水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达及序列分析

根据Thanatephorus cucumeris G蛋白β亚基序列（AY884129）设计引物,对水稻立枯丝核菌AG 1IA的 G蛋白β亚基基因进行了克隆。PCR结果得到1条约为1.9 kb的扩增片段,包含1个约1.7 kb的完整开放阅读框,编码366个氨基酸。同源性检索发现该序列与大量Ｇ蛋白β亚基基因明显同源,一致性介于57.34%~88.14%。根据其推导cDNA序列设计引物进行RT PCR分析,发现该基因在对数生长期表达量最高,提示水稻立枯丝核菌AG 1IA G蛋白β亚基基因可能具有时空表达特性。     

PCR步行法克隆油菜自交不亲和基因

同源序列法与PCR步行法相结合,在油菜中克隆自交不亲和基因SLG和eSRK (extra-cellular SRK).所克隆的SLG序列长为882bp,克隆的eSRK序列长度分别为1495bp(青海大黄)、1494bp(黄籽沙逊)、1727bp(关中油白菜);其GeneBank登陆号分别为AY448025、AY448026、AY448027、AY448028、AY448029、AY448030.缺失突变可能是导致青海大黄和黄籽沙逊自交亲和的原因.克隆的SLG基因与甘蓝和白菜型油菜的SLG基因有很高的同源性,而eSRK基因与甘蓝和白菜型油菜的SRK基因的同源性较高.同源序列法与PCR walking法相结合,可以有效地克隆基因;但在克隆SLG基因的两翼序列时遇到了困难,说明PCR步行法仍有待改进.     

青稞B组醇溶蛋白基因5''上游调控区的TAIL-PCR克隆及序列分析

为了阐明青稞种子中B组醇溶蛋白合成的遗传调控机制,为分子改良大麦和小麦籽粒品质奠定基础,以青稞品种Z09和Z26的基因组DNA为模板,根据已克隆的青稞B组醇溶蛋白(B-hordein)基因的5'端序列设计三个基因特异的反向引物,分别与随机简并引物配对,进行热不对称嵌套PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)扩增,从两份西藏青稞材料中分离克隆出2个B-hordein基因的上游调控序列.序列测定结果表明,两个扩增片段长度分别为395和396 bp,加上已知B-hordein基因中的GSP2引物序列与翻译起始密码子之间198 bp的长度,则可得到约600 bp的B-hordein基因5'上游调控序列.将所得序列与Genbank中的三个贮藏蛋白基因的对应区段进行序列比对,所得序列与来自野生智利大麦(H.chilense)的B3-hordein基因(Genbank登录号:AY998010)、普通小麦(T.aestivum)的低分子量麦谷蛋白亚基基因(Genbank登录号:X07747)和栽培大麦(H.vulgare)的B-hordein基因(Genbank登录号:X03103)具有81%～95%的序列相似性.推测其TATA box位于-80 bp,CAAT-like box位于-140 bp处.另外,在-300 bp处存在一个胚乳盒(Endosperm Box,EB),包含EM基序和GCN4基序.EM基序高度保守,GCN4基序有一个核苷酸位点的突变.此外,在约-560 bp处存在一个胚乳盒类似结构.     

青稞B组醇溶蛋白基因5′上游调控区的TAIL-PCR克隆及序列分析

为了阐明青稞种子中B组醇溶蛋白合成的遗传调控机制，为分子改良大麦和小麦籽粒品质奠定基础，以青稞品种Z09和Z26的基因组DNA为模板，根据已克隆的青稞B组醇溶蛋白（B-hordein）基因的5’端序列设计三个基因特异的反向引物，分别与随机简并引物配对，进行热不对称嵌套PCR（Thermal asymmetric interlaeed PCR，TAIL-PCR）扩增，从两份西藏青稞材料中分离克隆出2个B-hordein基因的上游调控序列。序列测定结果表明，两个扩增片段长度分别为395和396bp，加上已知B-hordein基因中的GSP2引物序列与翻译起始密码子之间198bp的长度，则可得到约600bp的B-hordein基因5’上游调控序列。将所得序列与Genbank中的三个贮藏蛋白基因的对应区段进行序列比对，所得序列与来自野生智利大麦（H．chil-ense）的B3-hordein基因（Genbank登录号：AY998010）、普通小麦（T.aestivum）的低分子量麦谷蛋白亚基基因（Genbank登录号：X07747）和栽培大麦（H．vulgare）的B-hordein基因（Genbank登录号：X03103）具有81％～95％的序列相似性。推测其TATAbox位于-80bp，CAAT-likebox位于-140bp处。另外，在-300bp处存在一个胚乳盒（EndospermBox，EB），包含EM基序和GCN4基序。EM基序高度保守，GCN4基序有一个核苷酸位点的突变。此外，在约-560bp处存在一个胚乳盒类似结构。     

利用多重PCR技术快速鉴定番木瓜性别

利用鉴定番木瓜雄性性别的特异基因片段(1 001 bp)的引物和鉴定番木瓜雄性、两性性别的特异基因片段(225 bp)的引物,分别以5个品种番木瓜的3种性别植株的总DNA为模板进行多重PCR扩增,结果表明:以雄株总DNA为模板得到1个1 001 bp和1个225 bp的扩增产物,以雌株总DNA为模板没有得到扩增产物,以两性株总DNA为模板得到1个225bp的扩增产物,根据多重PCR扩增结果,可以将番木瓜3种性别植株一次性鉴定出来.     

菜豆几丁质酶基因的克隆、序列分析及其表达

根据GenBank中收录的菜豆几丁质酶基因mRNA序列设计一对引物,以菜豆品种五常油豆总DNA为模板,通过PCR扩增获得一个约1.1kb的DNA片段Bchi,将其克隆入pUC18载体.测序和序列分析结果表明,该序列全长1088bp,含有一个981bp的完整开放读码框,无内含子,编码327个氨基酸,编码产物在结构上具有Class Ia几丁质酶的结构特征:N-端具有一个26个氨基酸的信号肽,其后是富含8个半胱氨酸、长41个氨基酸的几丁质结合区和由249个氨基酸组成的高度保守的催化区,C-端为由11个氨基酸组成的液泡定位多肽.序列与结构上的同源性分析表明Bchi基因是菜豆Class Ia几丁质酶基因.此序列已在GenBank中注册,登录号为AY357300.以pQE-30为原核表达载体,构建成pQE-Bchi重组表达载体,转化表达受体菌E.coliM15,经IPTG诱导后表达出一个约35kD的蛋白,与推测的Bchi基因编码产物的大小一致,表明Bchi基因在大肠杆菌中能够表达,是一个具有表达功能的基因.     

中国常用橡胶树品种鉴定方法研究

橡胶树(Hevea brasiliensis)产生的胶乳是天然橡胶的最重要来源,不同品种产生胶乳的能力不同,但不同的橡胶树品种形态差异小,难以区分。利用简单的方法区分不同的橡胶树品种具有重要的意义。以天然橡胶生物合成相关的7个基因家族中的目的基因及启动子序列为模板,设计基因特异的PCR引物16对,分别扩增21个橡胶树栽培品种的基因组DNA,扩增条带的多态性可将19个品种区分开(除了云研77-4和南华1号外)。再利用橡胶小粒子编码蛋白基因(SRPP2)特异的引物,扩增云研77-4和南华1号的SRPP2基因,PCR反应产物直接测序,通过单核苷酸水平上的差异可准确的将二者区分开。本研究通过简单的PCR扩增及其扩增产物的直接测序,建立了一种稳定性好、简单快速、经济高效的鉴定橡胶树品种的方法。     

光叶花生两个重要基因片段的克隆和序列测定

从不亲和野生花生Arachis glabrata Benth中提取DNA，在多重序列比对的基础上设计PCR引物，成功扩增出约350、750bp的两个片段，与DES和RS基因片段预期分子量相符。PCR产物与T栽体连接，转化受体菌XL1-Blue，获得了白色菌落，挑取白色菌落在液体培养基中过夜培养，经TTE溶液和热处理后进行PCR扩增，获得了载有目的基因片段的阳性重组子，测序和序列比对分子的结果说明，DES和RS基因片段克隆成功。这是首次从不亲和野生花生A.glabrata Benth中克隆出的基因片段，该片段可用作探针克隆相关基因全编码区。     

甘蓝型油菜固醇载体蛋白2基因BnSCP-2的克隆与表达

固醇载体蛋白2(SCP-2)是一类小分子碱性蛋白,参与细胞内脂质运输、脂肪酸代谢以及过氧化物酶体β-氧化等过程。利用同源序列设计引物进行PCR扩增,克隆得到甘蓝型油菜固醇载体蛋白2基因的c DNA序列,命名为BnSCP-2。BnSCP-2的开放阅读框长372bp,编码一个由123个氨基酸残基组成的蛋白质,预测的蛋白质相对分子质量为13.52kD,等电点为9.35。SCP-2蛋白氨基酸序列非常保守,系统进化分析表明BnSCP-2与拟南芥SCP-2同源性最高。荧光实时定量PCR结果表明BnSCP-2在检测的各个组织均有表达,其中花和花蕾中的表达量最高;赤霉素、细胞分裂素和脱落酸等可显著诱导幼苗中该基因的表达,推测该基因可能参与调控幼苗生长发育。     

甘薯NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆、分析及数目研究

根据植物抗病基因保守序列设计特异引物,对甘薯高抗茎线虫病品种AB94078-1、感病品种徐18及其8个后代品系进行PCR扩增.获得15个具有完整氨基酸读码框的片段,均具有NBS类抗病蛋白4个保守基序,其中5个片段含LRR结构.利用从亲本AB94078-1扩增的R510-AB作为探针进行Southern杂交,结果表明,其在基因组中存在多个拷贝,并估计其在基因组中的拷贝数目,克隆新的甘薯RGA序列,为进一步获得甘薯抗病基因打下基础.     

禾谷缢管蚜羧酸酯酶基因cDNA片段的克隆与序列分析

为开展禾谷缢管蚜（Rhopalosiphum padi Linnaeus）抗性的分子生物学研究，设计简并引物并采用RT—PCR技术，克隆了长度分别为260、331、337bp的3个禾谷缢管蚜的羧酸酯酶cDNA片段，命名为Rp．est1、Rp．est2、Rp．est3；3个片段推导氨基酸残基分别为87、110、112个；同源性分析表明，Rp．estl、Rp．est2、Rp．est3之间的相似性在40％左右，表明其分别代表不同基因；Rp．est1、Rp．est2、Rp．est3与其他昆虫羧酸酯酶基因序列具有较高的相似性，其GeneBank登录号分别为AY622997、AY869713、AY869714。     

甘蔗锌指蛋白ShZP基因正义反义植物表达载体的构建及转化烟草

根据本实验室克隆的甘蔗锌指蛋白ShZP基因cDNA序列,在开放阅读框两侧设计特异引物,通过PCR扩增引入相应的酶切位点,把甘蔗ShZP基因的编码区(大小为725bp)cDNA片段,分别以正向和反向插入到中间载体pCRBI的Prd29A启动子和NOS终止子之间,构建了其正义植物表达载体pCRBIShZP和反义表达载体pCRBIantiShZP.采用冻融法分别将pCRBIShZP和pCRBIantiShZP导入根瘤农杆菌菌株EHA105中,通过农杆菌介导法对烟草进行转化,经过12mg/L的PPT连续抗性筛选,共获得23株抗性植株,对其中的5株转正义基因烟草植株和9株转反义基因烟草植株进行PCR检测,分别获得3株转正义基因的阳性植株和4株转反义基因的阳性植株.PCR检测结果初步证明外源甘蔗锌指蛋白ShZP基因已成功整合到烟草基因组中,这一研究为植物抗逆基因工程研究打下了一定的基础.     

一个新的大豆类受体蛋白激酶基因rlpk2的克隆及其结构特征

植物类受体蛋白激酶在细胞生长及对环境胁迫反应方面起着非常重要的作用.本文报告用RACE方法(快速扩增cDNA末端)扩增一个新的大豆类受体蛋白激酶基因rlpk2的全长cDNA.根据RACE的结果,我们克隆了rlpk2的cDNA,其序列信息已经提交到GenBank(Accession No.AY687391).经初步分析,rlpk2编码产物为LRR型类受体蛋白激酶.     

Cloning and Comparative Studies of Seaweed Trehalose-6-Phosphate Synthase Genes

The full-length cDNA sequence (3219 base pairs) of the trehalose-6-phosphate synthase gene of Porphyra yezoensis (PyTPS) was isolated by RACE-PCR and deposited in GenBank (NCBI) with the accession number {"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"AY729671","term_id":"56718401","term_text":"AY729671"}}AY729671. PyTPS encodes a protein of 908 amino acids before a stop codon, and has a calculated molecular mass of 101,591 Daltons. The PyTPS protein consists of a TPS domain in the N-terminus and a putative TPP domain at the C-terminus. Homology alignment for PyTPS and the TPS proteins from bacteria, yeast and higher plants indicated that the most closely related sequences to PyTPS were those from higher plants (OsTPS and AtTPS5), whereas the most distant sequence to PyTPS was from bacteria (EcOtsAB). Based on the identified sequence of the PyTPS gene, PCR primers were designed and used to amplify the TPS genes from nine other seaweed species. Sequences of the nine obtained TPS genes were deposited in GenBank (NCBI). All 10 TPS genes encoded peptides of 908 amino acids and the sequences were highly conserved both in nucleotide composition (>94%) and in amino acid composition (>96%). Unlike the TPS genes from some other plants, there was no intron in any of the 10 isolated seaweed TPS genes.     

花生(Arachis hypogaea L.) CaM基因克隆与序列分析

提取花生(Arachis hypogaea L.)幼嫩叶片基因组DNA,合成5'端和3'端引物,进行PCR并克隆测序,得到CaM基因组的2个异型基因PGCaM-1和PGCaM-3,登录Genebank并注册为AY517933、AY572856。序列分析表明,PGCaM-1序列全长1425 bp,在第25个氨基酸之后有一个长度为973 bp的内含子,PGCaM-3序列全长447 bp。两个异型基因的开放读码框均由447个核苷酸组成,共编码148个氨基酸,同属于EF手型CaM超家族成员,核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为96%和98%,与已知花生CaM cDNA序列及氨基酸均有极高的同源性,序列之间的差异可能引起表达和功能上的差异。     

豆豉纤溶酶基因的克隆及其在枯草杆菌中的表达

以实验室筛选的UD8豆豉芽孢杆菌的总DNA为模板,应用PCR技术根据豆豉纤溶酶基因DNA序列(GeneBank AY720895.2)设计并合成1对引物,扩增出了豆豉纤溶酶基因,将该基因克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒EC-BS8上,构建成表达质粒EC-BS8,再将其转化到枯草芽孢杆菌Bs6中。筛选表达菌株,实现了豆豉纤溶酶基因在枯草杆菌中高效表达。获得重组菌纤溶酶活力高达9 830 IU.mL-1,是出发菌株活力的2.9倍。经纯化SDS-PAGE鉴定重组豆豉纤溶酶相对分子质量为31.0 kDa。     

马铃薯病毒外壳蛋白融合基因转化马铃薯及其抗病性分析

将多种病毒的有效核酸片断拼接成融合基因转入马铃薯可获得多抗马铃薯材料。针对马铃薯生产中分布广泛、危害严重并经常混合感染的马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)和马铃薯S病毒(PVS),开展了利用基因工程方法获得兼抗4种马铃薯病毒转基因马铃薯材料的研究。试验在前期获得含4种马铃薯病毒外壳蛋白基因片段的质粒pART27-XSYV-rh的基础上,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化马铃薯(Solanum tuberosum)品种‘陇薯3号’,PCR扩增和PCR-Southern杂交证明,4价融合基因已整合到马铃薯基因组中。qRT-PCR分析表明,该融合基因在转基因植株中能正常表达。3株转基因植株的抗病性鉴定结果表明,2株对4种病毒同时具有抗性;1株对PLRV侵染表现阳性,对另外3种病毒同时具有抗性。     

橡胶灵芝菌（Ganoderma pseudoferreum）DNA 条形码检测 筛选

选用 10 对 DNA 条形码标准序列 ITS、COI、nrDNA-LSU、nrDNA-SSU 和 trnL DNA 对海南和云南红根病区 分离的 21 个橡胶灵芝菌进行检测。除 COI 和 trnL DNA 外，其他 8 对引物均扩增得到 PCR 产物，产物大小范围为 268~1 355bp，种内相似度为 98.05%~99.54%。分别将扩增得到的序列与 GenBank 公布上的 Ganoderma 属和常见真 菌属序列，共 77 个 ITS、74 个 nrDNA-LSU 和 74 个 nrDNA-SSU 序列进行系统进化树构建与分析。结果表明：nrDNA-LSU 序列和 nrDNA-SSU 序列种间差异较小，不能准确区分 Ganoderma 属及其他属；5 对 ITS 序列均能区分 Ganoderma 属，但仅 ITS1/ITS4 序列能将 Ganoderma 属下 16 个种归入不同分支。ITS1/ITS4 序列表现出适宜的种内与种间差异， 适宜作为 G. pseudoferreum 的 DNA 条形码。