柑橘体细胞胚发生基因CsHB1特异肽段多克隆抗体的制备及其蛋白动态检测

【目的】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达系统,制备多克隆抗体,并检测抗体在‘伏令夏橙’胚性愈伤体胚诱导阶段中的特异性,为研究CsHB1基因在柑橘体细胞胚发生过程中的功能奠定基础。【方法】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N,转化大肠杆菌诱导目的融合蛋白的表达,并制备获得多克隆抗体anti-CsHB1-N。通过Western blot检测抗体在原核表达系统和柑橘体细胞胚诱导阶段的特异性,并分析体细胞胚诱导阶段CsHB1蛋白水平表达的动态变化。【结果】重组原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N在Escherichia coli中高效表达出了分子质量约为49 ku的GST-CsHB1-N融合蛋白,并纯化获得多克隆抗体anti-CsHB1-N;经过Western blot分析表明,多克隆抗体可与‘伏令夏橙’愈伤体胚诱导阶段表达的目的蛋白特异结合;蛋白表达结果分析表明,在胚性愈伤组织中CsHB1蛋白呈现高的表达量,随着诱导培养的进行,呈现了先下降后上升的波动变化。【结论】多克隆抗体特异性好,可与‘伏令夏橙’胚性愈伤组织中目的蛋白特异性结合,可用于CsHB1基因功能分析。     

新疆红肉苹果PGIP基因的克隆及原核表达

【目的】研究克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f.neidzwetzkyana(Dieck)Langenf]PGIP基因并进行原核表达,探讨其抗病机制。【方法】根据Genbank中已经发表的‘金冠’苹果PGIP保守区域设计1对特异引物,以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段连接到原核表达载体pET30a(+)中,构建融合表达质粒,转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达。【结果】序列分析表明,新疆红肉苹果PGIP基因cDNA编码区全长993 bp,编码330个氨基酸残基,命名为MsPgip,GenBank登录号为JQ001783。MsPgip分子质量为36.6 kD,等电点为7.05,有6个潜在的N-糖基化位点,信号肽为N端24个氨基酸残基。该蛋白质还具有2个连续的24个氨基酸残基大小的LRR基序(LSQLKNLTFLDLSFNNLTGAIPSSLSQ LPNLNALHLDRN-KLTGHIPIS)。与已克隆的‘澳洲青苹’、‘金冠’、‘富士’苹果PGIP氨基酸序列同源性均高达99%。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达蛋白的分子质量与预期一致。【结论】克隆了新疆红肉苹果PGIP基因,并可在大肠杆菌中表达。     

‘秋姬李’PsMYB18基因克隆与功能分析

【目的】克隆在采后‘秋姬李’果皮积累花色苷过程中高表达的MYB抑制因子PsMYB18基因,研究其序列特征、表达特点与功能。【方法】以‘秋姬李’为试材,采用qRT-PCR分析不同温度和光照处理条件下‘秋姬李’果皮中PsMYB18基因的转录水平,采用RT-PCR克隆PsMYB18基因,并通过烟草叶片瞬时表达试验分析PsMYB18的功能。【结果】q RT-PCR分析表明20℃和光照处理可促进‘秋姬李’果皮PsMYB18基因表达。PsMYB18基因的开放阅读框(ORF)为702 bp,编码233个氨基酸的蛋白。进化树分析表明PsMYB18与其他植物的花色苷合成抑制因子亲缘关系较近。序列比对结果表明其具有保守的R2R3结构域和抑制基序C1和C2。烟草瞬时表达试验表明,PsMYB18可抑制正调控因子PsMYB10.1和PsbHLH3的花色苷合成诱导功能。【结论】‘秋姬李’PsMYB18为花色苷合成抑制因子。     

柑橘冷诱导基因及其启动子表达载体构建与瞬时表达分析

【目的】以YFP为报告基因,构建柑橘冷诱导基因及其启动子的植物表达载体。【方法】克隆获得枳冷诱导基因Ptcor8及其启动子p Ptcor8,柠檬中同源基因Clcor8及其启动子p Clcor8;双酶切含启动子的克隆载体和植物表达原始载体p1D4,连接获得含启动子的中间载体;再双酶切含冷诱导基因的克隆载体和中间载体,连接后获得重组质粒;通过冻融法将重组质粒导入农杆菌EHA105中。【结果】构建了p1D4/p Ptcor8-Ptcor8::YFP,p1D4/p Ptcor8-Clcor8::YFP和p1D4/p Clcor8-Ptcor8::YFP 3个融合表达载体,瞬时表达发现3个融合基因均可在冰糖橙叶片中表达。【结论】3个融合表达载体的成功构建为下一步转化柠檬,分析枳冷诱导基因Ptcor8及其启动子p Ptcor8的功能奠定了基础。     

‘黄冠’梨类甜蛋白编码基因PbPR5的克隆及其表达特性分析

【目的】分离和克隆类甜蛋白基因Pb PR5,了解其在‘黄冠’梨不同组织、不同发育阶段以及受到非生物胁迫和植物生长调节剂处理时的表达情况。【方法】以‘黄冠’梨(Pyrus bretschneideri‘Huangguan’)组培苗为试验材料,从水杨酸(salicylic acid,SA)处理的c DNA文库中克隆获得该基因全编码区序列,命名为Pb PR5,对其进行生物信息学分析,并研究该基因在盐、聚乙二醇(EG6000)、SA和乙烯(ETH)处理后的表达情况;以12 a生‘黄冠’梨的叶片和果实为材料,探究该基因在叶片和果实不同发育阶段的表达模式。【结果】Pb PR5的c DNA序列长度为741 bp,编码224个氨基酸残基;该基因的基因组DNA序列长度为813 bp,包含1个内含子。生物信息学分析表明,Pb PR5蛋白与其他植物PR5基因编码的氨基酸序列相似性较高。实时荧光定量PCR分析表明:Pb PR5基因在‘黄冠’梨组培苗的根,茎,叶中均能表达,其中根部的表达量高于茎和叶;盐和干旱胁迫诱导了该基因表达,根和茎中的表达高峰均出现在处理后6 h,叶在盐胁迫后24 h和干旱后12 h出现表达高峰;SA和乙烯也诱导了该基因在叶片中的表达。在不同发育阶段的叶片中,老叶表达量最高,成熟叶次之,幼叶中不表达;在不同发育阶段的果实中,成熟果实中表达量最高,幼果期和膨大期果实表达量较低。【结论】Pb PR5基因在‘黄冠’梨各组织中非组成型表达,并且在‘黄冠’梨抵御生物和非生物胁迫过程中可能具有重要的生物学功能。     

华东葡萄泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的抗白粉病特性分析

【目的】分析华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’的Ring型泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的转基因植株对葡萄白粉病的抗性,研究这2个基因的抗白粉病特性,为改良欧洲葡萄抗病性提供可用基因。【方法】利用同源克隆的方法获得中国野生华东葡萄‘白河-35-1’泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的编码区序列(CDS);通过实时荧光定量PCR方法检测其在白粉菌诱导和水杨酸处理后的葡萄叶片中的表达;使用聚乙二醇(PEG)介导法转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位;通过农杆菌介导法获得转基因‘无核白’和‘红地球’植株;经过苯胺蓝染色,利用血球计数板计数分析白粉菌在转基因植株叶片上的生长情况,鉴定转基因株系的抗病性。【结果】中国野生华东葡萄‘白河-35-1’泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3响应白粉菌和水杨酸处理,表达模式明显区别于感病对照‘赤霞珠’。中国野生华东葡萄‘白河-35-1’VpUIRP2蛋白定位在细胞质,VpUIRP3蛋白定位无特异性。通过农杆菌介导的遗传转化获得4个VpUIRP2的转基因‘红地球’株系和1个‘无核白’株系,转基因株系对白粉病表现出抗性。【结论】中国野生华东葡萄‘白河-35-1’泛素连接酶基因VpUIRP2能增强葡萄对白粉病的抗性,可以作为抗病基因用于改良欧洲葡萄的抗病性。     

中国野生葡萄病原菌诱导响应VqSAP基因的克隆及表达分析

【目的】为了验证SAP基因在葡萄抗病防御机制中的作用,【方法】在前期通过抑制消减杂交技术(SSH)获得中国野生葡萄毛葡萄株系‘商-24’衰老相关蛋白(SAP)基因EST序列的基础上,采用RT-PCR从毛葡萄‘商-24’中分离到SAP基因cDNA序列,并通过实时定量PCR和半定量PCR分析了SAP基因的表达特异性。【结果】序列分析表明该基因具有完整的的开放阅读框,序列长度为819 bp,编码272个氨基酸残基,相对分子质量为30.56 ku,等电点为8.78,将其命名为VqSAP。多重比较结果显示VqSAP基因与油棕、玉米、萱草、拟南芥、水稻等植物SAP基因的同源性为65%~74%。实时定量结果表明,在白粉菌诱导初期,抗病的毛葡萄株系‘商-24’和感病的华东葡萄株系‘湖南-1’VqSAP基因表达量均升高,这可能是因为它参与了病原菌诱导的细胞程序性死亡过程。水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯(Eth)处理表明衰老相关蛋白基因表达受激素分子调节,但在抗病和感病株系中基因的表达量有所差异。在嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须等不同葡萄组织中的表达表明VqSAP基因的表达具有空间差异性。【结论】这些结果暗示着VqSAP的表达响应病原菌侵染并受生物胁迫相关激素的调控,很有可能在葡萄防御病原菌侵染的机制中发挥重要作用。     

圆叶葡萄‘Noble’的芪合成酶STS启动子的功能分析

【目的】分析圆叶葡萄‘Noble’的芪合成酶(stilbene synthetase,STS)基因上游调控序列的顺式作用元件及其功能,为研究白藜芦醇在葡萄抗病机制中的作用提供理论基础。【方法】在前期通过染色体步移法分离得到圆叶葡萄‘Noble’芪合成酶Mr STS基因上游调控序列的基础上,利用Plant CARE在线启动子预测工具对其顺式作用元件进行初步预测,构建该启动子5’端侧翼序列缺失表达载体,启动报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达,并通过农杆菌介导法真空瞬时转化离体葡萄叶片,研究激素和霜霉菌诱导条件下GFP蛋白的活性差异。【结果】PlantCARE在线预测结果表明,Mr STS基因上游调控序列含有启动子的特定结构,如TATA-box、CAAT-box,另外也含有一些与逆境相关的顺式作用元件,如ABA响应元件ABRE、Me JA响应元件CGTCA-motif、赤霉素响应元件P-box、激发子响应元件Box-W1和胁迫响应元件TC-rich repeats等;不同诱导条件下,5’端侧翼序列缺失表达载体启动GFP蛋白的活性存在显著差异。【结论】Mr STS基因上游调控序列含有启动子核心区域和与逆境相关的顺式作用元件,并受ABA、Me JA和霜霉菌的诱导。     

‘库尔勒香梨’kfpNAC基因的克隆和表达分析

【目的】筛选‘库尔勒香梨’萼片脱落与宿存相关基因,研究其在脱萼组和宿萼组样品中的表达情况。【方法】以‘库尔勒香梨’脱萼和宿萼花器官转录组测序数据为基础,从Unigenes中选出一条转录组和数字表达谱测序结果共有的与萼片脱落相关的具有NAC结构域的差异基因,命名为kfpNAC,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR分析其在花期不同阶段不同器官中的表达量。【结果】kfpNAC的序列长度是1 612 bp,包含一个编码308个氨基酸的长度为927 bp的开放阅读框(ORF),一个294 bp的5’端非编码区和一个391 bp的3’端非编码区,并且在3’端非编码区有一个poly A结构。‘库尔勒香梨’kfpNAC核酸和氨基酸序列与其他植物的NAC基因具有高度的同源性。实时荧光定量结果显示其在盛花期脱萼组全花样品中的表达量显著高于宿萼组全花和子房,并且在盛花期子房中的表达量显著高于萼片。【结论】克隆和鉴定了一个新的‘库尔勒香梨’kfpNAC基因,属于NAC基因家族的NAM亚群,该基因与‘库尔勒香梨’萼片脱落密切相关。