用PCR检测鸡大肠杆菌耐热肠毒素基因

用１对合成的特异性核苷酸片段,通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）,以鸡致病性大肠菌２０个血清型菌株提取的染色体进行扩增,标准阳性对照（ｐＳＬＭ－４００）及扩增到１６个大小的为１５０ｂｐ的ＤＮＡ阳性片段,其它自株及阳性对照株ｐＥＷＤ２９９未扩增到产物,斑点杂交表明,所扩增的阳性条带与标准耐热肠毒素基因（ＳＴ）杂交后呈强阳性。     

聚合酶链反应扩增大肠杆菌志贺样毒素基因

两对寡核苷酸引物通过聚合酶链反应扩增大肠杆菌志贺样毒素Ｉ（ＳＬＴ Ｉ）和志贺样毒素Ⅱ（ＳＬＴⅡ）基因,在单一反应中,两对引物分别扩增出１３０ｂｐ（ＳＬＴⅠ）和３４６ｂｐ（ＳＬＴ Ⅱ）的ＤＮＡ 片段,扩增片段经地高辛标记寡核苷酸探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 印迹杂交分析,证实为ＳＬＴ Ⅰ和ＳＬＴ Ⅱ基因产物。同一扩增反应中应用ＳＬＴⅠ和ＳＬＴⅡ复合引物进行扩增,不同基因型志贺样毒素大肠杆菌从样品中鉴定出。８６９份牛、猪腹泻粪样ＤＮＡ 样品通过ＰＣＲ进行了测定,其中,３％ 检出志贺样毒素大肠杆菌,与牛出血性腹泻、猪水肿病有关。     

猪生殖与呼吸综合征病毒ORF6片段的cDNA克隆及鉴定

根据已发表的ＰＲＲＳＶ基因组序列，设计并合成了１对特异扩增ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２株的ＯＲＦ６的基因的引物，以ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２基因组为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出５８６ｂｐ的ｃＤＮＡ产物。将该ｃＤＮＡ片段经Ｔ－Ａ连接插入ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体中，用重组质粒转化大肠埃希氏菌ＪＭ１０９，获得重组质粒转化菌。对重南粒ＤＮＡ进行ＰＣＲ及酶切鉴定，证明插入的ＤＮＡ片段与ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段大小相     

聚合酶链反应扩地大肠杆菌志贺样毒素基因

两对寡核苷酸经物通过聚合酶链反应扩增大肠杆菌志贺样毒素Ⅰ（ＳＬＴⅠ）和志贺样毒素Ⅱ（ＳＬＴ Ⅱ）基因,在单一反应中,两对引物分别扩增出１３０ｂｐ（ＳＬＴⅠ）和３４６ｂｐ（ＳＬＴⅡ）的ＤＮＡ片段,扩增片段经地高辛标记寡核苷酸探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交分析,证实了ＳＬＴⅠ和ＳＬＴⅡ基因产物。     

制备K700bp成探针与美意和平湖两品系西蜂RAPD-PCR扩增产物及它们基因组DNA分子杂交的研究

Ｋ７００ｂｐ 是高产蜜西蜂引物Ｋ（５’－ ＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣ－ ３’） ，通过ＲＡＰＤ－ ＰＣＲ 扩增出来的一个特有ＤＮＡ 片段。然后将Ｋ７００ｂｐ 制备成探针再与高、低产蜜西蜂的ＰＣＲ 产物及它们的基因组进行杂交。结果Ｋ７００探针只与高产蜜西蜂的ＰＣＲ 产物及其基因组杂交，证明Ｋ７００ｂｐ 确实是高产蜜西蜂的一个特有ＤＮＡ 片段。     

制备K700bp成探针与美意和平湖两品系西蜂RAPD—PCR扩增产物及它们基因 …

Ｋ７００ｂｐ是高产蜜西蜂引物Ｋ（５’－ＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣ－３’），通过ＲＡＰＤ－ＰＣＲ扩增出来的一个特有ＤＮＡ片段。然后将Ｋ７００ｂｐ制备成探针再与高、低产蜜西蜂的ＰＣＲ产物及它们的基因组进行杂交。结果Ｋ７００探针只与高产蜜西蜂的ＰＣＲ产物及其基因组杂交，证明Ｋ７００ｂｐ确实是高产蜜西蜂的一个特有ＤＮＡ片段。     

大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合基因的构建

用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌不耐热肠毒素（ＬＴＢ）基因的质粒ｐＸＬＴ１－１,回收５０５ｂｐ的ＬＴＢ基因片段,再用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌耐热肠毒素（ＳＴ１）基因的质粒ｐＸＳＴ１,与上述回收的ＬＴＢ基因片段连接,转化至受体菌ＪＭ１０９中。经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组子质粒ｐＸＳＬＴ１。ＥＬＩＳＡ检测到了ＳＴ１－ＬＴＢ融合蛋白,而且该融合蛋白无天然ＳＴ１生物毒性。     

牛β—酪蛋白基因上游调控序列PCR扩增及克隆

采用蛋白酶Ｋ法从母牛肝中提取染色体ＤＮＡ,将其纯化后作为ＰＣＲ扩增模板。以引物设计软件从牛β－酪蛋白基因上游６００ｂｐ至第１个外显子设计引物,引物长度１９ｎｔ,跨度６３７ｂｐ。扩增产物电泳结果显示,在分子量Ｍａｒｋｅｒ６５７ｂｐ带附近,出现一明显亮带,这一结果与设计产物大小基本一致。用低温冷冻法纯化ＰＣＲ产物,煮沸裂解法提取载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫｓ＋质粒,ＥｃｏＲＶ酶切质粒ＤＮＡ,Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接ＰＣＲ扩增片段和质粒ＤＮＡ。将重组质粒ＤＮＡ转化到ＪＭ１０１大肠杆菌中,经筛选、酶切、测序鉴定,结果表明所克隆的片段为牛β－酪蛋白基因上游调控序列。     

绵羊SRY基因的分子克隆及序列分析

本研究利用常规方法提取绵羊基因组ＤＮＡ，根据人的ＳＲＹ基因核心序列设计合成了一对引物Ｐ１、Ｐ２。用ＰＣＲ技术对公、母绵羊基因组ＤＮＡ进行体外扩增，将所扩增出的公绵羊特异性ＳＲＹ基因片段重组到质粒ＤＮＡｐＵＣ１９的ＳｍａＩ部位并转化到Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ中。挑选阳性克隆进行微溶分析，并用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄⅢ酶解。鉴定结果表明，插入片段长度与ＰＣＲ扩增带相符，约２０３ｂｐ。用Ｓａｎｇｅｒ的双脱氧末端终止法测定绵羊ＳＲＹ基因核心序列的部分序列，结果表明，用ＰＣＲ分离并重组到质粒载体中的绵羊ＳＲＹ基因核心序列部分序列长度为２０３ｂｐ，这与设计完全相符。其中该序列的１５５个ｂｐ与人的ＳＲＹ基因相应序列的同源性为８２．５８％（１２８／１５５）。可见哺乳动物ＳＲＹ基因的核心序列具有高度保守性，种间差异很小。     

用PCR技术从同一兔出血症病料扩增和检出2种病毒核酸

应用 Ｐ Ｃ Ｒ 和 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 技术，对兔出血症病毒核酸作了鉴定。分别设计合成 ２ 对 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增特异性引物，即按兔出血症病毒中国分离的 Ｎ Ｊ株核酸序列合成 １ 对引物（ Ｎ Ｊ引物），按德国分离的 Ｆ Ｒ Ｇ 株核酸序列合成另 １ 对引物（ Ｆ Ｒ Ｇ 引物），进行 Ｐ Ｃ Ｒ 和 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ。从纯化的病毒核酸样品和感染 Ｄ Ｊ Ｒ Ｋ 细胞的病毒核酸样品中，均扩增出 ２ 对引物范围内的特异性核酸片段， Ｎ Ｊ引物扩增产物为 ３６４ ｂｐ， Ｆ Ｒ Ｇ 引物扩增产物为 ５１３ｂｐ。模板用 Ｒ Ｎａｓｅ 消化后，仍出现 ３６４ ｂｐ 带，用 Ｄ Ｎａｓｅ Ｓ１ 消化，则此带消失；反之，用 Ｄ Ｎａｓｅ Ｓ１ 消化，出现５１３ ｂｐ 带，用 Ｒ Ｎａｓｅ 消化，则此带消失，证实前者模板为 Ｄ Ｎ Ａ，后者为 Ｒ Ｎ Ａ。 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交试验证实， Ｐ Ｃ Ｒ扩增出的核酸片段与各自的地高辛标记特异性探针发生强阳性杂交反应。由此认为，在兔出血症病毒感染中，同时存在着 ２ 种不同核酸型的病毒。