细菌毒素在病原物致病过程中的作用

植物病原细菌毒素是重要的植物病原毒素,其化学类别,包括胞外多糖、有机酸、肽、糖肽等。不少植物病原菌引起病害与病原菌产生的植物毒素有关,致病毒素是诱发植物病害的一类重要化合物,其主要伤害效果是:作用于质膜,所以原生质体肿胀,电解质渗漏;抑制光合作用的ATP磷酸化的合成,从而引起能量匮乏,导致体内合成的破坏,影响叶绿素的合成;结合原生质膜蛋白,从而导致宿主感染。由此,主要综述了两大类细菌毒素在病原物致病过程中的作用研究进展。     

植物致病真菌寄生类型与胞外糖基水解酶家族分析

植物致病真菌侵染寄主植株的过程中,会分泌特异的糖基水解酶至胞外,与寄主植物互作以完成其生活史。本研究利用已公布的基因组数据,注释并比较分析12种植物致病真菌胞外糖基水解酶（GH家族）与寄生类型之间的关系。结果表明,活体与非活体寄生真菌胞外GHs数量与亚家族分布有显著区别。其中参与细胞壁多糖降解的GHs在非活体寄生菌中显著扩增。进一步的系统发育分析显示GH3家族尤其在半活体寄生菌中扩增明显,这意味着植物致病真菌胞外GHs酶谱与病原菌寄生类型密切相关。据分析结果推测,GH53、GH61和GH3亚家族的扩增有助于病原菌非活体寄生;GHs的丰度与多样化可能更有助于致病菌半活体寄生。     

甘蓝黑腐病菌rPf基因簇对胞外蛋白酶Ⅰ基因表达的调控

甘蓝黑腐病黄单胞菌（ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＰｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）产生的胞外蛋白酶Ⅰ在致病的早期阶段起重要作用，该酶以及其它胞外酶和胞外多糖的合成受一致病因子调控基因簇（ｒＰｆ基因簇）的正向调控。本研究利用带有β－半乳糖苷酶报道基因（ｌａｃＺ）的转座子Ｔｎ５－Ｂ２０诱变蛋白酶Ⅰ基因克隆，获得了ｌａｃＺ在蛋白酶Ⅰ基因启动子控制下表达的Ｔｎ５－Ｂ２０插入突变质粒。通过将这种突变质粒导入野生型和各ｒｐｆ基因突变体菌株后，测定ｌａｃＺ基因在细胞生长周期中的表达水平，不仅进一步证实了这些ｒｐｆ基因对蛋白酶Ⅰ基因的正向调控作用，而且明确了它们的调控水平．发现ｒｐｆＡ、ｒｐｆＣ、ｒｐｆＥ、ｒｐｆＧ或ｒｐｆＨ突变后，蛋白酶Ⅰ基因的转录会降低９０％左右，而ｒｐｆＢ突变后，蛋白酶Ⅰ基因的转录只降低４８％。     

大肠杆菌转录后调控蛋白CsrA的C末端具有抑制十字花科黑腐病菌胞外蛋白酶活性的功能

CsrA（在有些细菌例如十字花科黑腐病菌中也称为RsmA,统称CsrA／RsmA）是一类在细菌中广泛分布而且氨基酸序列非常保守的RNA结合蛋白。研究表明,CsrA／RsmA作为转录后全局调控因子参与了包括细胞碳代谢、次生代谢、运动性、生物被膜形成以及动植物病原菌的致病过程等许多细胞过程的调控。CsrA／RsmA在不同的细菌中的生物学功能各有异同。在大肠杆菌中,CsrA的主要功能是控制细胞的碳代谢、运动性和生物被膜形成;而在十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestrispathovarcampe5tris,Xcc）中,CsrA的同源蛋白RsmA的主要功能除了控制碳代谢、运动性和生物被膜形成外,还控制致病性和胞外酶的产生。大肠杆菌的CsrA（CsrAEcoli）是否具有XccRsmA（RsmAXcc）的功能？为了回答这个问题,我们用大肠杆菌的csrA基因（csrAE.coli）互补Xcc的耶剃基因（rsmAXcc）的缺失突变体DM2506。结果显示,csrAE.coli能够互补DM2506的所有表型,说明csrA。瑚具有RsmAXcc的全部功能。更重要的是,我们发现,无论是瑚,叫枷突变体还是野生型菌株,导入表达CsrAE.coli扰的质粒后均导致其致胞外蛋白酶活性的严重下降,证明CsrAE.coli,以具有抑制Xcc胞外蛋白酶活性的作用。进一步的实验证实,CsrA E.coli的C末端第53～61位氨基酸残基具有抑制Xcc胞外蛋白酶活性的功能。     

野油菜黄单胞菌两个rpoN基因的突变和功能分析

细菌的σ54(R poN)是一类可选择性识别启动子序列的σ因子,主要参与环境适应、细胞生理过程等,如氮代谢、鞭毛和菌毛的生物合成。在一些病原菌中,σ54也与致病性密切有关。为了明确σ54在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(X cc)中是否参与致病过程,用同源单交换定点突变方法,将X cc 8004中的两个σ54编码基因rp oN 1(XC 1256)和rp oN 2(XC 2168)做单突变及双突变。突变体表型分析结果表明,单个和同时突变rp oN 1和rp oN 2基因均不影响野油菜黄单胞菌的正常生长,对胞外多糖(EPS)产生、胞外酶的合成也无明显影响。植株致病性检测结果表明,rp oN 1和rp oN 2基因的单突变或双突变体的致病力与野生型菌株没有显著差异,表明野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的致病过程不需要σ54因子参与。     

野油菜黄单胞菌一个假定蛋白激酶基因与多糖合成及致病力相关

已报道的野油菜黄单胞菌8004菌株基因组中,开放阅读框XC3631注释编码一个假定蛋白激酶。通过定点整合突变方法构建了XC3631基因的非极性突变体NK3631,表型分析发现NK3631合成脂多糖和胞外多糖的能力显著下降,致病力极显著减低,但产生胞外水解酶的能力不变。用带有全长XC3631基因序列的pLAFR3对NK3631进行功能互补,其脂多糖合成、胞外多糖产量和致病力均得到恢复。这一研究表明,XC3631基因与野油菜黄单胞菌脂多糖的核心多糖和胞外多糖的合成有关,并在致病中发挥重要作用。     

野油菜黄单胞菌XC1892基因与致病力关系的分析

野油菜黄单胞菌野油菜变种(简称Xcc)是十字花科作物黑腐病的病原菌。在前期工作中,从Xcc8004菌株获得1株编号为XC1892的基因的转座子Tn5gusA5突变体,其致病力降低。根据基因组注释,XC1892编码1个DsbE蛋白,参与细胞色素的合成。为评估XC1892的功能,采用自杀质粒pK18mob对XC1892进行诱变,获得非极性突变体1892nk。对突变体的表型分析发现,其致病力及胞外多糖产量分别是野生型的59%和55%。用一段包含XC1892基因的DNA片段对突变体1982nk进行功能互补,其致病力和胞外多糖产量基本得到恢复。这表明XC1892基因与Xcc的致病力和胞外多糖合成产量有关。     

多肽抗生素apidaecin和Shiva-I在烟草胞外液中的稳定性

本研究利用电泳分析法和活性分析法测定了多肽抗生素apidaecin和Shiva-I在烟草胞外液中的稳定性.apidaecin的活性半衰期为1.6h;Shiva-I的活性半衰期为8.0h.apidaecin的C-末端酰胺化后稳定性增加l倍,而酰胺化对Shiva-I的稳定性影响不大.利用MALDI-TOF质谱分析了两种多肽抗生素在烟草胞外液中的降解位点,apidaecin有两个蛋白酶降解位点,而Shiva-I有5个.利用蛋白酶抑制剂法测定了烟草胞外液中降解两种多肽抗生素的蛋白酶种类.apidaecin主要被丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶降解;5hiva-I可被丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、巯基蛋白酶和精氨酸蛋白酶降解.     

多肽抗生素apidaecin和Shiva—Ⅰ在烟草胞外液中的稳定性

本研究利用电泳分析法和活性分析法测定了多肽抗生素apidaecin和Shiva-Ⅰ在烟草胞外液中的稳定性。apidaecin的活性半衰期为1．6h;Shiva-Ⅰ的活性半衰期为8．0h.apidaecin的C－末端酰胺化后稳定性增加1倍，而酰胺化对Shiva-Ⅰ的稳定性影响不大。利用MALDI－TOF质谱分析了两种多肽抗生素在烟草胞外液中的降解位点，apidaecin有两个蛋白酶降解位点，而Shiva-Ⅰ有5个。利用蛋白酶抑制剂法测定了烟草胞外液中降解两种多肽抗生素的蛋白酶种类。apidaecin主要被丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶降解；Shiva-Ⅰ可被丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、巯基蛋白酶和精氨酸蛋白酶降解。     

胞外呼吸菌在污染物迁移与转化过程中的应用进展

胞外呼吸菌是在厌氧条件下氧化有机物产生电子,进而将电子传递至胞外电子受体并产生能量维持自身生长的一类微生物,在重金属和有机污染物迁移转化过程中发挥着重要作用,且菌群的协同作用效果较单一微生物更为显著。胞外呼吸菌在自然环境中广泛存在,主要集中在变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Acidobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),且多数为革兰氏阴性菌,其中希瓦氏菌(Shewanella oneidensisi MR-1)和地杆菌(Geobacter sulfurreducens)是研究较为深入的胞外呼吸模式菌。目前已知的5种胞外电子传递机制包括直接电子传递、电子穿梭体、应电运动、纳米导线和细胞间电子传递机制,各种机制非独立存在而是共同作用以促进污染物降解。文章从胞外呼吸菌的种类、胞内与胞外电子传递机制等方面进行综述,并着重论述了胞外呼吸菌在污染物迁移转化中的最新应用进展,为更好地发挥其环境效应提供参考。     

水稻白叶枯病菌rpfC基因DNA序列的测定分析

ｒｐｆＣ是甘蓝黑腐病菌中全局性调控胞外酶和胞外多糖合成以及致病性的一个基因簇中的一个基因。已从水稻白叶枯病菌中鉴定和克隆到一个在功能上能互补甘蓝黑腐病菌的ｒｐｆＣ突变体的基因，并通过构建突变体证实了这一基因在水稻白叶枯病菌致病性中起重要作用。本研究对水稻白叶枯病菌的这一基因的ＤＮＡ序列进行了测定分析，结果表明，它与甘蓝黑腐病菌的ｒｐｆＣ基因具有高度的同源性。因此，将水稻白叶枯病菌的这一基因也称为ｒｐｆＣ基因     

水稻白叶枯病黄单胞菌编码顺乌头酸酶的rpfA基因的鉴定

通过生化功能分析，证实了水稻白叶枯病黄单胞菌野生型菌株Ｔ３０００产生两种顺乌头酸酶（分别命名为ＸｏｏＡｃａｎＡ和ＸｏｏＡｃａｎＢ）。通过三亲本接合的方法，将获得的含水稻白叶枯病黄单胞菌ｒｐｆ基因簇的重组质粒ｐＧＸＮ３０００导入甘蓝黑腐病黄单胞菌ｒｐｆＡ基因突变体８４７６中。经生化功能分析证实，８４７６／ｐＧＸＮ３０００中含有水稻白叶枯病黄单胞菌的顺乌头酸酶ＸｏｏＡｃａｎＡ；同时还证实了ＰＧＸＮ３０００能互补８４７６，恢复其合成胞外酶和胞外多糖的能力及致病性．这表明在ＰＧＸＮ３０００中含有一个完整的水稻白叶枯病黄单胞菌的顺乌头酸酶基因，该基因具有类似甘蓝黑腐病黄单胞菌ｒｐｆＡ基因的功能．因此将该基因命名为水稻白叶枯病黄单胞菌ｒｐｆＡ基因。     

水稻白叶枯病黄单胞菌rpfF基因的定位及其在致病调控中的作用

检测到水稻白叶枯病菌能产生一种“跨菌调控因子”，在固体平板上，这种因子由白叶枯病菌分泌到细胞外后可以扩散并进入甘蓝黑腐病菌，调控甘蓝黑腐病菌致病因子的表达．本研究从水稻白叶枯病菌中克隆鉴定了一个与这种“跨菌”调控因子合成有关的基因ｒｐｆＦ，通过转座子诱变和标记置换（ｍａｒｋｅｒｅｘｃｈａｎｇｅ）技术，构建了ｒＰｆＦ突变体，突变体丧失了产生这种“跨菌”调控因子的能力，在水稻植株上的致病能力明显减弱，ＤＮＡ序列分析得知ｒｐｆＦ基因编码的产物和大肠杆菌的３－酮脂酰－ＣＯＡ硫解酶（３－ｋｅｔｏａｃｙｌ－ＣＯＡｔｈｉｏｌａｓｅ）同源。     

不同接种浓度对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种胞外多糖突变体致病性的影响

利用转座子 Tn5gus A5诱变和标记置换方法 ,构建了野油菜黄单胞菌野油菜致病变种( Xanthomonas campestris pv.campestris)系列标记置换突变体 ,其中 6个突变体的胞外多糖产量显著降低。致病试验结果表明 ,胞外多糖产量对 Xcc的致病性有明显的影响 ,不同接种浓度对 Xcc胞外多糖突变体致病性亦有明显影响。     

转座子报告基因Tn5gusA5诱变甘蓝黑腐病菌分离与致病相关的突变体

构建携带报告基因的转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５于广谱性ｃｏｓ质粒ｐＬＡＦＲ１上，利用Ｔｎ５ｇｕｓＡ５诱变野生型甘蓝黑腐病黄单胞菌，筛选与致病性有关的因子（胞外多糖，胞外酶）突变体，通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和报告基因ｇｕｓ表达验证，突变体是由转座子诱变所致。     

一个可用于鉴定野油菜黄单胞菌正向调控hrpX基因的报告质粒的构建

过敏性反应与致病性基因(hrp)所编码的Ⅲ型分泌系统(T3SS)是植物病原细菌的决定性致病因子。在黄单胞菌属中,HrpG是目前已知的hrp基因表达的最高层面的调节蛋白,至今尚未鉴定到野油菜黄单胞菌调控hrpG表达的基因。本研究利用hrpX启动子和蔗糖敏感型sacB基因构建了hrpX表达报告质粒。实验结果表明该报告质粒可用于筛选鉴定正向调控野油菜黄单胞菌hrpX表达的基因。该报告质粒的构建,为研究hrp基因表达调控机制,揭示植物病原细菌的致病机制提供了有效的材料。     

胞外多糖对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种气孔入侵能力的影响

利用 Tn5gus A5插入诱变和标记置换等分子遗传学方法 ,构建了野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 ( Xanthomonas campestris pv.campestris) 80 0 4菌株的系列突变体。其中有 6个突变体的胞外多糖产量显著降低。将它们喷雾接种寄主植物萝卜时 ,有 2个突变体仍具有一定的致病性 ,4个突变体无致病性。结合扫描电镜观察 ,我们认为胞外多糖产量影响着该病菌气孔入侵能力     

野油菜黄单胞菌hpa2基因的突变和功能分析

利用自杀质粒pK18mob诱变野油菜黄单胞菌Xcc8004的hpa2基因,获得整合突变体PK3001。致病性和过敏反应检测发现,hpa2突变体PK3001过敏反应完全丧失,但致病性无明显变化。利用gus报告基因和RT-PCR检测hpa2基因的表达调控,结果表明,hpa2基因在基本培养基上高表达,且受hrpG、hrpX正向调控。