用B型超声波导引活体采集奶水牛的卵母细胞

本试验利用B型超声波导引活体采集42头奶水牛的卵母细胞,每头牛每周采卵2次,共采卵96次,卵母细胞回收率67%,可用卵母细胞数平均为3.1,成熟培养的囊胚率平均为24.7%.对水牛的卵巢观察结果表明活采对水牛的健康及生殖机能不产生影响.     

牛活体采集卵母细胞技术的研究

本研究利用自制采卵器对 2 4头健康牛和 2 0头有生殖障碍牛进行活体采集卵巢卵母细胞试验。卵母细胞回收率 4 2 .9% ,共采集卵母细胞 397枚 ,其中可用卵 2 6 6枚 ,占 6 6 .7% ,平均每头母牛获卵母细胞和可用卵母细胞数分别为 9.0 2枚和 6 .0 4枚。采集的卵母细胞经体外受精和体外培养 ,移植受体母牛 ,成功地分娩了我国第一头活体采卵牛犊     

B型超声波导引采集牛卵母细胞

在牛胚胎移植技术的应用中由于母牛对外源激素超排反应的不稳定性,特别是连续进行超排处理对供体牛产生不良影响,限制了从一些优良母牛来获取多个胚胎。随着牛体外受精技术的成熟,可在体外生产胚胎,所需的卵母细胞主要从屠宰后的牛卵巢上获得,但对有价值的牛用屠宰取卵巢的方法显然是不可行的。近几年发展起来的活体采卵技术(OPU)使这一问题得到很好的解决。本试验用B型超声波导引采集卵母细胞取得较好的效果。1材料与方法1.1试验牛的选择试验在北京锦绣大地公司胚胎中心进行。从牛场选取皮埃蒙特杂交一代母牛3头,3岁,体重450kg左右,健康…     

影响水牛活体采卵效果的因素研究

为探讨不同采卵季节、供体牛年龄和连续采卵时间3个因素对水牛活体采卵效果的影响,本实验选择3～12岁、体重400～700 kg的尼里拉菲水牛52头（其中3～7岁40头、8～12岁12头）,根据单因子完全随机试验设计进行分组,分别观察不同采卵季节、供体牛年龄、连续采卵3个月以下（包含3个月）和3～9个月时间对活体采卵效果的影响。结果表明：冬季的头均卵母细胞数、头均可用卵母细胞数均高于春季（P<0.05）和夏季（P<0.01）,且夏季的头均卵母细胞数、头均可用卵母细胞数均低于其他季节（P<0.01）;3～7岁牛的头均可用卵母细胞数比8～12岁牛的多1.78枚（P<0.05）;活体连续采卵时间在3个月以下（包含3个月）的卵母细胞可用率比连续采卵3～9个月的多8.03(P<0.01)。可见,一年四季都可进行水牛活体采卵,但秋、冬季进行活体采卵较为适宜;3～7岁年龄段牛做供体的活体采卵效果更佳;卵母细胞可用率会随着连续采卵时间延长而明显下降,建议同一批牛连续采卵不超3个月。     

犬卵母细胞体外成熟的影响因素

采集发情期和间情期犬卵巢,回收大腔（直径大于１ｍｍ）卵泡和不可见卵泡的卵母细胞,在４种成熟液（ＴＣＭ１９９＋２０％ＦＣＳ,ＴＣＭ１９９＋２０％ＦＣＳ＋１０ＩＵ／ｍＬＦＳＨ,ＴＣＭ１９９＋２０％ＥＤＳ和ＴＣＭ１９９＋２０％ＥＤＳ＋１０ＩＵ／ｍＬＦＳＨ）中成熟后进行了受精试验。结果：（１）发情期大于２ｍｍ和１～２ｍｍ的大腔卵泡卵母细胞的体外成熟率（４２．５％,３２．５％）显著高于间情期卵母细胞（２０．４％）,但发情犬不可见卵泡卵母细胞的体外成熟率（２８．９％）与间情期卵母细胞差异不显著;（２）在成熟液中添加促性腺激素,能有效地提高卵母细胞成熟率,不可见卵泡的卵母细胞对促性腺激素的依赖性（３０．０％比７．８％）大于大腔卵泡的卵母细胞（４２．５％比２９．０％）;（３）卵丘扩散与卵母细胞成熟存在相关性;（４）ＥＤＳ可诱导卵丘扩散,但不能有效提高卵母细胞的成熟率;（５）发情期卵巢上的大腔卵泡和不可见卵泡的卵母细胞以及间情期卵巢不可见卵泡的卵母细胞体外培养后,与体外获能的精子进行体外受精,其卵裂率分别为１６．０％（４／２５）,０％（０／４０）和２．５％（１／４０）。     

淘汰牛连续活体采卵效果及影响因素分析

为挖掘利用具有优秀遗传性能的淘汰母牛的卵泡资源，本实验开展淘汰牛连续活体采卵的效果及影响因素研究。选取6头5～6岁无卵巢疾病的淘汰西门塔尔牛，分别于7、10、11月和12月每间隔4 d进行1次活体采卵，每月最高进行5次活体采卵，记录每头次的卵泡抽吸次数、获卵数、优质卵数，并对影响活体采卵效果的因素进行分析。结果表明：平均头次获卵数和优质卵数分别为4.61枚和2.22枚，卵子回收率和优质卵率分别为47.21%和49.13%；试验牛的平均头次获卵数无显著差异，但第1次活体采卵的卵子回收率高于第2～5次（P<0.05），第2次活体采卵的优质卵率显著高于第5次；采卵月份对平均头次获卵数、回收率和优质卵率无显著影响；采卵次数与采卵月份间无交互作用（P>0.05）。综上，淘汰牛连续活体采卵的效果相对稳定，连续采卵次数对卵子回收率、优质卵率具有一定影响。     

奶牛活体采卵间隔时间对优质卵率的影响

试验通过对卵泡波发育时程的监测,以及比较间隔不同的采卵时间获得的卵母细胞-颗粒细胞复合物(COCs)质量,并通过孤雌激活的方式验证卵母细胞的质量,从而确定最佳间隔采卵的时间。利用超声波活体穿刺的方法分别对间隔5天、7天和10天的母牛进行采卵,在体外对COCs进行成熟培养后,有极体排放的卵母细胞进行孤雌激活观察胚胎发育情况发现:间隔7天采卵获得28%的桑椹囊胚发育率,间隔5天采卵获得12%的桑椹囊胚发育率,间隔10天获得16%的桑椹囊胚发育率。卵裂率没有显著性差异。因此证实活体穿刺采卵间隔7天是最合适的一个时间,可获得一定数量的优质卵母细胞。     

牛胚胎体外生产技术的简化研究

利用屠宰牛卵巢分离的卵母细胞，以卵裂率和囊胚发育率为标准，对牛胚胎体外生产过程进行了简化试验。结果显示：不加卵丘细胞的高密度卵母细胞体外成熟（１００￣２００枚／平皿）可代替加卵丘细胞的标准密度（５０枚／平皿）培养，其卵裂率（５７．６％比６２．５％）和囊胚发育率（２３．７％比２９．１％）没有显著差异（Ｐ〉０．０５），体外授精时间可从成熟培养后２２ｈ延长至２７ｈ，卵裂率和囊胚发育率均没有显著变化，卵母     

发情周期不规则和性欲亢进是奶牛重复超排的制约因素

在MOET计划中，供体牛被重复超排和冲卵。本试验着重研究在少雨的气候环境中，供体牛卵巢受到持续激素刺激后对发情周期的影响。在发情周期第８～１２天，用FSHp（Pluset，Serono，Italy）处理Holstein－Friesian供体牛，总剂量为６５０IU（肌注８次，历时４天）。注射FSHp的第３天注射，在此之后的４８小时和６０小时进行２次人工授精。第７天采用非手术法冲卵，对所获卵子（胚胎）数量注册并用t－检验分析。根据供体牛所获胚胎数量对其分组，记录参照产犊间隔，比率用卡方检验比较分析。本试验对７５头供体牛进行了３６４次超排，…     

超排山羊卵巢卵母细胞体外成熟和体外受精的研究

以ＴＣＭ１９９＋１０ｍｍｏｌ／ＬＨＥＰＥＳ＋青霉素（６ｍｇ／Ｌ）＋链霉素（５ｍｇ／Ｌ）为基础培养液（ＢＭ），再分别加入不同成分，配成５种卵母细胞成熟液：（Ａ）ＢＭ＋１０％ＥＧＳ；（Ｂ）ＢＭ＋１０％ＥＧＳ＋ＨＣＧ（２．５ｍｇ／Ｌ）；（Ｃ）ＢＭ＋１０％ＥＧＳ＋ＨＣＧ＋Ｅ２（１ｍｇ／Ｌ）；（Ｄ）ＢＭ＋１０％ＦＣＳ＋ＨＣＧ＋Ｅ２；（Ｅ）ＢＭ＋１０％ＥＧＳ＋ＨＣＧ＋Ｅ２＋颗粒细胞（１．５×１０６～３．０×１０６个／ｍＬ）。在３８．５℃、５％ＣＯ２下培养２６ｈ，排卵后第１天卵巢卵母细胞体外成熟率分别为６７．６７％（２０／３０），６０．４２％（２９／４８），８３．６７％（４１／４９）和８０．８２％（５９／７３），排卵后第５天卵巢卵母细胞，在培液Ｄ中体外成熟率为７１．４３％（４５／６３）。排卵后第１天的９８枚卵巢卵母细胞，体外成熟体外受精卵裂率为２１．４３％，２１枚２细胞胚移植５头受体获２头羔羊。研究表明，超排山羊卵巢卵母细胞经体外成熟可获得大量廉价的成熟卵母细胞，并可通过体外受精获得试管山羊     

不同因素对牛卵母细胞体外成熟培养效果的影响

文章主要从采集方法、性周期阶段以及培养液中FBS浓度3个方面对牛卵母细胞体外成熟的影响进行了分析。结果表明：①不同采卵方法的采卵效果存在差异,但成熟培养和体外受精情况差异不显著（P〉0．05）;②从卵泡期和黄体期卵巢采集到的卵母细胞的体外成熟率和卵裂率分别,为59.7%,56．6％和39．5％、36．6％,没有显著差异（P〉0．05）;③培养液中添加20％FBS组的卵母细胞成熟率和卵裂率显著高于10%FBS和30%FBS组（P〈0．05）.     

电激活对完全体外化牛细胞核移植的影响

牛卵母细胞在体外成熟２３～２４ｈ时去核，去核卵用８０Ｖ／ｍｍ４０μｓ两次电脉冲激活（Ⅰ组）或不激活（Ⅱ组），然后将体外受精、发育的８～３２细胞期胚胎的单个卵裂球注入卵周隙，用８０Ｖ／ｍｍ４０μｓ两次电脉冲诱导卵裂球与去核卵母细胞融合。Ⅰ组操作后存活率和融合率（８８．４％和５５．０％）显著低于Ⅱ组（９５．９％和６５．１％，Ｐ＜０．０５）。融合卵体外培养２４ｈ和５～８ｄ后，Ⅰ组核移植胚胎的卵裂率和桑椹／囊胚发育率（６３．０％和１５．２％）与Ⅱ组（５０．５％和７．８％）无显著差异，但Ⅰ组结果均好于Ⅱ组。将来自两组的２５枚桑椹和囊胚移植到１６头同期受体，在已检查过的８头受体中２头受体妊娠，其中１头于妊娠后４个多月流产，１头于妊娠期满后产出一雄性牛犊。研究结果表明：去核卵母细胞的电激活尽管对重组卵的存活与融合不利，但可改善核移植胚的卵裂和发育。本研究在我国首次获得牛细胞核移植的成功，证明用ＩＶＭ卵母细胞和ＩＶＦ胚胎进行完全体外化的牛细胞核移植是可行的。     

优势卵泡与促卵泡素对牛活体采卵效果的影响

将8头荷期坦供体奶牛随机分为4组,每组2头,分别按优势卵泡+注射促卵泡素(FSH)、优势卵泡+不注射FSH、去优势卵泡+注射FSH、去优势卵泡+不注射FSH处理供体牛,处理后第4天应用B型超声波导引活体采卵,试验重复10次。结果显示:注射FSH前去优势卵泡对其可采卵泡数、回收卵母细胞数和可用卵母细胞数均有显著提高(P0.05),但不注射FSH时去优势卵泡对提高采卵效率无显著效果;活体采卵对供体牛卵巢虽造成一定损伤,但停止采卵2~3个月后均能恢复正常发情、配种后能正常妊娠,对供体牛繁殖性能无显著影响。     

牛胚胎体外生产技术的简化研究

利用屠宰牛卵巢分离的卵母细胞，以卵裂率和囊胚发育率为标准，对牛胚胎体外生产过程进行了简化试验。结果显示：不加卵丘细胞的高密度卵母细胞体外成熟（１００～２００枚／平皿）可代替加卵丘细胞的标准密度（５０枚／平皿）培养，其卵裂率（５７．６％比６２．５％）和囊胚发育率（２３．７％比２９．１％）没有显著差异（Ｐ＞０．０５），体外授精时间可从成熟培养后２２ｈ延长至２７ｈ，卵裂率和囊胚发育率均没有显著变化，卵母细胞体外成熟后可以不经洗涤直接移入受精滴，原成熟培养皿内残留卵丘细胞再培养４８ｈ形成的单层细胞，可代替标准方法制作的单层小滴用于体外受精胚胎的共同培养，供胚胎发育培养的单层细胞使用多次不影响囊胚发育率，经简化的ＩＶＦ技术获得的胚胎非手术移入情期同步受体牛子宫角２～２．５个月后直检有５８．３％（７／１２）妊娠。我们认为，传统的牛胚胎体外生产技术经过简化可以提高生产效率，不会减少囊胚发育率和妊娠率，值得推广应用。     

牛体外受精胚胎细胞核移植的实验研究

将采自肉联厂屠宰车间的牛卵巢中的卵母细胞置于ＴＣＭ－１９９＋１０％ＥＣＳ（０ｄ）＋ＦＳＨ（１万ＩＵ／Ｌ）＋ＬＨ（５ｍｇ／Ｌ）中培养成熟，用含０．３％透明质酸酶的消化液将卵母细胞周围的卵丘细胞去掉，并以７．５ｍｇ／Ｌ的ＣＢ液处理后，用微吸管吸去透明带内的第一极体及极体下面的部分卵母细胞质，然后将经体外受精并发育至８～１６细胞期胚胎的卵裂球注入去核卵母细胞的卵周隙中，再将移核胚置于电融合槽内进行融合（电场强度为１２００Ｖ／ｃｍ，持续时间为８０μｓ，１次脉冲刺激）。将融合的胚胎移入生长有单层贴壁颗粒细胞的发育培养液（ＴＣＭ－１９９＋１０％牛血清）中培养，观察移核胚的融合率及发育率，部分去核卵母细胞经染色后观察去核率。结果表明：（１）移核胚的融合率为８６．９％（５３／６１）；（２）发育至２～８细胞期的胚胎占培养的移核胚胎总数的２１．３％（１０／４７）；（３）卵母细胞的去核率为６８．２％（４５／６６）。     

荷斯坦奶牛与和牛活体采卵-体外受精（OPU/IVF）体系的建立及应用

[目的]研究牛活体采卵-体外受精（ovum pick-up and in vitro fertilization,OPU/IVF）体系,建立高效的牛体外胚胎生产系统。[方法]以从屠宰场采集的健康牛新鲜卵巢为试验材料,进行卵母细胞体外成熟、体外受精、体外胚胎培养相关条件的摸索,重点考查体外胚胎培养液中添加瘦素（leptin）对囊胚率的影响。选取13～15月龄健康荷斯坦奶牛及和牛各10头作为供体,进行活体采卵、卵母细胞体外成熟、体外胚胎生产,记录可用卵数及可用囊胚数,统计卵裂率、囊胚率;2个品种牛的体外冷冻胚胎解冻后,以荷斯坦奶牛为受体进行胚胎移植,移植后45 d统计妊娠率。[结果]添加30 U/mL的leptin可以显著（P<0.05）提高屠宰场来源牛体外胚胎的囊胚率。随机选择供体牛活体采卵,平均每头荷斯坦奶牛获得可用卵7.5枚,平均每头和牛获得可用卵8.1枚;荷斯坦奶牛及和牛的卵裂率分别为84.00%、82.71%,二者差异不显著（P>0.05）。体外培养条件下,平均每头荷斯坦奶牛获得可用囊胚4.3枚,平均每头和牛获得可用囊胚3.7枚;荷斯坦奶牛的囊胚率（57.33%）显著...     

山莨菪碱加微量雌激素对奶牛催情的观察研究

本研究应用盐酸山莨菪碱（１５０ｍｇ）及微量的雌激素（４ｍｇ）对１～４胎９０天以上未出现发情的不孕奶牛４５例进行催情，其有效率为７１．１１％（３２／４５），其中卵巢静止为６０％（１５／２５），持久黄体８５％（１７／２０）。同时还发现用上述两种药物处理的１０例患牛的血清孕酮含量在注射后的１２０小时以内均有程度不同的下降；当血清孕酮最低峰值＜１．０ｎｇ／ｍｌ时临床呈现发情征象的持久黄体牛为８３．３％（５／６）；卵巢静止为１００％（４／４）。５例仅用微量雌激素（４ｍｇ）注射的患牛孕酮含量虽有变化但临床上均不出现显性发情征状。初步证明：盐酸山莨菪与微量雌激素协同可对奶牛有明显的催情作用。     

雪龙黑牛活体采卵与屠宰采卵在体外受精技术中的应用研究

利用超声波活体采卵技术(ovum pick-up,OPU)对12头纯种雪龙黑牛间隔4d采卵2次,对51头F2代遗传性能优秀的雪龙黑牛每周采卵1次,并对活体采卵与屠宰采卵及体外受精后胚胎的发育进行了对比分析.结果表明,活体采卵第2次卵泡数比第1次多82个,而获得的卵母细胞数第2次比第1次少1 2枚;屠宰采卵优秀卵母细胞率高于活体采卵,并且囊胚发育率高于活体采卵.     

盐酸山莨菪碱加微量雌激素对奶牛催情作用的研究

本研究应用盐酸山莨菪碱（１５０ｍｇ）及微量的雌激素（４ｍｇ）对１～４胎９０天以上未出现发情的不孕奶牛４５例进行催情，其有效率为７１．１１％（３２／４５），其中卵巢静止为６０％（１５／２５），持久黄体８５％（１７／２０）。同时还发现用上述两种药物处理的１０例患牛的血清孕酮含量在注射后的１２０小时以内均有程度不同的下降；当血清孕酮最低峰值＜１．０ｎｇ／ｍｌ时，临床呈现发情征象的持久黄体牛为８３．３％（５／６）；卵巢静止牛为１００％（４／４）。５例仅用微量雌激素（４ｍｇ）注射的患牛孕酮含量虽有变化但临床上均不出现显性发情症状。初步证明：盐酸山莨菪碱与微量雌激素协同可对奶牛有明显的催情作用，此方法迄今国内外未见报道。     

猪卵巢卵母细胞采集方法的比较研究

本试验利用抽吸法和剖切法两种采集方法采集猪卵巢卵母细胞,对获得可用卵丘卵母细胞数和卵丘完整程度的影响进行比较研究,并分析在卵巢收集时不同的保存温度、运输时间对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明：剖切法采集细胞数目显著高于抽吸法（P〈0．01）;A、B级卵母细胞的比例在剖切法中显著高于抽吸法（P〈0．05）;抽吸法所采集的c级卵母细胞显著高于剖切法（P〈0．05）;剖切法中卵母细胞卵丘完整率高于抽吸法（P〈O．05）;离体卵巢保存的最佳温度为36℃-38℃;其保存时间为1～1．5h时成熟率57．6％与2—2．5h时成熟率52．8％相比无显著差异（P〉O．05）;保存时间超过6h时卵母细胞的成熟率显著下降。