大白菜BrTCP24基因的克隆与功能分析

近年来,由于家庭结构的变化,市场对小株型大白菜的需求日益迫切.开展负调控叶球大小发育相关基因的克隆与功能研究有助于加快小株型大白菜品种的选育进程.本研究利用RT-PCR方法从大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)自交系福山包头叶片中分离了一个TCP第二亚族成员基因,命名为BrTCP24.BrTCP24基因编码区内无内含子,开放阅读框(ORF)全长1 221 bp,预测编码406个氨基酸.利用MEGA4.0软件将BrTCP24与拟南芥(Arabidopsis thaliana)TCP家族基因进行进化分析发现,BrT-CP24与AtTCP3同属于一个分支,在进化上具有较近的亲缘关系.用DNAMAN软件对BrTCP24和AtTCP3蛋白进行多序列联配分析发现,二者的氨基酸一致性可达到55.17％,在保守的TCP结构域其一致性可高达91.53％.这种进化上的亲缘关系和序列上的保守性,暗示二者可能具有类似的生物学功能.通过半定量RT-PCR分析发现,BrTCP24基因在大白菜的根、茎、莲座叶、包叶、盛开的花、受精后10 d的果夹和花蕾中均有表达,其中莲座叶中表达量最高,根、包叶、盛开的花、受精后10d的果夹和花蕾中的表达量次之,短缩茎中表达量最低;另外,在5 μmol NAA处理的12h内BrTCP24的表达水平未发生明显变化.为进一步研究BrTCP24基因的功能,我们构建了转化拟南芥的正义表达载体(35S::BrTCP24),并转入拟南芥中.通过卡那霉素筛选以及基因组DNA PCR鉴定,共得到17株转基因拟南芥植株.通过对其中5株的RT-PCR分析发现,它们都能够转录表达BrTCP24基因.利用荧光实时定量PCR方法对部分转基因植株的插入拷贝数进行检测发现,BrTCP24基因以单拷贝形式插入拟南芥基因组.进一步研究发现,与野生型拟南芥相比,过量表达BrTCP24基因可导致转基因拟南芥的下胚轴和叶器官明显减小.此外,过量表达BrTCP24基因抑制了与器官大小相关基因ANT、AtEXP10、AtGRF5、AtGIF1和CycD3;1的表达.这些结果表明,大白菜BrTCP24基因可能通过抑制细胞的生长参与调节植物器官大小的发育.     

葡萄NAC转录因子家族生物信息学分析

NAC基因家族是植物所特有的一类重要转录因子,广泛参与植物生长、发育以及器官建成、逆境胁迫应答等反应。目前,基因组信息的挖掘和分析已经成为葡萄功能基因组学研究的重要组成部分。本文利用生物信息学方法对葡萄143条NAC蛋白序列的系统发生和NAC基因组定位进行分析,然后对其氨基酸组成成分、理化性质以及二级和三级结构进行预测和分析,同时还分析了葡萄与拟南芥的NAC基因家族之间的联系。结果显示这143条蛋白序列与拟南芥94个NAC基因蛋白序列一起分成了16个亚族,说明拟南芥与葡萄NAC基因间具有较高的保守性。基因组定位结果发现143条NAC基因分布在17条染色体上。研究还发现不同亚家族间氨基酸数目、氨基酸序列间的疏水性存在一定的差异;而它们的二级结构都主要以随机卷曲为组成部分,且143条氨基酸序列三维结构十分相似。本文试验结果将为葡萄NAC基因家族的进一步功能分析提供重要研究基础。     

白菜WRKY转录因子cDNA全长的克隆及分析

参照拟南芥WRKY转录因子基因保守序列设计引物，利用RT-PCR及RACE技术克隆了白菜WRKY转录因子基因cDNA全长，命名为BcWRKY1 (GenBank登录号为AY836002)。序列分析发现，白菜BcWRKY1基因核苷酸序列长980bp，推导的氨基酸序列编码285个氨基酸残基，与拟南芥AtWRKY18 氨基酸序列的同源性为74%，与拟南芥AtWRKY60同源性为59%；与其它植物WRKY基因的同源性则较低。Southern杂交显示该基因在白菜基因组中为单拷贝。半定量RT-PCR分析表明，用2mmol/L的水杨酸处理后2h~8h，以及用霜霉病菌接种后6h~12h，白菜BcWRKY1基因的表达量最高。     

普通白菜PGIP基因BcPGIP分子特征研究

根据甘蓝型油菜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因PGIP3的全长序列设计引物,从普通白菜核隐性不育两用系‘Bajh97-01A/B'可育株中成功克隆了多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因BcPGIP,对其DNA和cDNA全长序列进行分析,结果表明,该基因包含2个外显子和1个内含子,最大开放阅读框为996bp,编码331个氨基酸,共有10个LRR(Leucine-rich repeat,高氨酸富集)重复序列。将BcPGIP与其他植物的49个PGIPs蛋白进行同源序列比对后,发现PGIP蛋白特征序列非常保守。由重建的进化树可知,该基因与十字花科芸薹属的甘蓝型油菜的同源性最高。通过实时荧光定量PCR分析发现,BcPGIP基因可能与花粉的发育相关。     

茶树海藻糖-6-磷酸合成酶基因(CsTPS)的克隆及表达分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶.目前,TPS基因的研究多数集中于细菌和真菌等,而对植物的研究较少.本实验通过对茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)全器官转录组文库序列比对,获得一条与其他物种同源性较高的编码TPS基因的EST序列,通过RACE扩增后获得茶树TPS基因cDNA全长序列,命名为Cs TPS(GenBank登录号JQ742017).该基因cDNA全长3 125 bp,包含一个2799 bp的开放阅读框,编码932个氨基酸.多序列比对分析结果表明,Cs TPS基因编码的蛋白具有明显的TPS和TPP两个结构域.系统进化分析表明,其编码的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)和番茄(Solanum lycopersicum)等植物的TPS同源性较高,且CsTPS与拟南芥TPS1(AtTPS1)的同源性高于TPS2(AtTPS2)和TPS3(AtTPS3).qPCR分析显示,CsTPS基因在茶树不同组织器官中呈现差异性表达.低温诱导促使老叶和嫩叶中的CsTPS基因上调程度明显大于根系,表明CsTPS基因可能参与了茶树抗寒机制.     

不结球白菜BrABF1基因的克隆与功能分析

为研究BrABF1基因在不结球白菜中的表达模式并探索其在开花调控中的作用,本研究以不结球白菜苏州青品种为试验材料,通过同源克隆获得BrABF1基因序列,对其氨基酸序列进行比对和进化分析,利用亚细胞定位技术研究BrABF1的空间表达,采用β-D-葡糖醛酸酶(GUS)染色方法研究BrABF1在植物中的表达模式,利用PlantCARE在线软件预测BrABF1基因的启动子的顺式作用元件。构建植物表达载体pEarlyGate101-BrABF1-YFP转化拟南芥,统计野生型和转基因拟南芥植株的开花时间。结果表明,BrABF1基因含有1 104 bp开放阅读框(ORF),编码367个氨基酸。BrABF1与甘蓝型油菜和野甘蓝(原变种)同源性最高,进化关系最近。BrABF1定位在细胞核上。BrABF1启动子驱动的GUS蛋白主要在拟南芥的叶脉中特异性表达。BrABF1启动子序列包含大量的顺式作用元件,如光响应元件、植物激素响应元件、低温响应元件和逆境胁迫响应元件等。转基因拟南芥植株开花时间晚于野生型,表明BrABF1基因能抑制植物的开花。本研究结果为提高不结球白菜商品价值提供了理论基础。     

巴西橡胶树HbNAC33基因的克隆和表达分析

植物特有的NAC转录因子在植物的生长发育、胁迫应答和激素调节等方面具有重要功能。本研究从橡胶树胶乳cDNA中克隆了HbNAC33基因,生物信息学分析显示该基因的完整开放阅读框（ORF）为1 092 bp,编码363个氨基酸。HbNAC33蛋白的N-端第3～156位氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域,酵母试验表明,HbNAC33具有转录激活活性,转录激活区在C-端,具备了NAC转录因子的基本特征。序列比对和系统进化分析表明HbNAC33蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC011亚族。实时荧光定量PCR分析表明,HbNAC33在叶中的表达量显著高于其他部位;割胶,乙烯利（ET）和茉莉酸（JA）处理均能诱导HbNAC33的表达上调。以上结果表明,HbNAC33可能参与植物的生长发育和胁迫应答过程。     

紫菜薹快速碱化因子基因BcMF14p的序列与表达分析

快速碱化因子是近年来新发现的一种植物多肽类信号分子。根据已知的普通白菜两用系中可育株系特异表达的快速碱化因子基因BcMF14序列,在其编码框两侧设计引物,从紫菜薹中克隆出该类信号分子基因,命名为BcMF14p(登陆号:EF523517),全长273 bp,不含内含子,编码框包含222个核苷酸,编码73个氨基酸。NCBI在线同源比对结果表明该基因属于快速碱化因子家族,与花椰菜、拟南芥等的快速碱化因子核苷酸序列相似性达到86%以上。对该信号分子的表达进行RT-PCR分析,结果显示BcMF14p只在紫菜薹花蕾、花、角果等生殖器管中表达,在茎、叶等营养器官中不表达,说明BcMF14p可能参与紫菜薹生殖发育过程中的信号传导。     

玉米NAC转录因子基因ZmNAM的克隆及表达分析

为探究候选基因ZmNAM的功能,本研究从甜玉米自交系1132及其变异系704中克隆得到该基因。生物信息学分析表明,ZmNAM的c DNA长度为1 548 bp,开放阅读框(ORF)为1 302 bp,编码一个由433个氨基酸残基组成的蛋白,蛋白具有亲水性,N-末端具有保守的NAC结构域,定位于细胞核中,具有9个糖基化位点和35个磷酸化位点;与自交系1132相比,变异系在非编码区与编码区中的C-末端转录激活功能域对应核苷酸序列中存在差异,可导致多个氨基酸发生变异。系统进化分析结果表明,玉米ZmNAM蛋白属于NAC转录因子家族中的VND亚族,与拟南芥中的At VND3亲缘关系最近;时空特异性表达分析表明,不同发育时期内ZmNAM在根中的表达量明显高于其他器官,说明ZmNAM基因可能在调控玉米根部的生长发育过程中发挥着重要作用。变异系704中ZmNAM在各个发育时期和发育器官中表达水平基本都明显高于自交系1132,其中在根中的表达水平差异最明显。本研究结果为深入研究ZmNAM基因在玉米生长发育过程中的作用提供了理论支持。     

芸薹属作物油酸脱饱和酶基因（FAD2）拷贝数和序列变异分析

利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)脂肪酸合成途径中的油酸脱饱和酶(FAD2)基因序列的保守区设计PCR引物，对芸薹属(Brassica)作物3个基本种和3个复合种进行了标记，并且克隆了白菜(B．rapa ssp．peldnensis)、甘蓝型油菜(B．napus)和埃塞俄比亚芥菜(B．carinata)三种作物的PCR产物，对FAD2基因部分序列进行了分析。研究结果表明，拟南芥和芸薹属作物基因组中具有1～2个拷贝的FAD2基因，所测定的芸薹属FAD2基因序列与拟南芥FAD2之间高度同源，它们所编码的氨基酸序列的同源性达88．7％～98．8％。这些序列与其它植物的FAD2对应位置的氨基酸序列同源性较低，从50．0％～86.0％。研究结果为探讨芸薹属作物之间的进化关系提供了一定的分子水平证据。     

葡萄SBP基因家族生物信息学分析

SBP（squamosa promoter binding protein,SBP）基因家族是植物所特有的一类重要转录因子,广泛参与植物生长、发育以及多种生理生化反应的信号传导。葡萄是继拟南芥、水稻和杨树之后完成全基因组测序的第四种开花植物,因此葡萄逐渐成为分子生物学研究的重点对象,进行葡萄基因组信息挖掘与分析对于葡萄功能基因组学的发展具有重要意义。本文利用生物信息学方法对葡萄家族45条SBP蛋白序列的系统发生和SBP基因组定位进行分析,然后对其氨基酸组成成分、理化性质以及二级和三级结构进行预测和分析,同时还分析了葡萄与拟南芥的SBP基因家族之间的联系。结果显示这45条蛋白序列与拟南芥16个SBP基因蛋白序列一起分成了3个亚族,说明拟南芥与葡萄SBP基因间具有较高的保守性;进一步的基因组定位结果发现其分布在14条染色体上,较拟南芥在染色体上的分布更为分散。研究还发现不同亚家族间氨基酸数目、氨基酸序列间的疏水性存在一定的差异;而二级结构预测结果发现,41条氨基酸序列以随机卷曲为主要组成部分,这与拟南芥相似,且45条氨基酸序列三维结构十分相似。本文实验结果均为葡萄SBP基因家族的进一步功能分析提供了重要研究基础。     

甘蓝型油菜沪油15中BnaRAV-2-HY15转录因子的克隆及表达分析

基于拟南芥RAV类转录因子的序列,通过电子克隆的方法获得甘蓝型油菜的BnaRAV-2基因序列,再利用RT-PCR方法从甘蓝型油菜沪油15中扩增出编码RAV类转录因子基因BnaRAV-2-HY15,并进行了序列和进化分析。结果显示,该转录因子基因长1119 bp,编码372个氨基酸,含有相对保守的AP2结合域和B3结构域,具有典型的植物RAV类转录因子的结构特征。BnaRAV-2-HY15 和AtRAV2具有相似的三维结构。采用半定量RT-PCR方法对基因表达水平进行分析,发现BnaRAV-2-HY15受到PEG、高盐和低温的诱导表达。BnaRAV-2-HY15基因在沪油15盛花和籽粒发育时期的根、茎、叶、花、蕾和荚中均检测不到明显的表达。     

毛叶苕子磷饥饿响应基因VvPHR1的克隆及功能研究

【目的】磷饥饿响应因子PHR (phosphate starvation response)在植物根系发育和磷养分吸收中起重要作用,本研究主要阐明毛叶苕子VvPHR1基因生物学功能,为培育磷高效型绿肥作物提供理论依据。【方法】通过转录组测序获得毛叶苕子VvPHR1基因序列。采用酵母单杂交方法验证VvPHR1基因的转录激活功能,构建其过表达载体,利用花粉管通道法分别遗传转化野生型和突变体(Atphr1)拟南芥,获得超量表达VvPHR1基因和突变体功能回补转基因材料。对正常磷(1 mmol/L Pi)和低磷(1μmol/L Pi)的培养基中生长30天的拟南芥取样,采用实时荧光定量PCR对野生型和转基因拟南芥中VvPHR1及下游磷转运基因的表达进行分析,并对转基因材料进行表型分析,测定其主根长、鲜重、总磷及无机磷(phosphate,Pi)含量。【结果】毛叶苕子转录组中有13个PHR基因,转录本129590、96227、120424与拟南芥的PHR1相似度最高,其中转录本120424在低磷诱导下表达量最高,将该转录本命名为VvPHR1基因。该基因cDNA全长1008 bp,编码335个氨基酸...     

黄瓜、西瓜、南瓜EIN3基因片段的克隆与序列分析

EIN3（Ethylene insensitive 3）是位于细胞核的核蛋白为乙烯信号转导的下游调控基因,根据GenBank所报道的植物EIN3基因mRNA的保守序列设计两个引物,以黄瓜、西瓜、南瓜总DNA为模板PCR扩增到3个725bp的基因片段，将片段序列在NCBI数据库中Blastn同源搜寻，显示151条有同源性的序列全部是EIN3基因，因此推断克隆的3个片段均为EIN3基因家族成员。NCBI网站的ORF Finder找到正确的开放式阅读框，翻译成为氨基酸序列，对CsEIN3、ClEIN3及CmEIN3氨基酸序列在NCBI网站进行Blastp比对, 在大分子结构数据库MMDB (Molecular Modelling Database) 搜索,3个推测蛋白保守结构域三级结构与拟南芥EIN3的DNA结合域(MMDB: 30598 PDB: 1WIJ )完全相同，系统进化分析表明，黄瓜、西瓜、南瓜与双子叶植物甜瓜、绿豆、蒺藜状苜蓿、烟草、番茄、拟南芥及单子叶水稻、桃红蝴蝶兰等的EIN3家族成员都有较高的相似性。     

诸葛菜OvCYP86MF基因的克隆及其特性分析

为进一步阐明细胞色素P450基因CYP86MF在诸葛菜发育中的分子机理,本文根据已知同源基因保守序列设计特异引物,利用RT-PCR和RACE技术从诸葛菜中获得一个细胞色素P450基因(OvCYP86MF)全长cDNA序列,该序列全长为1876bp,含有1605bp的完整开放阅读框,可编码534个氨基酸,分子量和等电点分别为61.4kDa和6.90,具有细胞色素P450蛋白的典型特征,即保守结构域FNAGPRLCIG;原核表达显示该基因的融合蛋白在体外可以诱导表达;DANSTAR和Clustal W软件分析表明该基因的全长cDNA序列及其编码氨基酸序列与十字花科物种拟南芥相似性很高,达到80%以上,亲缘关系最近;与CYP86C亚家族成员在氨基酸水平上的相似性均高于50%,因此推断该基因属于CYP86C这个亚家族。Northern杂交分析表明该基因在花蕾中特异表达。     

谷子脂转移蛋白cDNA的克隆及特性研究

摘要：首次报道了从谷子(Stetaria italica )未成熟种子cDNA文库中克隆到1个与其它物种脂转移蛋白（LTP）具有较高同源性的脂转移蛋白基因Siltp。将核苷酸序列和推断的氨基酸序列在GenBank中进行比较，发现Siltp与大麦脂转移蛋白LTP7a2b和LTPcw-19,玉米脂转移蛋白，欧洲油菜的脂转移蛋白基因的核苷酸序列的同源性分别为72%,70%,60%,54%；氨基酸序列的同源性分别为79%,73%，65%，57%。序列分析表明，编码区含363个碱基 ，编码121个氨基酸，其中包括26个氨基酸的信号肽序列，分子量为9.3 kD。基因组Southern杂交结果表明，Siltp在基因组中以单拷贝存在。Northern杂交研究Siltp的时空表达特异性，发现Siltp仅在茎、叶、穗中表达。利用软件PAUP对17种植物的LTP进行进化分析，从进化系统树可以看出LTP有4个分支，其中，小麦发生分化较早，其它几种单子叶植物如玉米、谷子、大麦和水稻分化较晚，说明发生了早期的基因复制事件。在整个系统图中，双子叶比较分散，说明LTP基因的进化是个复杂的过程；禾本科作物的脂转移蛋白基因是由一个原始基因分化而产生的不同分支，Siltp与大麦LTP亲缘关系最近。     

杉木紫色酸性磷酸酶基因ClPAP18b的克隆及表达分析

  【目的】  以速生丰产型杉木无性系洋023、洋036、洋6421和拟南芥为材料,研究杉木中紫色酸性磷酸酶 (PAPs) 的功能作用,以筛选具有磷素高效利用特性的杉木无性系。  【方法】  采用PCR技术克隆PAP18b基因,分析其序列特征和同源性,并对杉木无性系洋023、洋036、洋6421进行正常供磷 (1.0 mmol/L KH₂PO₄) 和低磷胁迫 (0.1 mmol/L KH₂PO₄,0.9 mmol/L KCl) 砂培盆栽处理0、10、15、30和60天,测定酸性磷酸酶活性及全磷含量,定量分析根和叶中ClPAP18b基因表达量、磷含量及酸性磷酸酶活性的关系,并将ClPAP18b基因过表达至拟南芥,进行该基因的功能验证。  【结果】  成功克隆获得杉木PAP18b基因CDS序列 (1 212 bp),命名为ClPAP18b,该基因编码404个氨基酸,亚细胞定位于胞间区,这表明ClPAP18b基因可能发挥调控酸性磷酸酶分泌至胞外的功能。酸性磷酸酶活性测定结果表明,30天磷处理后,正常供磷和低磷处理下,杉木洋036和洋6421无性系根中的酸性磷酸酶活性均高于叶,而根中酸性磷酸酶活性低磷处理下高于正常供磷处理;洋023的根和叶中酸性磷酸酶活性在低磷胁迫诱导下多高于正常供磷条件下根和叶中酸性磷酸酶活性。磷含量分析结果表明,杉木洋023、洋036和洋6421无性系的地上部磷含量高于地下部,不同水平供磷处理后,不同杉木无性系或同一杉木不同组织磷含量存在差异。RT-qPCR 结果显示,低磷胁迫诱导杉木ClPAP18b基因表达。低磷条件下,ClPAP18b过表达拟南芥植株长势优于对照组,且过表达植株中的酸性磷酸酶活性叶高于对照组,但花青素积累量低于对照组。此外,相比于正常供磷处理植株,过表达ClPAP18b拟南芥中PHT1; 2、PHT1; 8和AtPAP26等与磷胁迫相关的基因表达量显著高于对照组,而AtPAP12和AtPAP17基因表达量明显降低。  【结论】  低磷胁迫诱导杉木ClPAP18b基因表达和酸性磷酸酶活性增强,但不同杉木无性系对磷缺乏的适应性存在明显差异,过表达ClPAP18b基因可促进拟南芥植株耐低磷胁迫,ClPAP18b基因可能在杉木低磷胁迫调节机制中发挥调控作用,可作为改良杉木耐低磷的重要候选基因。