应用流式细胞术检测虾类血细胞总数方法的建立

通过对流式细胞术(FCM)检测虾类血细胞总数(THC)的条件和方法进行优化,为虾类血细胞学研究提供快捷、准确的测定方法。2012年7-9月,应用SYBR Green I作为荧光染料标记完整血细胞,设置3个不同染料浓度(1×、10×和100×),测定不同孵育时间下染色细胞比例的变化。结果显示,染料终浓度为10×时染色效果最佳,其最佳孵育时间为60 min;应用建立的FCM方法和显微计数方法测定10尾凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的THC,平均值分别为(16.68±1.57)×106个/m L和(15.09±1.76)×106个/m L,2种方法测定结果的相关性极显著(R2=0.8064,P<0.01)。凡纳滨对虾经不同浓度(0.5 mg/L和5.0 mg/L)的Cd2+胁迫,利用建立的FCM方法测定Cd2+胁迫下对虾THC的变化。结果显示,0.5 mg/L和5.0 mg/L Cd2+胁迫下,对虾THC随着胁迫时间的延长不断下降,胁迫48 h时分别下降至对照组的78.7%和64.7%,可见Cd2+胁迫对虾类血细胞产生毒性,抑制了血细胞活性,表明该方法适用于虾类的血细胞学研究。     

重金属对罗氏沼虾血细胞活性和酯酶活力的影响

为探讨不同重金属对罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)血细胞的细胞毒性,取罗氏沼虾血淋巴,离体状态下分别暴露于不同浓度(10~(-9)~10~(-3) mol/L)的Cd~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)和Zn~(2+)环境中6 h,设置不添加重金属的对照组,应用流式细胞术测定细胞活性和胞内非特异性酯酶活力。结果显示,10~(-9)~10~(-6) mol/L的Cd~(2+)对细胞活性和酯酶活力均没有显著影响,Cd~(2+)浓度达到10~(-5) mol/L时,酯酶活力受到了显著的抑制,Cd~(2+)浓度达到10~(-4)和10~(-3) mol/L时,细胞活性和酯酶活力均显著下降;10~(-9)~10~(-6) mol/L的Hg~(2+)对细胞活性和酯酶活力均没有显著影响,Hg~(2+)浓度为10~(-5)~10~(-3) mol/L时,细胞活性和酯酶活力均显著下降;10~(-9)~10~(-5) mol/L的Cu~(2+)对细胞活性和酯酶活力均没有显著影响,Cu~(2+)浓度为10~(-4)~10~(-3) mol/L时,细胞活性和酯酶活力均显著下降;10~(-9)~10~(-5) mol/L的Zn~(2+)对细胞活性和酯酶活力均没有显著影响,Zn~(2+)浓度为10~(-4) mol/L时,酯酶活力显著下降,Zn~(2+)浓度为10~(-3) mol/L时,细胞活性和酯酶活力均显著下降。Cd~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)和Zn~(2+)对细胞活性的毒性临界浓度分别为10~(-4) mol/L、10~(-5) mol/L、10~(-4) mol/L和10~(-3) mol/L,毒性强度由高到低依次为Hg~(2+)、Cd~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)。Cd、Hg、Cu和Zn这4种重金属对罗氏沼虾血细胞活性和酯酶活力均具有明显的剂量效应;酯酶活力对重金属胁迫较细胞活性更为敏感,可作为虾类细胞毒理学研究的重要指标。     

镉对凡纳滨对虾离体血细胞的毒性影响

对凡纳滨对虾血细胞进行离体镉离子应激,Cd2+浓度为10-3-10-9M,在应激6h后取样,利用流式细胞术（FCM）检测血细胞的活性和活性氧（ROS）含量。结果显示,当Cd2+浓度为10-5M时,血细胞的ROS含量显著升高;当Cd2+浓度为10-3和10-4M时,血细胞的死亡率和ROS含量均显著上升。这些结果表明Cd2+的细胞毒性作用与其浓度相关,Cd2+浓度达到10-5M时即可诱导血细胞ROS的产生,但当Cd2+浓度达到10-4M及以上时,被诱导产生的ROS对细胞造成氧化伤害从而导致细胞死亡。     

Cu2+和Cd2+对克氏原螯虾幼虾的毒性效应研究

采用静水法生物测试,研究了Cu2+和Cd2+对克氏原螯虾幼虾(体重0 0142～0 0308 g)的急性毒性作用.试验结果表明,克氏原螯虾对Cu2+、Cd2+均会产生较强的毒性效应,其对Cu2+、Cd2+的耐受性随接触时间延长而明显降低.Cu2+对克氏原螯虾幼虾24 h、48 h半致死浓度(LC50)分别为30.854 mg/L、10.595 mg/L;Cd2+对克氏原螯虾幼虾24 h、48 h、72 h半致死浓度(LC50)分别为5.315 mg/L、1.371 mg/L和0.414 mg/L.Cu2+、Cd2+对其的安全浓度(SC)分别为0.375 mg/L、0.027 mg/L,为相应渔业水质标准的3.8倍和 5.5倍,表明克氏原螯虾具有较强耐受Cu2+和Cd2+污染的能力.     

镉胁迫诱导胭脂鱼血细胞凋亡的研究

以胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)离体血细胞为实验材料,用不同浓度的氯化镉溶液处理.通过瑞士姬姆萨和AO/EB荧光染色,在光学和荧光显微镜下观察了血细胞的形态变化,并统计了细胞的凋亡率.结果显示,在氯化镉的胁迫作用下,胭脂鱼血细胞呈现细胞变圆、核变圆、核边缘化、形成凋亡小体等细胞凋亡的形态特征.较低Cd2+浓度(0.01 mmoL/L)胁迫,1 h即可产生明显的细胞凋亡诱导效应,并且细胞凋亡率随着Cd2+浓度的增加和作用时间的延长而升高.表明Cd2+能诱导胭脂鱼血细胞发生典型的凋亡,而且细胞凋亡率与Cd2+浓度和处理时间成明显的剂量-效应关系.     

重金属对凡纳滨对虾血细胞吞噬活力的影响

为研究不同重金属离子对虾类血细胞的免疫抑制作用,凡纳滨对虾(Ltiopenaeus vannamei)血细胞在离体状态下暴露于重金属离子(Cd^{^(2+})、Hg²⁺、Cu²⁺和Zn²⁺),浓度分别设置为10^-3～10^-9 M,在胁迫6h后应用流式细胞术测定血细胞的吞噬活力。结果显示,与对照组相比,浓度为10^-3～10^-5 M的Cd²⁺和Hg²⁺、10^-3～10^-4 M的Cu²⁺、10^-3 M的Zn²⁺均显著抑制了对虾血细胞的吞噬活力;当浓度为10^-3 M时,Cd²⁺、Hg²⁺、Cu²⁺和Zn²⁺组的吞噬活力抑制率分别为79.6%,82.6%、68.1%和58.7%。这些结果表明,一定浓度的重金属离子对虾类血细胞吞噬活力具有免疫抑制作用,免疫抑制毒性强度依次为:Hg²⁺>Cd²⁺>Cu²⁺>Zn²⁺,免疫毒性临界浓度分别为:Cd²⁺和Hg²⁺10^-5 M、Cu²⁺10^-4 M、Zn²⁺10^-3 M。     

Cu~(2+)和Cd~(2+)对克氏原螯虾幼虾的毒性效应研究

采用静水法生物测试,研究了Cu2+和Cd2+对克氏原螯虾幼虾(体重0.0142～0.0308g)的急性毒性作用。试验结果表明,克氏原螯虾对Cu2+、Cd2+均会产生较强的毒性效应,其对Cu2+、Cd2+的耐受性随接触时间延长而明显降低。Cu2+对克氏原螯虾幼虾24h、48h半致死浓度(LC50)分别为30.854mg/L、10.595mg/L;Cd2+对克氏原螯虾幼虾24h、48h、72h半致死浓度(LC50)分别为5.315mg/L、1.371mg/L和0.414mg/L。Cu2+、Cd2+对其的安全浓度(SC)分别为0.375mg/L、0.027mg/L,为相应渔业水质标准的3.8倍和5.5倍,表明克氏原螯虾具有较强耐受Cu2+和Cd2+污染的能力。     

急性氨氮胁迫对红螯螯虾血细胞凋亡的影响

氨氮是水产养殖过程中的常见毒性污染物之一,为探讨氨氮对红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)血细胞的细胞毒性机制,研究了氨氮胁迫作用下红螯螯虾血细胞凋亡状态的变化。以17.6mg/L氨氮对红螯螯虾幼虾进行急性胁迫,于胁迫后的0、48、72和96h取血淋巴,应用流式细胞术测定血细胞总数(THC)、胞内游离Ca~(2+)含量、线粒体膜电位(MMP)和血细胞凋亡率。结果显示,红螯螯虾的THC在胁迫的72h开始有显著的下降,在96h时达到最低值;血细胞胞内游离Ca~(2+)含量在48h开始有显著的升高,在96h达到最高值;血细胞MMP在72h开始有显著的下降,在96h达到最低值;血细胞凋亡率在72h开始有显著的升高,在96h时达到最高值,为9.39%。这些结果表明,胞内游离Ca~(2+)含量是对氨氮胁迫最为敏感的指标;氨氮急性胁迫诱导红螯螯虾血细胞发生了Ca~(2+)参与调节、线粒体通路相关的细胞凋亡,从而导致了THC的下降。     

镉胁迫对凡纳滨对虾血细胞基因表达的影响

为探讨镉(Cd)胁迫下凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血细胞的分子响应,以不同浓度的Cd2+(0,0.5 mg/L和5 mg/L)进行胁迫,于不同胁迫时间取血淋巴,测定血细胞中Trx 2、Grx 2、Grx 3和MGST 3的基因表达量变化。结果显示,Trx 2、Grx 3和MGST 3表达量在胁迫的中后期显著上调,Grx 2表达量在5 mg/L Cd2+胁迫6 h开始即有显著的升高,并持续至48 h。结果表明在Cd胁迫作用下,对虾血细胞中上调这四个氧化还原与抗氧化相关基因的表达水平,以进行胁迫防御;Grx 2对Cd胁迫较为敏感,在整个胁迫过程发挥作用,Trx 2、Grx 3和MGST 3主要在胁迫的中后期发挥作用;基因的表达响应具有一定浓度效应。     

镉对鲤遗传毒性和外周血细胞数量的影响

将鲤(Cyprinus carpio)分别暴露于0.16、0.31、0.63、1.26 mg/L Cd2+溶液中,研究Cd2+对鲤外周血红细胞微核率、核异常率、红细胞和白细胞数量的影响,探讨Cd2+对鲤遗传毒性和外周血细胞数量影响的变化规律和趋势。结果显示:Cd2+对鲤红细胞微核率和核异常率的影响存在浓度-效应和时间-效应关系。与对照组相比,1.26 mg/L Cd2+组鲤在不同暴露时间的红细胞微核率和核异常率均极显著(P<0.01),核异常率在72 h显著(P<0.05)增加,72 h后表现为极显著(P<0.01)增加。Cd2+对鲤外周血淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞比例的影响存在浓度-效应和时间-效应关系。相同Cd2+浓度下,鲤淋巴细胞比例随暴露时间增加先降低后上升,同一暴露时间淋巴细胞比例随Cd2+浓度增加而降低。相同Cd2+浓度下,鲤单核细胞和嗜中性粒细胞比例随暴露时间增加先升高后降低,同一暴露时间嗜中性粒细胞比例随Cd2+浓度增加而升高。研究表明,Cd2+对鲤具有遗传毒性效应,且随Cd2+浓度增加而增强。