刚毛柽柳ThP5CR基因的克隆及抗逆功能分析

【目的】脯氨酸在植物对盐和干旱胁迫应答中起重要的渗透调节作用,增加植物体内脯氨酸含量可以提高植物抗逆性。吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)是合成脯氨酸的重要还原酶,本研究拟从抗旱耐盐植物刚毛柽柳中克隆获得1个ThP5CR基因,研究该基因的抗逆功能,为该基因用于林木基因工程育种奠定理论基础。【方法】以"Pyrroline 5 Carboxylate Reductase"作为关键词,对实验室前期构建的刚毛柽柳转录组序列进行比对查找获得ThP5CR基因c DNA序列,并通过RT-PCR和测序验证克隆获得的ThP5CR基因序列。利用生物信息学工具进行序列分析。利用Real time RT-PCR分析不同逆境处理下ThP5CR基因在刚毛柽柳根和叶中的表达情况。为了进一步分析ThP5CR基因的抗逆功能,构建了植物过表达载体pROKⅡ-ThP5CR,并进行刚毛柽柳瞬时转化,同时以pROKⅡ瞬时侵染刚毛柽柳作为对照。分析比较Na Cl和甘露醇胁迫后2种瞬时转化刚毛柽柳的脯氨酸、MDA、H2O2含量和二氨基联苯胺(DAB)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)及伊文思蓝(Evans blue)染色情况,以综合评定ThP5CR基因的抗逆功能。【结果】ThP5CR基因编码273个氨基酸,编码蛋白分子量为28.29 k Da,理论等电点为9.22。含有典型的NADP结构域和P5CR二聚体结构域。2种胁迫(Na Cl和PEG6000)和3种激素(ABA、GA3和JA)处理后,刚毛柽柳ThP5CR基因的表达都发生了不同程度的改变,且每种处理后至少有1个时间点发生了明显改变。此外,Na Cl胁迫、PEG6000胁迫和ABA激素处理对ThP5CR基因的表达产生的影响更为显著。对2种瞬时表达刚毛柽柳植株中ThP5CR基因的表达分析显示成功获得瞬时过表达转基因株系(标记为OX)。进一步的生理指标和生理染色结果显示,非胁迫条件下,过表达植株脯氨酸含量高于对照植株(标记为Con);150 mmol·L-1Na Cl和200 mmol·L-1甘露醇胁迫后,2种转基因株系脯氨酸含量差异则更显著;NBT、DAB染色和H2O2含量测定结果显示,OX植株的O-·2和H2O2含量明显低于对照;而Evans blue染色结果和MDA含量测定表明,与对照相比,过表达ThP5CR植株着色更浅、MDA含量更低。【结论】ThP5CR基因能对Na Cl、PEG胁迫和ABA等激素处理做出应答,可能参与了刚毛柽柳抗旱耐盐胁迫应答。在150 mmol·L-1Na Cl和200 mmol·L-1甘露醇胁迫下瞬时过表达ThP5CR植株可通过增加脯氨酸含量增强细胞内清除活性氧能力,使O-·2和H2O2的积累减少,从而减少细胞受损或细胞死亡,增强植物的抗逆性。本研究初步证实ThP5CR基因是一个逆境胁迫应答候选基因。     

瞬时过表达ThCBL4基因提高刚毛柽柳耐盐能力

[目的]本研究拟从刚毛柽柳(Tamarix hispida)中克隆获得1个ThCBL4基因,研究该基因的耐盐功能。[方法]以"Calcineurin B-like protein"作为关键词,对实验室前期构建的刚毛柽柳转录组序列进行比对查找获得ThCBL4基因c DNA序列,并通过RT-PCR和测序验证克隆获得的ThCBL4基因序列。利用生物信息学工具进行序列分析。利用Real time RT-PCR分析了0.4 mol·L-1NaCl、20%(w/v)PEG6000和100μmol·L-1ABA胁迫处理后ThCBL4基因在刚毛柽柳根和叶中的表达情况。为了进一步分析ThCBL4基因的耐盐功能,构建了植物过表达载体pROKⅡ-ThCBL4,抑制表达载体p FGC5941-ThCBL4,并进行柽柳瞬时转化,同时以pROKII瞬时侵染柽柳作为对照。分析比较NaCl胁迫后瞬时转化柽柳POD、SOD酶活性、MDA含量和DAB、NBT及Evans blue染色情况,以综合评定ThCBL4基因的耐盐功能。[结果]ThCBL4基因c DNA长度为1 432 bp,编码区长度675 bp,编码224个氨基酸,编码蛋白分子量为25.57 k Da,理论等电点为5.0。3种不同环境处理后,ThCBL4基因在刚毛柽柳根中均为上调表达,在刚毛柽柳叶中均为下调表达。对盐胁迫后瞬时表达柽柳ThCBL4基因的表达分析显示,成功获得瞬时过表达(标记为OE)、抑制表达(标记为RNAi)转基因株系。进一步的生理指标和生理染色结果显示,盐胁迫下过表达ThCBL4植株的保护酶类SOD与POD活性明显高于对照和抑制表达株系。NBT和DAB染色结果显示,过表达植株的O·-2和H_2O_2含量明显低于对照,抑制表达植株的O·-2和H_2O_2含量明显高于对照;而Evans blue染色和MDA含量测定结果显示,与对照相比,过表达ThCBL4植株着色更浅、MDA含量更低,而抑制表达ThCBL4植株着色更深、MDA含量更高。[结论]ThCBL4基因可能参与了刚毛柽柳的耐盐胁迫应答,瞬时过表达ThCBL4基因通过提高植株的保护酶活性,降低活性氧氧化程度和细胞损伤的程度,从而提高了转基因刚毛柽柳的耐盐能力。     

核桃转录因子JrDof3的克隆及渗透胁迫表达分析

【目的】Dof转录因子普遍存在于植物,含有特殊的C2-C2型单锌指结构(C2-C2-Dof domain),在调控植物生命过程中发挥着重要作用,参与激素应答、碳固定和氮同化与吸收、开花结实等过程。但目前有关Dof转录因子响应逆境胁迫的研究报道较少,旨在探讨核桃Dof转录因子响应逆境胁迫的表达情况,探讨其响应逆境的潜在能力,为核桃抗逆优良品种选育及产业科学管理筛选重要的候选基因,并提供理论基础。【方法】从‘香玲’核桃转录组中鉴定出1条Dof基因(命名:JrDof3),对JrDof3基因上游启动子包含的顺式作用元件进行分析,预测其潜在的逆境响应功能;对该基因进行BLASTP搜索获得同源蛋白,利用MEGA构建进化树;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对JrDof3基因在盐、干旱及ABA胁迫下的表达进行分析。【结果】JrDof3基因的完整开放读码框(ORF)长为873 bp,编码的多肽包含291个氨基酸,蛋白分子量为30.54 ku,理论等电点为9.36。系统发育分析发现JrDof3蛋白与来自壳斗科栎属的欧洲栓皮栎Quercus suber QsDof2.4蛋白具有较近的进化关系。其上游1 299 bp启动子包含逆境响应相关的DOF、MYB、MYC、WRKY等顺式作用元件和激素响应相关的ARFAT等元件。非生物胁迫下的表达分析发现JrDof3基因受NaCl、PEG6000及ABA诱导,且分别在处理24 h、3 d、48 h被诱导最为明显,分别为对照的6.56、7.82、6.08倍。【结论】JrDof3基因能积极响应渗透(盐和干旱)胁迫,并受上游启动子调控;且其逆境响应调控可能涉及ABA信号通路;JrDof3可作为核桃逆境响应调控的重要候选基因。     

巨桉非生物逆境响应基因EgrNAC1的基因结构和表达分析

【目的】NAC(NAM,ATAF和CUC2蛋白)是植物中一类特异转录因子,广泛参与植物生长、发育、激素信号转导和逆境响应过程。本文通过对巨桉EgrNAC1(Eucgr.I00058)编码蛋白结构、蛋白亚细胞定位特点,以及低温、干旱和高盐等非生物逆境条件下的基因表达分析,研究EgrNAC1基因与非生物逆境响应的关系,为其功能的深入研究提供基础。【方法】首先从巨桉基因组数据库下载EgrNAC1基因、启动子和编码蛋白序列,利用SMART、MatInspector和MEGA等软件对EgrNAC1蛋白结构特征、进化分类及启动子上的顺式作用元件进行分析;并以pCAMBIA1300为基础载体,用酶切法构建EgrNAC1∷sGFP载体,采用基因枪轰击洋葱表皮方法,对EgrNAC1蛋白表达的亚细胞定位特点进行研究。然后,以4℃不同时间处理的数字表达谱数据为基础,利用WGCNA软件进行基因共表达分析,了解低温下与EgrNAC1高度相关的共表达基因特征。为进一步了解EgrNAC1在不同非生物逆境处理下的表达特征,同样利用3个月巨桉无性系幼苗进行不同低温(-8,-4,0,4,8℃)、4℃不同时间(2,6,12,24,48 h)、高温(42℃)、高盐、干旱、脱落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的不同处理,用实时荧光定量RT-PCR方法对这些处理下EgrNAC1的表达情况进行分析。【结果】EgrNAC1中NAC结构域包含A,B,C,D,E 5个典型亚结构域,其中含2个α螺旋5个β折叠片结构,有核定位序列,无跨膜域。进化树构建结果表明,EgrNAC1属于NAC家族的Ⅰ类亚家族ATAF子组,逆境类NAC分类中属于SNAC-A亚类。EgrNAC1启动子序列上含有ABRE、MBS、MCS和DREB等大量与逆境胁迫相关的顺式作用元件。亚细胞定位结果表明EgrNAC1在核中表达。4℃不同处理时间(0,2,6,12,24,48 h)下与EgrNAC1共表达相关系数最高的20个基因中,大多数基因参与逆境胁迫响应相关的调控过程。不同时间处理下,叶片中EgrNAC1诱导水平随处理时间延长不断提高;不同低温下,4℃和8℃处理中EgrNAC1的诱导水平相对较高;干旱处理1天后基因表达即受到诱导,然后又有所下降;盐(200 mmol·L~(-1)NaCl)胁迫48 h,才能诱导EgrNAC1表达;100μmol·L~(-1)ABA和100μmol·L~(-1)MeJA均能诱导叶片中EgrNAC1基因表达,MeJA诱导速度更快,处理2 h后基因表达即明显提高,而ABA的诱导效应则需要24 h。【结论】EgrNAC1是参与巨桉逆境胁迫响应的1个NAC类转录因子基因,其不仅参与低温、干旱和高盐的非生物逆境胁迫响应,还可能与ABA、MeJA信号转导有交叉互作效应。     

干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片SSH文库构建及CkWRKY1基因克隆

为研究柠条锦鸡儿抗旱的分子机制,挖掘干旱响应相关基因,成功构建干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片的抑制性差减杂交(SSH)文库,获得1 286条高质量的EST序列,平均长度475 bp,拼接得到Unigenes 645条.对这些Unigenes进行Blast比对注释后发现很多抗旱相关基因,例如LEA蛋白、DHN蛋白编码基因,MYB、bZIP、WRKY、NAC和bHLH转录因子等.通过RACE技术克隆其中1个WRKY转录因子的cDNA全长,命名为CkWRKYI,GenBank登录号为JX987095.CkWRKY1编码330个氨基酸的蛋白质,氨基酸序列中有1个“WRKYGQK”的WRKY转录因子家族保守序列,属于第Ⅱ类WRKY转录因子.利用实时荧光定量PCR技术检测发现,CkWRKY1基因在干旱处理后mRNA的表达水平明显上升,预示该转录因子可能与柠条锦鸡儿抗旱的分子机制相关.     

刚毛柽柳 TheIF1A 基因的互作蛋白及其表达模式分析

翻译起始因子是一类翻译起始所必需的特异蛋白因子,前期研究表明柽柳翻译起始因子 (TheIF1A) 基因能对外界盐和干旱等非生物胁迫做出响应,且过表达 TheIF1A基因能提高酵母和烟草的抗旱耐盐能力。为进一步研究TheIF1A基因的抗逆机制,本研究通过酵母双杂交对柽柳翻译起始因子(TheIF1A) 基因的互作蛋白进行了筛选,共获得5个互作蛋白,分别为RNA聚合酶β II亚基 (RNA polymerase beta II subunit)、ATP合成酶CF1α亚基蛋白 (ATP synthase CF1 alpha subunit protein)、细胞色素b6/f 复合物亚基IV(cytochrome b6/f complex subunit IV)、核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基蛋白(ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit)和组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase)。利用实时荧光定量PCR对这5个蛋白基因及 TheIF1A 基因在盐和干旱胁迫处理下的表达模式进行分析,结果表明:这些蛋白基因在盐和干旱胁迫下的表达模式与 TheIF1A基因基本一致,表明TheIF1A可能通过与这些蛋白相互作用来参与逆境胁迫应答。为进一步研究TheIF1A 基因的抗逆机理奠定了基础,有利于完善林木抗逆机制的研究,并为通过基因工程手段提高林木抗逆性提供了候选基因。     

青杄转录因子基因PwNF-YB8的克隆与功能分析

【目的】NUCLEAR FACTOR Y(NF-Y)转录因子在真核生物中广泛存在,通常由NF-YA、NF-YB和NFYC 3个亚基形成异源三聚体,来结合下游靶基因启动子中的CCAAT顺式作用元件,进而调控植物的生长发育进程,并参与植物非生物逆境胁迫过程。本研究对青杄中PwNF-YB8基因的表达特性及功能进行分析,揭示其参与的生理过程及对非生物逆境胁迫的响应。【方法】根据实验室前期EST测序及RNA-seq转录组数据分析结果获得青杄NF-Ys家族基因序列,克隆得到PwNF-YB8的cDNA序列,并对其编码蛋白进行序列特征和进化树分析。采用qRT-PCR分析PwNF-YB8在不同组织和花粉萌发过程中的表达特性,以及高温、盐胁迫、甘露醇、ABA处理后的表达变化。亚细胞定位揭示PwNF-YB8在细胞中发挥功能的场所。通过酵母双杂交试验、双分子荧光互补试验分别检测PwNF-YB8的转录激活活性以及与PwHAP5的互作情况。农杆菌介导花序侵染法转化野生型拟南芥(WT),获得纯合的PwNF-YB8过表达株系。利用CRISPR/Cas 9技术获得其同源基因AtNF-YB8的突变体。甘露醇和盐处理后测定野生型(WT)、空载体(VC)、突变体株系(nfyb8-cas9#1/12)和过表达株系(L4、L5)的萌发率、幼苗根长,分析比较不同株系对于渗透胁迫和盐胁迫的耐受能力。【结果】PwNF-YB8基因的开放阅读框为489 bp,编码162个氨基酸,具有典型的NF-YB保守结构域,并且与白云杉同源基因具有较近的亲缘关系。SqRT-PCR和qRT-PCR结果表明在青杄的根、茎、针叶和花粉中均能检测到PwNF-YB8的表达,其在花粉中的表达量最高。亚细胞定位试验结果显示,PwNF-YB8定位于细胞核、细胞质中。酵母自激活试验显示PwNF-YB8自身无转录激活活性。进一步对青杄幼苗进行高温(42℃)、盐胁迫、甘露醇和脱落酸处理后发现,PwNF-YB8对干旱和盐2种非生物逆境处理明显响应。PwNF-YB8参与了花粉萌发过程,在花粉萌发36 h时表达量最高。酵母双杂交和双分子荧光互补试验证明PwNF-YB8能够与NF-YC亚基中的PwHAP5互作,可能共同参与花粉管发育调控。甘露醇或盐处理下,异源过表达PwNF-YB8基因的拟南芥种子萌发率与野生型差异不显著,但其根长表现出一定的生长优势。【结论】青杄PwNF-YB8能够与PwHAP5互作,参与花粉萌发和花粉管生长过程,并在干旱、盐胁迫响应中发挥作用。     

白桦HSFA4转录因子的克隆及耐盐功能分析

【目的】热激转录因子(HSF)在植物对非生物胁迫应答中起重要的调节作用。本研究拟从白桦中克隆获得HSFA4基因(命名为BpHSFA4),研究该基因的抗逆功能,为该基因用于林木基因工程育种奠定理论基础。【方法】在白桦转录组中筛选获得1条HSFA4基因,通过RT-PCR克隆获得BpHSFA4基因序列。利用生物信息学工具进行序列分析。利用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析不同逆境胁迫下BpHSFA4基因在白桦叶、茎和根中的表达模式。构建植物过表达载体pROKⅡ-BpHSFA4和抑制表达载体pFGC5941-BpHSFA4,进行白桦瞬时转化,同时以pROKⅡ瞬时侵染白桦作为对照。分析NaCl胁迫下不同瞬时转化白桦株系的MDA、H_2O_2、SOD、POD、相对电导率及二氨基联苯胺(DAB)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)及伊文思蓝(Evans blue)染色情况,以综合评定BpHSFA4基因的耐盐功能。【结果】BpHSFA4基因cDNA全长为1 170 bp,编码389个氨基酸,编码蛋白的相对分子量为44.15 kDa,理论等电点为5.14,具有典型HSF结构域。非生物胁迫(NaCl、PEG_(6000)、镉、高温和低温)条件下和激素(ABA、GA_3和JA)处理下,BpHSFA4基因的表达均发生了不同程度的改变,且每种处理后至少有1个时间点发生了明显上调或者下调,其中盐胁迫下表达变化尤为明显。3种瞬时表达白桦株系中的BpHSFA4基因的表达分析结果显示成功获得了瞬时过表达转基因株系(OE)和抑制表达转基因株系(SE)。进一步对不同转基因白桦株系的生理指标和生理染色进行分析,结果显示:Na Cl胁迫条件下,过表达BpHSFA4植株H_2O_2含量、MDA含量和相对电导率明显低于对照植株,抑制表达BpHSFA4植株的H_2O_2含量、MDA含量和相对电导率则明显高于对照植株;过表达BpHSFA4植株的SOD活性和POD活性明显高于对照植株,而抑制表达BpHSFA4植株的SOD活性和POD活性明显低于对照株系;NBT、DAB染色结果与H_2O_2含量测定结果一致,显示OE植株的着色明显比对照植株浅,而抑制表达株系着色明显比对照植株深,Evans blue染色结果和MDA含量测定结果一致。【结论】BpHSFA4基因能对非生物胁迫(NaCl、PEG_(6000)、镉、高温和低温)和激素(ABA、GA_3和JA)处理做出应答,特别是盐胁迫条件下,应答强烈,该基因可能参与白桦耐盐胁迫应答。在盐胁迫条件下,瞬时过表达BpHSFA4基因株系能通过提高SOD和POD等保护酶的活性从而增强活性氧清除能力、降低膜脂氧化程度,减少细胞受损或细胞死亡,进而提高白桦的耐盐能力。本研究初步证实BpHSFA4基因是一个耐盐胁迫应答候选基因。     

转桑树MAPK5基因拟南芥在不同逆境胁迫下的抗性分析

【目的】植物促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)在响应生物与非生物胁迫中发挥重要作用。本研究通过分析桑树(川桑)B家族MAPK基因MnMAPK5的亚细胞定位和启动子活性,并将其转入拟南芥中进行过表达研究,探讨MnMAPK5在逆境胁迫下的作用机制。【方法】将MnMAPK5的上游启动子连接到p BI121载体上,通过花粉介导法转入拟南芥中,经高温、低温、NaCl和PEG处理后进行GUS染色分析。通过构建过表达载体,将MnMAPK5转化到拟南芥中,用T3转基因植株进行抗逆境胁迫分析。【结果】MnMAPK5基因的编码蛋白定位于细胞质和细胞核中。在拟南芥中检测MnMAPK5启动子驱动的GUS活性的结果显示,MnMAPK5启动子活性受到了高温、低温、高盐和干旱胁迫的诱导。在高盐、干旱、低温和H_2O_2处理条件下,过表达MnMAPK5抑制了转基因拟南芥的萌发和生长。在盐胁迫下,过表达MnMAPK5提高了转基因植株中的MDA含量和POD活性,降低了CAT活性、可溶性糖含量和H_2O_2含量;在干旱胁迫下,过表达MnMAPK5提高了转基因拟南芥中的MDA和H_2O_2含量,降低了CAT和POD活性;在低温下,转基因拟南芥相比野生型植株表现出更低的CAT活性、POD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量;在氧化环境胁迫下,转基因拟南芥的MDA含量显著高于野生型拟南芥,而脯氨酸含量和可溶性糖含量要低。此外,在各个胁迫环境条件下,AtPOD、AtCAT和AtRD22等胁迫相关基因的表达量在转基因植株低于野生型拟南芥。【结论】MnMAPK5启动子在转基因拟南芥中的活性受到了不同非生物胁迫的诱导。过量表达MnMAPK5降低了拟南芥对非生物胁迫的抵抗能力,表明MnMAPK5在逆境胁迫下起着负调控作用。     

青杄转录因子PwERF8及其启动子序列的克隆与分析

【目的】AP2/ERF是植物的转录因子家族之一,广泛参与生物胁迫和非生物胁迫过程。从青杄中克隆ERF类转录因子PwERF8及其启动子序列,研究PwERF8基因的表达特性、启动子序列功能,并进一步分析其对非生物胁迫的响应模式,为深入了解青杄的耐逆调控机制提供理论基础。【方法】通过RACE-PCR技术获得青杄PwERF8编码区全长序列。通过染色体步移技术克隆PwERF8启动子序列。通过PlantCARE在线软件和BDGP在线软件预测启动子序列上的顺式作用元件、基础启动子和转录起始位点,构建pBI121-PwERF8 promoter∷GUS启动子表达载体,采用农杆菌注射法瞬时转化烟草叶片来验证启动子的功能。构建PGBKT7-PwERF8载体,转化AH109酵母菌株验证其转录激活活性。构建35S∷PwERF8-GFP融合表达载体,通过PEG介导瞬时转化拟南芥原生质体进行基因表达的亚细胞定位分析,应用RT-qPCR技术分析该基因的组织特异性和在非生物胁迫下的时空表达特征。【结果】PwERF8基因的编码区全长序列共1 191 bp,开放阅读框共765 bp,开放阅读框翻译成255个氨基酸。在肽链的N端具有1个保守的由58个氨基酸组成的AP2结构域,在C端含有1个EAR转录抑制基序(DLNLPP)。组织特异性表达分析表明,PwERF8在茎、根、针叶、花粉、种子中均有表达,但在花粉中,PwERF8的表达量最高,其次为种子,在茎中的表达量最少。酵母单杂交试验表明,PwERF8蛋白不具有转录激活活性。亚细胞定位分析发现PwERF8蛋白主要定位于细胞核。将启动子序列进行在线分析显示PwERF8含有GA、ABA、JA和SA等激素的顺式作用元件。进一步在烟草中瞬时过表达PwERF8启动子并用GUS染色显示,PwERF8启动子能响应GA、ABA、MeJA和SA等外源激素的处理。GA、ABA、MeJA和SA分别处理青杄幼苗3、6、12 h后,PwERF8的表达量均显著高于对照,干旱、4℃和42℃处理均能诱导PwERF8表达,但盐胁迫不能诱导其表达。【结论】青杄转录因子PwERF8参与了GA、ABA、JA和SA激素的信号通路,广泛响应干旱、温度逆境等非生物胁迫,且可能作为一个转录抑制子在细胞核中发挥功能。     

Overexpression of the ThTPS gene enhanced salt and osmotic stress tolerance in Tamarix hispida

Trehalose is a non-reducing disaccharide with high stability and strong water absorption properties that can improve the resistance of organisms to various abi-otic stresses.Trehalose-6-phosphate synthase (TPS) plays important roles in trehalose metabolism and signaling.In this study,the full-length cDNA of ThTPS was cloned from Tamarix hispida Willd.A phylogenetic tree includ-ing ThTPS and 11 AtTPS genes from Arabidopsis indicated that the ThTPS protein had a close evolutionary relationship with AtTPS7.However,the function of AtTPS7 has not been determined.To analyze the abiotic stress tolerance function of ThTPS,the expression of ThTPS in T.hispida under salt and drought stress and JA,ABA and GA3 hormone stimu-lation was monitored by qRT-PCR.The results show that ThTPS expression was clearly induced by all five of these treatments at one or more times,and salt stress caused par-ticularly strong induction of ThTPS in the roots of T.hispida.The ThTPS gene was transiently overexpressed in T.his-pida.Both physiological indexes and staining results showed that ThTPS gene overexpression increased salt and osmotic stress tolerance in T.hispida.Overall,the ThTPS gene can respond to abiotic stresses such as salt and drought,and its overexpression can significantly improve salt and osmotic tolerance.These findings establish a foundation to better understand the responses of TPS genes to abiotic stress in plants.     

蜡梅转录因子CpTAF10基因的克隆及功能分析

【目的】 TATA框结合蛋白相关因子TAF10作为基本转录因子之一,在生长发育和胁迫响应过程中发挥着广泛的、重要的生物学作用。对蜡梅中TAF10同源基因 CpTAF10的克隆与功能分析,有利于丰富对植物TAFs基因功能的认识,并为解析蜡梅抗逆形成的转录调节机理提供新的理论依据。【方法】以转录组数据库中获得的蜡梅TAFs家族基因序列,克隆得到 CpTAF10基因的cDNA序列,并对其编码蛋白进行序列特征和进化树分析。采用实时荧光定量PCR 技术分析 CpTAF10基因在蜡梅不同组织及花期中的表达特性,以及高温、低温、盐胁迫及ABA处理后的表达变化。同时,构建 CpTAF10基因的过表达载体,采用花序侵染法进行拟南芥遗传转化,对拟南芥转基因纯合株系进行表型观察和胁迫耐性分析。【结果】获得的 CpTAF10基因 cDNA序列为712 bp,包含405 bp的开放阅读框(ORF),编码134个氨基酸,蛋白理论分子量为15.21 kDa,预测的等电点pI值为5.19。CpTAF10蛋白序列与其他植物同源序列具有较高的同源性,蛋白多序列比对显示CpTAF10蛋白属于TAF10同源蛋白,并含有组蛋白折叠结构域。表达特性分析结果发现,CpTAF10基因在蜡梅的根、茎、子叶、幼叶、成熟叶和花6个不同组织中均有不同程度的表达,其中,在成熟叶中的表达量最高。 CpTAF10在蜡梅花朵的不同花期中,呈现出波动的表达模式,在衰老期表达量最高。在低温、盐胁迫和ABA处理的蜡梅叶片中均能被诱导表达,但其表达变化各不相同。在拟南芥中过表达 CpTAF10基因可提高盐胁迫下拟南芥种子的萌发率,相对于野生型植株,转基因植株的主根和侧根在盐胁迫下均表现出一定的生长优势。【结论】 CpTAF10基因能在低温、盐胁迫和ABA处理后诱导表达,可能参与蜡梅逆境胁迫耐性的分子调控。在拟南芥中过表达 CpTAF10基因显著提高了转基因拟南芥的萌芽率及主根和侧根的生长优势,在一定程度上可增强植物的盐胁迫耐性。     

茶籽象ATP合成酶基因在不同海拔选择压力下的遗传分化及结构变异

【目的】基于不同地区茶籽象线粒体ATP合成酶基因遗传分化及结构变异,研究环境压力尤其是海拔对茶籽象不同地理种群遗传多样性及系统发育关系的影响,探讨ATP合成酶基因在适应环境压力中碱基及氨基酸序列结构变化规律,为茶籽象防控提供理论依据。【方法】采集不同地理海拔油茶产区的茶籽象种群,设计ATP合成酶基因特异性引物,PCR扩增获取ATP基因,基于ATP基因应用相关分析软件分析碱基序列遗传多样性及系统发育关系,分析氨基酸序列结构差异及氨基酸使用频率。【结果】获得32个单倍型(NCBI: MH560360—MH560391),其中存在5个共享单倍型,包含个体数2~36不等;茶籽象各地理种群遗传多样性分化无明显规律(核酸多样性π为0.000 86 ~ 0.048 03),茶籽象种群扩张不明显(Tajima’s D < 0,P > 0.05;Fu’s Fs > 0);依据地理海拔,茶籽象种群可显著聚为低海拔和高海拔2个分支,2个分支间受到显著的环境正选择(选择系数:高海拔ω=1.65,低海拔ω=2.26,LRTP<0.001),分化明显( F st =0.374,P < 0.001);低海拔分支 ATP[STBX]8[STBZ]编码解氨基酸序列(36个保守位点)较高海拔分支(27个保守位点)更为保守,且高海拔分支酸性氨基酸使用率较高,这可能与昆虫为适应高海拔而增加蛋白稳定性、提高氧结合效率以及氧化呼吸效率有关。【结论】茶籽象种群ATP合成酶基因分化程度不高,但存在对海拔明显的适应性进化。     

刚毛柽柳Thb HLH1转录因子识别的顺式作用元件的鉴定

[目的]本研究拟对Thb HLH1所识别的顺式作用元件进行鉴定,进一步揭示Thb HLH1调控抗逆基因表达的机理。[方法]利用以转录因子为中心的酵母单杂交系统鉴定Thb HLH1所识别的顺式作用元件;将元件与报告基因融合构建报告载体(p CAM-Cis),通过基因枪法将报告载体与效应载体35S∶Thb HLH1共转化烟草叶片,在盐、干旱胁迫下比较GUS酶活。[结果]鉴定出2段能够与Thb HLH1转录因子结合的DNA序列:分别为CCGAAA(LTRE1)和TGAC(WRKY710S)。[结论]在盐或干旱胁迫下,Thb HLH1通过与LTRE1或WRKY710S元件作用来激活基因表达。     

4个品种核桃砧木幼苗干旱生理响应及抗旱性评价

【目的】对4个品种核桃砧木幼苗进行抗旱性评价,旨在筛选适合干旱、半干旱核桃产区的优良抗旱核桃砧木。【方法】以4个常用核桃砧木品种为试材,研究干旱对其盆栽幼苗生长速率、水分利用效率、光合参数和叶绿素荧光参数的影响,采用模糊数学隶属函数法对其抗旱性进行综合评价。【结果】干旱条件下,核桃砧木幼苗间存在显著的品种间差异,其中,‘鸡爪绵’的相对生长速率(R)、长期水分利用效率(R_LWUE)、净光合速率(P_n)和光系统Ⅱ的最大光化学效率(F_v/F_m)最高,分别为0.92 mg/d、70.24 g/L、15.22 μmol/(m^2·s)和0.79。干旱显著降低了核桃砧木幼苗的R、P_n和F_v/F_m,其中‘鸡爪绵’的降低幅度最小,分别为30.30%、22.78%和7.06%。干旱显著提高了核桃砧木幼苗的R_LWUE和瞬时水分利用效率(R_IWUE)。‘核桃楸’的R_LWUE增幅最大,为16.20%,其次是‘鸡爪绵’,为15.70%。‘鸡爪绵’的R_IWUE增幅最大,为16.61%。‘鸡爪绵’‘香玲’‘核桃楸’和‘黑核桃’的隶属函数平均值分别为0.99、0.68、0.48和0.07,表明核桃砧木幼苗抗旱性存在较大的品种间差异。【结论】‘鸡爪绵’和‘香玲’抗旱性强,且种子易获得,适合在干旱半干旱地区广泛应用,‘黑核桃’和‘核桃楸’抗旱性弱,且种子较难获得,不适宜在干旱地区应用。     

11个北高丛越橘品种对干旱胁迫的响应

【目的】揭示北高丛越橘对干旱胁迫的响应机制并筛选出耐旱性较强的越橘品种。【方法】以11个北高丛越橘品种1年生扦插苗为试材,分别为‘蓝丰’‘瑞卡’‘双迪’‘斯巴坦’‘卡拉’‘伊丽莎白’‘钱德勒’‘布里吉塔’‘公爵’‘甜心’‘埃利奥特’,研究干旱胁迫对光合生理特性的影响,并评价不同品种的抗旱性。【结果】干旱胁迫20 d后,北高丛越橘品种脯氨酸含量、丙二醛含量、过氧化氢酶活性、胞间CO_2浓度均显著升高,而净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、光系统Ⅱ实际光量子产量和电子传递速率均显著降低。通过主成分分析,将16项生理生化指标转化为3个互相独立的综合指标,累计贡献率达85.74%。主成分1主要反映叶片生理特性、抗氧化酶活性及主要的叶片荧光参数等信息,主成分2主要反映叶片气孔功能信息,主成分3主要反映叶片光合作用相关信息。通过聚类分析,将11个北高丛越橘品种划分为3个类型:‘甜心’‘公爵’和‘蓝丰’为抗旱型,‘布里吉塔’‘伊丽莎白’‘瑞卡’和‘埃利奥特’为中间型,‘钱德勒’‘双迪’‘斯巴坦’和‘卡拉’为不抗旱型。根据抗旱性综合评价值,11个北高丛越橘品种按照抗旱性由高到低排序依次为‘甜心’‘公爵’‘蓝丰’‘布里吉塔’‘伊丽莎白’‘瑞卡’‘埃利奥特’‘卡拉’‘斯巴坦’‘双迪’‘钱德勒’。【结论】采用主成分分析、隶属函数法、聚类分析等相结合的方法对北高丛越橘苗期耐干旱胁迫能力进行评估,可以较好地揭示性状指标与耐干旱胁迫能力的关系。11个北高丛蓝莓品种中‘甜心’‘公爵’和‘蓝丰’耐干旱胁迫能力较强。     

7个接骨木无性系苗木对盐胁迫的生理响应与评价

【目的】为揭示接骨木无性系在盐害胁迫下的生长生理指标的响应,确定接骨木对盐渍环境的适应能力及耐盐性,为盐碱地造林提供优良无性系。【方法】以接骨木属3个种的7个无性系为试验材料,采用盆栽试验的方法,利用不同浓度的NaCl溶液进行胁迫处理,比较不同处理下各无性系的生长、生理等指标的变化,结合主成分分析对不同无性系进行综合评价。【结果】受NaCl胁迫的影响,7个接骨木无性系的苗高、地径和生长量增量生长指标均表现出下降的趋势,其中,无性系XY-2的生长指标受NaCl胁迫影响最小,较对照T0,其苗高降幅14.9%,表现出较强的耐盐性;各无性系根冠比和细胞膜透性指标出现升高趋势,无性系JY-1和XY-3的根冠比增幅最大,较对照T0,增幅分别为84.0%和88.2%。无性系PT-3和XY-1的细胞膜透性增幅最小;7个接骨木无性系的叶绿素含量不断下降,较对照T0,无性系XY-3的叶绿素含量最大,下降幅度为44.3%,且呈显著性差异水平;7个接骨木无性系的超氧化物歧化酶(SOD)活性均不同程度地出现先上升后下降的趋势,无性系PT-3的SOD值最大;渗透调节物可溶性糖含量和脯氨酸含量均随NaCl胁迫浓度增加而增加,可溶性糖含量增幅最大的无性系为XY-3和XY-1,较对照T0,增幅分别为2.13倍和1.79倍。在溶液盐分浓度6‰胁迫下,7个接骨木无性系中脯氨酸含量最大的无性系是XY-1。【结论】综合评价得出接骨木无性系耐盐程度由强到弱依次为XY-2、XY-3、XY-1、JY-1、PT-1、PT-3、PT-2。其中,无性系XY-2、XY-3具有较强耐盐性,可作为耐盐接骨木无性系材料进行下一步研究。     

碧玉杨叶形态结构与生理特性对干旱的响应

【目的】以群众杨为对照,探讨干旱胁迫下碧玉杨的叶形态、结构和光合、水分生理特性的关系及其影响植株生物量积累的内在成因,进一步揭示碧玉杨和群众杨的抗旱机制,为区域造林绿化杨树的抗旱生理研究和品种推广提供参考。【方法】以碧玉杨与和群众杨1年生扦插苗为研究对象,应用盆栽控水法模拟干旱条件,对比分析不同干旱胁迫程度下2个品种的叶面积、叶脉密度、叶氮素利用效率、光合特性及叶水分输导能力的响应,及其对植株生物量和抗旱能力的影响。【结果】干旱胁迫程度加剧,2个杨树品种的叶脉密度(LVD)和单位干质量叶氮含量(N_mass)上升,碧玉杨的LVD增幅大、N_mass增幅小;净光合速率(P_n)、植株总光合速率(PTL)、最大净光合速率(P_nmax)、光合日累积量、蒸腾日累积量、叶导水率(K_leaf)、水分利用效率(WUE)、光合氮利用效率(PNUE)、叶面积(LA)以及植株生物量(TB)均下降,碧玉杨的降幅均小。相较群众杨而言,碧玉杨的LA、LVD、PNUE、TB和日均耗水量在干旱胁迫前后均高,P_n、K_leaf、WUE和N_mass在干旱胁迫前后均低,PTL和Tr日累积在中度和重度干旱胁迫下高,P_nmax、P_n日累积和Tr在重度干旱胁迫下高。PTL较Pn与TB相关关系更紧密,PNUE较N_mass与TB相关关系更紧密。【结论】干旱胁迫下碧玉杨的叶形态结构与生理特性呈现出低效水分利用、高效叶形态结构调整、高效氮素利用和高效光合固碳的平衡制约关系。2个品种的抗旱机制不同,抗旱能力强的碧玉杨其叶结构调整更高效,抗旱能力弱的群众杨其光合特性对干旱更敏感,叶结构与抗旱性关联最大,其次是光合特性。     

杨树HSP90基因的克隆及生物信息学分析

【目的】为了揭示热激蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)基因在杨树抗溃疡病中的功能,克隆获得毛白杨HSP90基因的全长序列,以期明确HSP90基因的表达与溃疡病菌侵染间的关系。【方法】采用RT-PCR技术和Gateway克隆的方法,获得了毛白杨的HSP90基因序列,并利用相关软件对该基因编码的蛋白的理化性质、疏水性、结构域、功能及亚细胞定位等进行了生物信息学分析。【结果】毛白杨的HSP90基因序列(NCBI登录号:AGU99972.1)全长为2 100 bp,其中A+T占52.90%,C+G占47.10%,共编码699个氨基酸。毛白杨HSP90基因的生物信息学分析结果显示,该基因编码的蛋白相对分子质量为80.08 kDa,理论等电点为4.96。毛白杨HSP90蛋白主要位于细胞核和细胞质膜中,且在N端含有1个基因保守结构域HATPase_c,可与ATP结合,具有内源ATPase活性,属于HSP90家族,为亲水性蛋白,可能具有离子通道的功能。同时,对毛白杨的HSP90基因进行系统进化分析,发现毛白杨的HSP90基因与毛果杨(gi 539331543)、大豆(gi 358248990和gi 356552478)的亲缘关系较近,而与毛果杨(gi 224124864)的亲缘关系相对较远,说明同一物种的HSP90进化可能有所不同。【结论】首次从毛白杨中成功克隆得到与抗溃疡病相关的HSP90基因,并对其序列和生物学信息进行了分析,为下一步研究HSP90基因在杨树抗溃疡病中的功能奠定基础,也为进一步研究HSP90基因在杨树抗逆胁迫中的生理功能提供了理论支持。