菲律宾蛤仔凝集素的分离纯化及抑菌活性研究

采用Cellulose DE52离子交换层析、Sephadex G- 100分子筛层析及TSK G3000PWXL凝胶色谱柱HPLC从菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum中分离纯化出具有N-乙酰半乳糖酰胺(N- acetyl- D- galactosamine,GaINAc)和猪胃黏蛋白(Mucin from porcine stomach,PSM)特异性的菲律宾蛤仔凝集素(简称为MCL-T).SDS-PAGE分析结果表明,MCL-T的相对分子量为148000,含有62000和36000的亚基.抑菌试验结果表明,MCL-T对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis有较高的抑菌活性.对MCL-T中Trp残基、-S-S-、-SH以及Tyr残基进行化学修饰后,MCL-T对金黄色葡萄球菌的抑菌活性丧失;对其-S-S-进行化学修饰后,MCL-T对枯草芽孢杆菌的抑菌活性影响不大,而对其-SH、Trp残基和Tyr残基进行化学修饰后,MCL-T对枯草芽孢杆菌的抑菌活性丧失.研究表明,MCL-T 肽链上的氨基酸残基状态与其抑菌活性有关.     

菲律宾蛤仔凝集素抑菌机制的研究

通过分析菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum凝集素( MCL-T)对细菌的呼吸代谢及细菌中总DNA、总RNA和可溶性蛋白合成的影响,以及MCL-T与金黄色葡萄球菌膜蛋白( OMP)的相互作用及其核酸酶( RNase)活性,研究了MCL-T的抑菌机制。结果表明： MCL-T具有抑制金黄色葡萄球菌Staphylococcus au-reus和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis代谢过程中的磷酸戊糖途径( HMP); MCL-T与金黄色葡萄球菌或枯草芽孢杆菌共同培养时,随着MCL-T质量浓度的增加,金黄色葡萄球菌或枯草芽孢杆菌中的总 DNA、总RNA和可溶性蛋白含量均呈下降趋势;固相吸附测试表明, MCL-T可与金黄色葡萄球菌膜蛋白结合,两者的结合具有浓度依赖关系,该结合位点受N-乙酰-D-半乳糖酰胺( N-acetyl-D-galactosamine, GalNAc)及猪胃黏蛋白(Mucin from porcine stomach, PSM)的抑制, MCL-T具有RNase活性。研究表明, MCL-T通过抑制细菌的呼吸代谢及细菌中总DNA、总RNA和可溶性蛋白来发挥抑菌作用,同时其抑菌活性还与凝集素的OMP结合结构域和RNase活性结构域相关。     

菲律宾蛤仔PPAR基因家族特征分析及干露胁迫下表达变化

为研究干露胁迫下菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum脂质代谢相关基因PPAR所发挥的作用,对菲律宾蛤仔PPAR基因家族(PPARα、PPARβ、PPARγ)进行了鉴定及组织表达分析,并考察了低温(5℃)、常温(20℃)干露胁迫对菲律宾蛤仔PPAR基因表达变化的影响。结果表明:PPARα、PPARβ和PPARγ的开放阅读框长度分别为912 bp、1644 bp和2124 bp,分别编码了239、547、707个氨基酸;系统进化树显示,菲律宾蛤仔PPARα和PPARγ与虾夷扇贝Patinopecten yessoensis亲缘关系较近,PPARβ与福寿螺Pomacea canalicalata亲缘关系较近;荧光定量分析显示,菲律宾蛤仔脂质代谢相关基因PPARα/β/γ均可不同程度地响应干露胁迫;整体来看,干露胁迫会抑制PPARα及PPARγ表达,并且低温(5℃)干露会显著抑制二者表达(P0.05),但会诱导PPARβ表达,并且20℃干露胁迫对菲律宾蛤仔机体内部脂质代谢平衡的影响显著高于5℃(P0.05)。研究表明,干露胁迫下,菲律宾蛤仔PPAR基因家族参与调控脂肪酸氧化,以维持保蛤仔体内能量平衡,并且低温可减少干露胁迫下菲律宾蛤仔机体的能量消耗,有助于菲律宾蛤仔适应干露环境。     

菲律宾蛤仔牛磺酸转运体蛋白基因鉴定、表达及低盐胁迫响应

牛磺酸转运体在动物牛磺酸代谢过程中发挥着重要作用，对基于基因组获取的菲律宾蛤仔牛磺酸转运体蛋白基因(RpTauT)进行鉴定、结构和组织表达分析，并对低盐胁迫过程中3种壳色蛤仔软体组织牛磺酸含量和水管组织RpTauT基因表达特征进行分析。鉴定出6条RpTauT基因(命名为RpTauT1～RpTauT6),结构分析表明，其推测蛋白具有保守的12个跨膜结构域和钠离子结合位点；系统进化分析表明，蛤仔RpTauT与其他双壳贝类的遗传距离较近；组织表达分析表明，蛤仔RpTauT在外套膜组织和水管组织中表达量高，在性腺和唇瓣组织中表达量低。橙蛤软体部低盐胁迫24 h牛磺酸含量显著升高(P<0.05);3种壳色蛤仔的RpTauT表达量均表现出先升高后降低的趋势，提示3种壳色蛤仔RpTauT基因表达量在低盐胁迫过程中表现出的差异性与不同壳色菲律宾蛤仔抗逆性差异有关。     

雌二醇刺激对菲律宾蛤仔Dmrt基因表达的影响

为研究菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum不同发育时期及雌二醇刺激下Dmrt基因组织表达的变化状况,在菲律宾蛤仔基因组数据中(未发表),运用BLASTe比对确定了菲律宾蛤仔的3个Dmrt基因,运用MEGA、expasy、SMART等软件进行基因结构和进化分析,根据系统发生树的聚类对3个Dmrt基因进行命名,分别为Dmrt3-like、Dmrt4-like-1、Dmrt4-like-2,并采用实时荧光定量PCR方法对Dmrt基因在菲律宾蛤仔中的时空表达及其对雌二醇处理的响应进行了研究。结果表明:菲律宾蛤仔Dmrt 3个基因的表达量从担轮幼虫到壳顶幼虫时期呈迅速增长趋势,其中Dmrt4-like-2在菲律宾蛤仔的不同发育时期均有表达;在未进行雌二醇激素处理的正常菲律宾蛤仔体内,Dmrt4-like-1和Dmrt4-like-2在鳃和外套膜中表达量最高,Dmrt3-like在鳃和内脏团中表达量较高,在外套膜和水管中不表达;短时期内(72 h)雌二醇浸泡处理使得这3个基因在菲律宾蛤仔性腺中的表达量均发生上调;长时期(60 d)雌二醇浸泡处理后,空白组的雄性性腺中3个基因的表达量皆高于雌性性腺,试验组雌雄同体性腺中的Dmrt4-like-1和Dmrt4-like-2表达量略高于雌性中的表达量(P0.05),但显著低于雄性中的表达量(P0.05)。研究表明,菲律宾蛤仔Dmrt基因家族参与性别分化、性腺发育过程。     

菲律宾蛤仔RP2基因的克隆及组织表达分析

采用反转录PCR(RT-PCR)与c DNA末端快速克隆(RACE)法首次从壳长为28 mm的菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum外套膜中克隆出RP2基因(Gen Bank登录号:KF826881)。结果表明:RP2基因c DNA序列长度为1158 bp,包括62 bp的5'端非编码区,41 bp的3'端非编码区,开放阅读框1053 bp,编码350个氨基酸;推导的氨基酸序列具有TBCC(57aa~175aa)和CARP(65aa~102aa)保守结构域,并为非跨膜糖蛋白;经Blast同源性比较表明,菲律宾蛤仔RP2氨基酸序列与太平洋牡蛎Crassostrea gigas的相似性较高(56%),与高等哺乳动物、鸟类、鱼类、两栖类和节肢动物各模式动物之间的相似性为43%~53%,与非洲眼线虫Loa loa的相似性较低(33%);利用实时定量PCR技术检测RP2基因在菲律宾蛤仔不同组织中的表达,结果显示,RP2基因在菲律宾蛤仔雄性性腺中表达量最高,在鳃、水管和外套膜组织中次之,在斧足和闭壳肌中表达量极少,在雌性性腺中无表达。研究表明,RP2基因在菲律宾蛤仔各组织中的表达较为广泛,但不同组织的表达量存在明显差异,本研究结果可为无脊椎动物RP2基因的结构及其功能研究提供基础数据。     

基于Label free定量蛋白质组学技术对马铃薯晚疫病菌氮饥饿条件下分泌蛋白组初步分析

【目的】探讨氮源是否影响马铃薯晚疫病菌分泌蛋白的致病性。【方法】应用蛋白质组学Label-free技术,对受氮饥饿处理24 h和未处理的马铃薯晚疫病菌分泌蛋白进行鉴定,并对其鉴定蛋白进行生物信息学分析。【结果】共发现61个蛋白质的表达量存在显著差异,其中41个蛋白质表达量上调,20个蛋白质表达量下调。经生物信息学分析表明它们95%定位于细胞核、细胞质、线粒体和分泌型,主要参与碳代谢、氨基酸的生物合成和核糖体代谢,参与的生物过程主要是细胞过程、代谢过程和细胞成分组织或生物起源。【结论】氮源提高致病性蛋白的分泌,影响马铃薯晚疫病菌的致病性。     

菲律宾蛤仔硒依赖性谷胱甘肽过氧化物酶基因克隆、表达及其对脂多糖和肽聚糖的刺激响应

为探究菲律宾蛤仔Ruditapesphilippinarum硒依赖性谷胱甘肽过氧化物酶(Se-GPx)基因的序列特征、组织表达模式及其在不同壳色蛤仔免疫应答中的作用,利用RACE方法获得分析菲律宾蛤仔两个Se-GPx基因(Se-GPx-a和Se-GPx-b)全长序列,采用RT-qRCR方法分析基因表达规律.结果表明:RpSe- GPx-a和RpSe-GPx-b基因开放阅读框(ORF)长度分别为582 bp和633 bp,分别编码193和210个氨基酸,在3'非翻译区(UTR)均含有保守硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)元件;氨基酸序列分析发现,RpSe-GPx-a和RpSe-GPx-b序列中含有与酶结构和功能至关重要的特征,包括终止密码子UGA编码的硒代半胱氨酸,GPx标签序列(GKVVLVENVASLUGTT)和活性位点序列(WNFEKF)均高度保守;系统进化分析发现,RpSe-GPx与其他软体动物物种具有较近的亲缘关系;组织表达分析发现,RpSe-GPx在肝胰腺中表达量最高(P<0.05),在外套膜、鳃组织中表达量次之,在闭壳肌中表达量最低(P<0.05);用脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)分别注射3种壳色蛤仔(白蛤、白斑马、橙蛤),LPS刺激后,白蛤Se-GPx-a和Se-GPx-b基因表达量分别在12、6 h时达到最大值(P<0.05),白斑马蛤Se-GPx-a和Se-GPx-b基因表达量分别在48、6 h时达到最大值(P<0.05),橙蛤Se-GPx-a和Se-GPx-b基因表达量分别在3、24 h时达到最大值(P<0.05);PGN刺激后,白蛤、白斑马蛤和橙蛤Se-GPx-a和Se-GPx-b基因表达量分别在24、24、48 h时达到最大值(P<0.05).研究表明,3种壳色蛤仔黑色素形成过程的差异可能是导致其GPx基因对LPS和PGN刺激表现出不同响应的重要原因之一.     

基于iTRAQ技术的采后乙烯利和1-甲基环丙烯处理对茭白线粒体蛋白质表达谱的影响

利用同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)标记结合二维液相色谱-串联质谱(2D-LC-MS/MS)技术,探索乙烯利(ETH)和1-甲基环丙烯(1-MCP)处理对茭白采后贮藏期间线粒体蛋白质表达谱的影响。共鉴定到1 908个特征肽段≥2的可信蛋白质,与贮藏0 d相比,对照、ETH和1-MCP处理的茭白贮藏3 d和6 d共有315个蛋白质具有2. 0倍以上显著差异(P0. 05)。基因本体(GO)分子功能分析和KEGG通路分析结果显示,茭白采后贮藏3d,代谢途径、次生代谢产物生物合成、氨基酸生物合成、抗菌物质生物合成、碳代谢、光合作用中的碳固定、2-酮酸代谢、精氨酸生物合成、α-亚麻酸代谢、二羧酸代谢相关蛋白质显著富集;贮藏6 d,光合作用中的碳固定、α-亚麻酸代谢和二羧酸代谢途径减弱,丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸降解和磷酸戊糖途径相关蛋白质显著富集。ETH处理后贮藏3 d,氧化磷酸化以及甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢相关蛋白质显著富集;贮藏6 d,丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、磷酸戊糖途径以及苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸生物合成代谢途径相关蛋白质显著富集。1-MCP处理后贮藏3 d,三羧酸循环、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸降解途径相关蛋白质显著富集;贮藏6 d,磷酸戊糖途径、C5支链二元酸代谢、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸降解、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢途径相关蛋白质显著富集。以上结果表明,代谢途径、次生代谢产物生物合成、氨基酸生物合成、抗菌物质生物合成、碳代谢、光合作用中的碳固定、2-酮酸代谢、精氨酸生物合成、α-亚麻酸代谢和二羧酸代谢途径等可能与茭白采后衰老有关,三羧酸循环、氧化磷酸化、磷酸戊糖途径、C5支链酸代谢及相关氨基酸代谢途径可能在茭白采后衰老中发挥重要作用。     

希瓦氏菌的研究进展

希瓦氏菌(Shewanella)隶属于弧菌科(Vibrionaceae),于1985年被正式命名。希瓦氏菌在自然界中分布广泛,目前已发现的菌种数达50多种。该属中的一些成员,如奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)在环境的生物修复及微生物燃料电池等方面存在较高的利用价值。但是,一些希瓦氏菌也是人类和水产动物的潜在病原,包括腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefacens)、海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)和Shewanella xiamenensis等,目前该属中致病菌的数量还不明确。早期研究表明人类感染希瓦氏菌的主要途径是海水接触,而希瓦氏菌的感染宿主也主要为海水鱼;但是越来越多的人类无海水接触史的致病病例及淡水鱼类感染病例的出现,推测希瓦氏菌的宿主及传播途径可能具有多样性。