实验研究

首次以动物为模型,应用 ABC-ELISA 法对家兔血清中犊弓首蛔虫 IgG 抗体进行了测试研究。实验中对犊弓首蛔虫的成虫体壁抗原、体腔液抗原、生殖器官抗原、虫卵抗原、幼虫抗原进行了比较研究,结果显示:幼虫抗原对血清检测的 P/N 值及对被检血清的检出率最高,而检测对照组血清未出现假阳性反应.由此表明,幼虫抗原是最敏感和特异的抗原.在检测方法上,ABC-ELISA 法对被检血清的检出率为96.62%。常规 ELISA 法和 IHA 法的检出率分别为90%和56.67%。3种方法检测对照组血清未出现假阳性反应;在抗体检测滴度上,ABC-ELISA 法比常规 ELISA 法高1～4倍,比 IHA 法高4～128倍.经统计处理,ABC-ELISA 法比常规 ELISA 法敏感1.21倍,比 IHA 法敏感33.76倍.在特异性实验中,用 ABC-ELISA 法检测家兔血清中犊弓首蛔虫 IgG 抗体,与实验家兔乳突类圆线虫和肝片吸虫阳性血清均未出现交叉反应,表明该法检测犊弓首蛔虫抗体特异性良好.另外,对4份血清多次重复检测结果,批内重复和批间试验 OD 值变异系数不超过10%,表明该法稳定性良好.实验结果表明,ABC-ELISA 法具有敏感性高,特异性强,并有较好的稳定性,可用于犊弓首蛔虫抗体的检测,故该法的建立无疑具有理论和实践意义.     

大片吸虫分泌排泄抗原的分析

取广西牛源大片吸虫成虫制备出分泌排泄（ＥＳ）抗原，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，考马斯亮蓝染色显出７条蛋白带。免疫印迹试验（ＥＩＴＢ）测出其主要特异性免疫成分分子量为３６．３，２８．５及２５．５ｋＤａ，其中２８．５与２５．５ｋＤａ与法国肝片吸虫ＥＳ的部分抗原成分相同。两种片形吸虫与抗血清可以交叉使用无特异性，但与日本血吸虫抗原及抗血清均无交叉反应，人工感染大片吸虫２周后的兔血清即能识别此抗原。ＥＳ抗原提取方法简便，特异性好，敏感性高，可用于片形吸虫病免疫诊断。     

捻转血矛线虫保护性抗原H11 cDNA克隆及特性分析

H11是寄生阶段捻转血矛线虫小肠微绒毛上皮细胞的一种跨膜糖蛋白，分子量为110kD。H11具有良好的免疫保护作用，免疫动物后，攻击第3期幼虫，雄虫减少70％、雌虫减少80％和虫卵减少90％。本实验克隆了该抗原基因，并对该抗原特性进行了分析，为研制分子疫苗奠定基础。     

体外免疫法制备单克隆抗体的研究

本研究进行了三次体外免疫制备单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的试验，三次融合率分别为：８５．５９％（４９３／５７６），８４．５５％（４８７／５７６）和８５．０７％（４９０／５７６），而体内免疫法为８７．３３％（５０３／５７６）。在三次试验中，有两次产生抗体，经克隆后，与５５匹含有靶抗原的马红细胞反应中，各次试验获得的各株ＭｃＡｂ的最低反应率分别为８５．４５％（４７／５５），８０．００％（４４／５５），而体内免疫法为８３．６０％（４６／５５）。上述结果表明：小鼠脾细胞在体外培养４ｄ后，并不影响其与ＳＰ２／０（小鼠骨髓瘤细胞）的融合，而且在体外可接受抗原的刺激引起免疫应答，并产生抗体，其特异性与体内免疫法相似。     

鸡传染性喉气管炎的研究 Ⅰ．应用间接ELISA法检测鸡传染性喉气管炎病毒抗体

采用原代鸡胚肾（ＣＥＫ）细胞增殖鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ），并用ＰＥＧ－２００００粗提病毒蛋白抗原，建立了用来检测抗ＩＬＴＶ抗体的间接酶联免疫吸附试验。应用该法检测从广西９个大、中型鸡场采集的２３９份未免疫鸡血清样品，结果血清样品阳性率为４５．１９％，各个鸡场均为阳性场（１００％），首次证实广西存在ＴＬＴＶ抗体阳性鸡群．     

小反刍兽疫病毒重组抗原间接ELISA检测及初步应用

为了建立一种快速、特异、敏感的小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）血清学检测方法,本研究将PPRV血凝蛋白（H）和核蛋白（N）克隆至pET28a（＋）载体进行诱导表达,并将2种蛋白Ni柱纯化后包被ELISA反应板,建立起检测PPRV特异性抗体的间接ELISA法。结果表明在E.coli BL21（DE3）中表达出2种PPRV蛋白,将2种重组蛋白纯化后按照1：1比例混合,制备PPRV鸡尾酒抗原,成功建立了特异性强、敏感性高的PPRV间接ELISA法;最后用建立的方法对新疆伊犁、塔城、阿勒泰和喀什边境地区采集的325份山羊、789份绵羊和132份牛血清进行了抗体检测,检测结果显示均为阴性,提示在我国新疆边境地区反刍动物尚未发生PPRV感染,但需要及时进行免疫接种以建立预防PPRV从国外传入的免疫带。本研究建立的PPRV间接ELISA法为该病毒的检测提供基础,也为该病的科学防控提供参考。     

细粒棘球蚴生发层细胞系可溶性抗原的免疫学及SDS-PAGE分析

本研究报道了细粒棘球蚴生发展细胞可溶性抗原的免疫学研究结果及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果，将原头节可溶性抗原，生发展可溶性抗原，囊液抗原免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠制备抗血清并用原头节人工感染Ｂａｌｂ／ｃ小鼠制备阳性鼠血清，再用生发展细胞系可溶性抗原以间接ＥＬＩＳＡ法进行检测以观察该抗原的反应原性；用ｐＡｇ，ｇＡｇ，ＳＨＦ以及生发展分泌抗在分别对曾反种过细胞系细胞的Ｂａｌｂ／ｃ小鼠的血清进行检测，以了解细胞系抗原     

斑点免疫金银染色技术检测鸡传染性法氏囊病毒的研究

本研究成功建立了检测鸡传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）抗原的斑点—免疫金银染色技术（Ｄｏｔ－ＩＧＳＳ），并确定了操作流程的最佳试验条件。应用该法对纯化ＩＢＤＶ抗原的最低检出量为０．１９５３ｎｇ／点，其敏感性为Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ的８倍。特异性阻断试验和交叉反应试验证明Ｄｏｔ－ＩＧＳＳ具有较高的特异性。Ｄｏｔ－ＩＧＳＳ和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ对５４份自然感染法氏囊样品检测的阳性率为９６．３％和９２．５％（χ２＝３．１１７９，Ｐ＞０．０５），统计学分析两者无显著差异。研究表明本法具有敏感、特异性强、经济、安全等优点，可用于ＩＢＤＶ感染的特异诊断。本研究为免疫金技术应用于畜禽传染病的诊断和研究打下了基础     

草莓果实特异表达基因annfaf 在E. coli 中的表达及抗血清的制备

摘要：将草莓?穴Fragaria ananassa Duch. ?雪果实中特异表达的膜联蛋白基因annfaf的cDNA连接重组到pET-30a质粒中，构建了融合和非融合蛋白表达载体。annfaf 基因转化大肠杆菌(E. coli )后以包含体形式得到了高效表达，同时研究了annfaf基因表达的影响因素。实验结果表明, 最佳培养温度是37 ℃ ，培养时间为4 h，当培养液中加入利福霉素时可明显提高表达量中目的蛋白的含量。SDS-PAGE检测表明该蛋白分子量为35 kD，与目的蛋白相同。以表达的蛋白作抗原免疫家兔，制备了抗Annfaf蛋白的抗血清。ELISA检测及Western印迹表明，制备的抗血清可与其免疫抗原发生特异的免疫学反应，且具有较高的效价。该实验结果为进一步研究Annfaf蛋白在草莓果实细胞中的定位及其生理功能奠定了基础。     

草莓果实特异表达基因annfaf在E.coli中的表达及抗血清的制备

将草莓(Fragaria ananassa Duch．)果实中特异表达的膜联蛋白基因annfaf的cDNA连接重组到pET-30a质粒中，构建了融合和非融合蛋白表达载体。annfaf基因转化大肠杆菌(E.coli)后以包含体形式得到了高效表达，同时研究了annfaf基因表达的影响因素。实验结果表明，最佳培养温度是37℃，培养时间为4h，当培养液中加入利福霉素时可明显提高表达量中目的蛋白的含量。SDS—PAGE检测表明该蛋白分子量为35kD，与目的蛋白相同。以表达的蛋白作抗原免疫家兔，制备了抗Annfaf蛋白的抗血清。ELISA检测及Western印迹表明，制备的抗血清可与其免疫抗原发生特异的免疫学反应，且具有较高的效价。该实验结果为进一步研究Annfaf蛋白在草莓果实细胞中的定位及其生理功能奠定了基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的可溶性表达与生物活性分析

通过设计特异性引物扩增得到完整的口蹄疫病毒（FMDV）非结构蛋白（NSP）3AB基因,定向克隆到表达载体pET-30a中,获得了重组质粒pET-3AB,并转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),重组菌分别在37℃和28℃条件下诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定,观察到37℃培养条件下目的蛋白形成包涵体,在28℃条件下培养目的蛋白以可溶性的形式表达。Western blotting分析表明,表达的目的蛋白能与FMDV感染牛血清发生特异性反应。以纯化的3AB蛋白作为抗原,采用间接ELISA模式检测了部分FMDV感染动物血清和健康动物血清,证明表达蛋白与FMDV感染血清有很好的反应而与健康动物血清无反应。该项研究为建立以3AB为抗原的FMDV NSP抗体检测ELISA方法奠定了基础。     

Performance and applications of polyclonal antipeptide antibodies specific for the enterococcal bacteriocin enterocin P

Polyclonal antibodies with specificity for enterocin P (EntP) have been generated by immunization of rabbits with two chemically synthesized N-terminal peptides (P1 and P2) and a C-terminal peptide (P3) of this bacteriocin conjugated to the carrier protein KLH. The sensitivity and specificity of the peptide-KLH-generated antibodies were evaluated by a noncompetitive indirect enzyme-linked immunosorbent assay (NCI-ELISA) and a competitive indirect (CI)-ELISA. The NCI-ELISA but not the CI-ELISA was valuable for detecting the existence of EntP specific antibodies in the sera of the P2-KLH and P3-KLH immunized animals and to detect and quantify the EntP in the supernatant of producer strains. The anti-P2-KLH sera cross-reacted with the supernatant of a strain producer of sakacin A, a bacteriocin closely related to EntP. Immunoaffinity chromatography columns with anti-P2-KLH or anti-P3-KLH immunoglobulins retained the EntP from the supernatant of the producer strain. Western blotting of EntP with the anti-P2-KLH-generated antibodies suggests that purified EntP tends to the formation of aggregates with no antimicrobial activity. Monitoring the purification of EntP with antipeptide antibodies suggests that while the performance of the evaluated purification procedures would be reasonably acceptable in terms of recovery of the antimicrobial activity of the bacteriocin, their yield is far from attractive in terms of recovery of the initial concentration of enterocin P.     

抗鸡贫血病毒结构蛋白单克隆抗体制备及其对应抗原表位分析

以纯化的原核表达的鸡贫血病毒结构蛋白为抗原，免疫6-8w的雌性Balb/c鼠, 经过三次免疫后，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，以纯化的蛋白为抗原进行ELISA检测，将阳性细胞孔经过三次有限稀释，共获得6株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株。间接免疫荧光试验证实6株单抗可以与鸡贫血病毒感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应，Western blot结果显示单抗与杆状病毒表达的VP1重组蛋白可以发生特异性反应。利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行亚型鉴定，结果表明6株单抗均为IgG1亚型，且所有单抗的轻链均为κ链。用单克隆抗体对分段表达的VP1蛋白进行免疫印迹分析，初步鉴定了筛选出的单抗所对应的抗原表位，其中有四株单抗识别的表位位于VP1 218-274位氨基酸之间，另外两株单抗识别的表位分别位于275-301位、324-369位氨基酸之间。     

Immunological characterization of recombinant soy protein allergen produced by Escherichia coli expression system

To elucidate the molecular mechanism of the allergenicity of soybean P34 protein recognized as the most allergenic protein in soybean, the protein was expressed in Escherichia coli transformed with a plasmid carrying P34 cDNA. SDS-PAGE pattern showed that the molecular weight of the recombinant P34 was approximately 2 kDa less than that of the native soybean P34. The difference in the molecular mass between these two proteins could be due to the native P34 in soybean being glycosylated at position Asn(170), whereas the recombinant protein generated in E. coli lacks this post-translational modification. Immunoblot analysis showed that both soybean and recombinant P34 proteins cross-reacted not only with polyclonal and monoclonal antibodies produced against P34 and crude soybean protein but also with patients' sera. The results suggest that the recombinant P34 is immunologically reactive, indicating that both proteins have similar epitope structures. Thus, the recombinant P34 produced by the E. coli expression system can be used as a standard allergen for molecular design to reduce the allergenic structure.     

食品辐照标志物DiHT的人工抗原合成及鉴定

以二氢脱氧胸腺嘧啶(DiHT)为初始反应物,应用琥珀酸酐法合成二氢脱氧胸腺嘧啶的衍生物,即半抗原DiHT-COOH,经薄层色谱(TLC)和核磁共振波谱(NMR)对其进行鉴定;采用混合酸酐法与活化酯法分别将半抗原与载体蛋白BSA、OVA进行偶联,制备二氢脱氧胸腺嘧啶的人工抗原和包被原,通过紫外扫描、SDS-PAGE凝胶电泳方法对其进行鉴定,偶联比分别为9.8∶1和12∶1。人工抗原偶联成功后免疫BALB/c小鼠制备多抗血清,间接非竞争ELISA方法检测效价达1∶2.56×104,表明人工抗原合成成功。     

A Recombinant ω-Gliadin-like D-Type Glutenin and an α-Gliadin from Wheat (Triticum aestivum): Two Immunoglobulin E Binding Proteins, Useful for the Diagnosis of Wheat-Dependent Allergies

Among the wheat prolamins, D-type glutenins display a highly repetitive sequence similar to ω-gliadins, but they contain a cysteine, that allows them to be included in the gluten macropolymers. An ω-gliadin-like D-type glutenin, an α-gliadin, and an ω5-gliadin-like D-type glutenin were obtained as recombinant proteins and compared using synchrotron radiation circular dichroism. This technique evidenced the strong thermostability of the ω5-gliadin-like protein. The IgE reactivity of recombinant proteins was evaluated using 45 sera from wheat-allergic patients. The sera from patients diagnosed with cutaneous hypersensitivity to hydrolyzed wheat proteins often reacted with the ω-gliadin-like D-type glutenin and α-gliadin, whereas the IgE reaction was less frequent after dietary sensitization. So, these two proteins could be useful to diagnose these diseases. The sera from patients with exercise-induced anaphylaxis recognized the ω5-gliadin-like protein as a positive control and, less frequently, the other proteins tested. Only some sera from patients with baker's asthma reacted with the proteins tested.     

利用菊花B病毒外壳蛋白特异片段进行多克隆抗体的制备与分析

菊花B病毒(CVB)是乙型线状病毒科(Betaflexiviridae)麝香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)成员,在浙江杭白菊基地普遍存在。为了能够特异、快速、简便检测CVB,利用SWISS-MODEL分析CVB外壳蛋白(CP)的三维结构,选择暴露在CVB CP三维空间结构外部的片段,片段之间使用连接肽串联以提高柔性,重复4个片段,根据大肠杆菌密码子的偏爱性将其相应的DNA序列进行优化,将合成的特异DNA序列连接表达载体pET-28a(+),转化至Escherichia coli BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导和Ni-NTA重力柱层析获得了纯化后大小约为14 kDa的融合蛋白;将其作为抗原免疫家兔制备抗血清,纯化获得相应抗体;对获得的抗血清和抗体进行酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白免疫印迹(WB)检测。间接ELISA检测结果表明,512 000倍稀释的抗血清可检测到1 μg抗原。纯化后最终得到浓度为15 mg·mL^-1 的抗体,WB检测结果,1∶1 000稀释后的抗体可检测500 pg抗原,且能够特异性结合CVB CP蛋白。本研究制备的多克隆抗体为检测CVB提供了便利,也为后续CVB检测试纸条的开发提供了技术支撑。     

麻鸭白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆、表达及生物学活性

根据GenBank发表的鸭IL-18 cDNA基因序列，设计、合成一对引物，直接从成年麻鸭脾淋巴细胞提取总RNA，经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增麻鸭IL-18成熟蛋白基因，扩增产物进行了T-A克隆、测序，获得了麻鸭IL-18成熟蛋白基因全序列，其大小为513 bp，编码一条由170个氨基酸残基组成的多肽。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pQE30，构建重组表达质粒pQE30-mDuIL18，转化大肠杆菌M15，并用IPTG 诱导。重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到相对分子质量为19.76 Ku的重组蛋白，Western blotting证实该重组蛋白可与兔抗鸡IL-18血清发生特异性反应。表达产物以包涵体形式存在，包涵体经变性、复性处理后进行鸭T淋巴细胞转化试验表明，重组蛋白具有明显促进鸭T细胞转化的生物学活性。用mDuIL-18（150 ng or 200 ng /鸭）和AIV 疫苗免疫鸭2周后，HI抗体平均滴度达到7.5–7.7 log 2 ，而只用AIV 疫苗免疫和用mDuIL-18（100 ng /鸭）和AIV 疫苗免疫的HI抗体平均滴度仅达到6.3–6.6 log 2，表明mDuIL-18提高AIV灭活油乳苗诱导的免疫应答。这为研究鸭IL-18结构和生物学应用，以及研制新型免疫佐剂和免疫调节剂奠定基础。