日本结缕草ZjNAC3基因在盐胁迫中的功能

盐胁迫能够加速草坪草的黄化,影响草坪的坪观质量.植物中的NAC转录因子在盐胁迫条件下发挥着重要作用,参与胁迫响应,而在日本结缕草(Zoysia japonica)中还鲜有NAC转录因子的功能研究.本研究对转ZjNAC3基因(GenBank登录号:MT254544)的YPH500酵母菌株进行盐敏感性检测,初步判定ZjNAC3在盐胁迫下具有负调节酵母细胞生长的作用;对过表达ZjNAC3基因的拟南芥(Arabidopsis thaliana)株系进行盐处理,发现150 mmol·L?1 NaCl处理7 d后转基因植株的生长明显弱于野生型(wild type,WT),脯氨酸含量、丙二醛含量、细胞膜透性均显著高于WT(P<0.05),而叶绿素、可溶性糖含量显著低于WT(P<0.05);AtNHX1基因的表达量显著低于WT(P<0.05),表明过表达ZjNAC3基因降低了拟南芥植株的耐盐性.分析认为ZjNAC3通过减弱渗透调节、增加细胞受损和降低将Na+隔离到液泡的作用,从而使得转基因拟南芥植株表现出盐敏感的性状.本研究揭示了ZjNAC3是一个负调控植物耐盐性的重要基因,为之后探究NAC转录因子调控日本结缕草的耐盐性及其机理奠定了基础.     

日本结缕草ZjNAC1的克隆、转录激活活性、亚细胞定位及表达分析

采用RACE技术从日本结缕草中克隆得到ZjNAC1转录因子(GenBank No. MH428376),其开放阅读框为945bp,编码314个氨基酸。ZjNAC1编码的蛋白在N端有1个典型的NAM保守结构域,属于NAC转录因子家族。通过染色体步移的方法,获得ZjNAC1基因ATG上游1635bp序列,分析发现其包含响应脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)及逆境胁迫的作用元件。构建pGBKT7-ZjNAC1载体,转化Y2HGold酵母感受态细胞,发现ZjNAC1具有转录激活活性。农杆菌介导的35S-ZjNAC1-YFP载体注射本生烟草叶片瞬时表达结果显示,ZjNAC1定位于细胞核。实时荧光定量结果表明,ZjNAC1在日本结缕草根中表达量最高;此外,ZjNAC1的表达受10μmol/L MeJA和20%PEG4000处理的诱导,但受200μmol/L乙烯(ET)、10μmol/L ABA和300mmol/L NaCl处理的抑制。     

日本结缕草ZjNAC3基因在盐胁迫中的功能

盐胁迫能够加速草坪草的黄化,影响草坪的坪观质量。植物中的NAC转录因子在盐胁迫条件下发挥着重要作用,参与胁迫响应,而在日本结缕草(Zoysia japonica)中还鲜有NAC转录因子的功能研究。本研究对转ZjNAC3基因(GenBank登录号:MT254544)的YPH500酵母菌株进行盐敏感性检测,初步判定ZjNAC3在盐胁迫下具有负调节酵母细胞生长的作用;对过表达ZjNAC3基因的拟南芥(Arabidopsis thaliana)株系进行盐处理,发现150 mmol·L-1 NaCl处理7 d后转基因植株的生长明显弱于野生型(wild type, WT),脯氨酸含量、丙二醛含量、细胞膜透性均显著高于WT(P 0.05),而叶绿素、可溶性糖含量显著低于WT (P 0.05);AtNHX1基因的表达量显著低于WT (P 0.05),表明过表达ZjNAC3基因降低了拟南芥植株的耐盐性。分析认为ZjNAC3通过减弱渗透调节、增加细胞受损和降低将Na+隔离到液泡的作用,从而使得转基因拟南芥植株表现出盐敏感的性状。本研究揭示了ZjNAC3是一个负调控植物耐盐性的重要基因,为之后探究NAC转录因子调控日本结缕草的耐盐性及其机理奠定了基础。     

结缕草ZjCCS基因的克隆与表达分析

为了解Cu/Zn超氧化物歧化酶分子伴侣基因(CCS)在结缕草逆境胁迫过程中的表达调控机制,以结缕草(Zoysia japonica)盐胁迫条件下的转录组数据为依据,结缕草cDNA为模板,通过RT-PCR法,克隆了924 bp长的结缕草ZjCCS基因的CDS序列。同源性分析显示该基因与谷子(Setaria italica)同源性最高,含有植物CCS蛋白所特有的3个保守结构域。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究该基因在非生物胁迫条件下在结缕草叶片中的表达情况,结果显示,在盐胁迫条件下,ZjCCS基因的表达量呈先上升后下降的趋势,4 h表达量最高,相对于盐胁迫,干旱和重金属胁迫对ZjCCS基因的表达量影响不大,推测ZjCCS基因可能在结缕草响应盐胁迫过程中发挥作用。     

白羊草NAC转录因子基因的克隆及表达分析

NAC转录因子是植物特有的转录因子并在植物的生长发育过程中发挥重要的作用,根据其他植物NAC转录因子基因的氨基酸保守序列设计简并引物,通过RT-PCR和RACE技术从白羊草(Bothriochloa ischaemum)中获得了全长cDNA,命名为BiNAC.序列分析表明,该cDNA片段全长为1549 bp,开放阅读框1125 bp,编码374个氨基酸,具有典型的NAC类蛋白的结构特征.进化树分析表明,该蛋白属于ATAF亚族,与高粱(Sorghum bi-color)亲缘关系最近,同源性达到94％.Real-time PCR检测结果表明,BiNAC基因在茎中的表达量最高,根中表达量最少,并且受NaC1胁迫表达上调.同时成功构建了植物表达载体pBI121-BiNAC-GUS,为进一步开展NAC基因的功能研究创造了条件.     

与蒙古冰草抗旱相关的NAC转录因子生物信息学及其表达分析

NAC转录因子具有调控植物生长发育及应对非生物逆境胁迫等多种功能。为筛选蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）抗旱相关的NAC转录因子，本研究基于转录组测序数据，利用生物信息学方法对蒙古冰草NAC转录因子的结构、理化性质、进化关系和保守性等进行分析，同时运用实时荧光定量技术对抗旱相关的2个NAC基因进行差异表达分析。结果表明：筛选出26个蒙古冰草NAC家族成员，其中15个具有完整NAC转录因子结构域，其均属于亲水性蛋白，大部分定位于细胞核；15个蒙古冰草NAC转录因子的蛋白磷酸化位点均含有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。进化关系比对显示AmNAC100和AmNAC102-2转录因子与已知有抗旱功能的NAC蛋白同源性极高，其二、三级结构主要以无规则卷曲为主，motif1，2，3，8为其共有的保守基序，多序列比对将保守结构域划分为子域A—E。差异表达分析发现AmNAC100和AmNAC102-2基因相对表达量均高于对照（CK），在蒙古冰草干旱胁迫中起正调控作用。     

草地早熟禾NAC基因鉴定及非生物胁迫下表达模式分析

草地早熟禾(Poa pratensis)是世界上广泛应用的草坪草种,其抗逆基因的挖掘对抗逆新品种的选育具有重要意义.NAC基因家族是植物特有的转录因子之一,在植物逆境响应中起到重要作用.以二穗短柄草(Brach ypodium distach yon)的NAC蛋白序列为请求序列,从草地早熟禾转录组数据库序列比对分析得到15个草地早熟禾PpNACs基因的cDNA全长序列,具有完整的开放阅读框.运用生物信息学方法预测早熟禾NAC家族成员的理化性质和保守结构域,发现15个PpNACs转录因子都是酸性蛋白,除PpNAC16外都属于不稳定蛋白,疏水性蛋白,具有相似的结构,通过聚类分析可将15个PpNACs成员分为3类.荧光定量PCR结果显示,在重金属胁迫下显著上调表达的基因有Pp-NAC10、PpNAC18、PpNAC19和PpNAC24,在盐胁迫过程下显著上调表达的基因有PpNAC10和PpNAC24,在干旱胁迫下显著上调表达的基因有PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10和PpNAC13,在低温胁迫下显著上调表达的基因有PpNAC1、PpNAC10和PpNAC18,在高温胁迫下显著上调表达的基因有PpNAC20.其中,PpNAC10在重金属、盐、干旱和低温胁迫下均被显著诱导上调表达,Pp-NAC18在重金属、干旱和低温胁迫下均被显著诱导上调表达,PpNAC10和PpNAC18可作为草地早熟禾逆境胁迫响应的候选基因.     

白羊草NAC转录因子家族生物信息学分析

NAC转录因子家族是植物特有的一类重要转录因子,广泛参与植物生长、发育以及器官的建成、逆境胁迫应答等过程。为进一步研究白羊草（Bothriochloa ischaemum） NAC转录因子家族,本研究利用生物信息学方法对白羊草NAC基因所编码的蛋白理化性质、二级结构、保守基序、亚细胞定位、潜在磷酸化位点及系统进化关系进行了分析。结果显示,具有NAC结构域的21条白羊草氨基酸序列共分为10个亚家族,蛋白二级结构以无规则卷曲为主要组成部分,含有5个保守基序,大多数NAC蛋白定位于细胞核,均含有潜在的丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、和酪氨酸（Tyr）磷酸化位点。本研究将为白羊草NAC基因家族的进一步功能分析奠定重要的研究基础。     

结缕草ZjCSD基因的克隆及表达分析

铜锌超氧化物歧化酶是植物响应逆境胁迫过程中的关键酶,其含量和活性与植物抗逆性密切相关。本研究以结缕草cDNA为模板,利用同源克隆法,从结缕草转录组数据库中克隆获得了结缕草ZjCSD基因,该基因编码一个含有152个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析结果显示:ZjCSD基因编码蛋白为稳定的、亲水的、酸性、非分泌脂溶蛋白,定位于细胞质中,含有CSD蛋白家族特有的保守结构域,具有典型的Cu²⁺和Zn²⁺结合位点;与小米、玉米等禾本科植物具有较高的同源性,进化关系较近。采用实时荧光定量PCR研究该基因在不同组织中、不同胁迫处理下的表达模式,结果表明,ZjCSD基因在根、茎、叶中都有表达,叶中表达量最高;干旱胁迫(30% PEG)、盐胁迫(150 mmol/L NaCl)和Cd²⁺胁迫(200 mg/L Cd²⁺)均能诱导ZjCSD基因表达量上调,Pb²⁺胁迫(1 g/L Pb²⁺)诱导ZjCSD基因表达量下调。故推测结缕草ZjCSD基因在结缕草应对干旱、盐和重金属胁迫的过程中发挥作用。     

植物AP2/ERF类转录因子研究进展

AP2/ERF (APETALA2/ethylene-responsive factor)是植物中广泛存在的一类超大家族转录因子,含有1～2个约由60个氨基酸组成AP2/ERF结构域,根据AP2/ERF结构域的数量及结合序列可以将其分为5个亚家族:AP2(APETALA2)、 ERF(ethylene-responsivefactor)、 DREB(dehydration-responsiveelement-bindingprotein)、 RAV(relatedto ABI3/VP1)和Soloist。该家族转录因子在调控植物生长发育及响应逆境胁迫过程中发挥重要作用,本文重点介绍了近年来AP2/ERF类转录因子参与植物花发育、果实发育、种子发育等生长发育过程以及调控植物对病原体、干旱和高盐等逆境胁迫的响应过程等方面的研究进展,可为今后挖掘和利用该类转录因子基因提供参考。     

西伯利亚白刺肌动蛋白基因的分离与特性分析

利用兼并PCR及RACE技术克隆了西伯利亚白刺的肌动蛋白基因(Nitraria sibirica Actin, NsAct),并对其基因结构和表达特性进行了分析。所克隆的NsAct cDNA全长序列为1 831 bp,包含1 134 bp的开放阅读框,编码377个氨基酸;基因组DNA全长序列为2 913 bp,包含5个外显子和4个内含子。系统进化分析结果显示,NsAct与其他植物的肌动蛋白基因具有较高的同源性,与芒果(无患子目)亲缘关系最为接近。基因表达特性分析的结果显示,该基因在根、茎、叶中的表达量基本一致;在干旱、盐、低温及外源脱落酸胁迫下,表达量无明显变化,这些结果验证了该基因作为分子内标的可靠性。     

转玉米ZmABI3-L基因增加拟南芥的抗旱和耐盐性

ABI3 (abscisic acid insensitive 3) 是编码 ABA 信号转导途径中的重要调控因子,广泛地存在于玉米、小麦、水稻等谷类作物中。本研究从玉米中获得一个新的 ABI3-like 基因,命名为ZmABI3-L,该基因全长1735 bp,开放阅读框1212 bp,编码蛋白含404个氨基酸。同源比对表明ZmABI3-L和谷子、高粱的同源蛋白相似性高,分别为64%和58%。基因的表达分析表明该基因是组成型表达,在幼胚、穗子和花丝中表达量较高,同时基因的转录水平可以为盐、ABA、干旱和冷所诱导。将ZmABI3-L基因转化到拟南芥中,对T₃代转 ZmABI3-L基因拟南芥进行抗逆性分析,结果显示ZmABI3-L基因可以增强拟南芥的耐盐和抗旱能力。在150 mmol/L高盐培养基中转基因拟南芥的根和茎长度分别为对照的 8.6 和 1.4 倍,在50 mmol/L甘露醇的渗透培养基中转基因植株的发芽率是74.5%,而对照仅为 33.6%。研究表明 ZmABI3-L是一个对干旱和盐损伤均有响应而显著上调的基因,同时该基因可以增加拟南芥的抗旱和耐盐性。     

过量表达紫花苜蓿MsHB7基因对拟南芥耐旱性的影响

同源异型域-亮氨酸拉链蛋白（HD-Zip）第I类亚家族在植物非生物胁迫调控过程中起着重要作用,已在多个物种中进行了克隆鉴定,但关于紫花苜蓿该家族基因的研究还鲜有报道。本研究旨在研究紫花苜蓿HD-Zip第I类亚家族基因MsHB7对拟南芥抗旱性的调控功能。通过克隆得到大小为738 bp、编码245个氨基酸的MsHB7基因的开放阅读框。多重序列比对和系统进化树分析结果显示,MsHB7蛋白属于HD-Zip I亚家族,且与拟南芥中ATHB7和ATHB12亲缘关系较近。实时荧光定量分析表明,MsHB7基因受干旱诱导。将MsHB7基因转化拟南芥并获得了阳性植株。干旱处理后,转基因拟南芥比野生型拟南芥萎蔫程度更明显,转基因植株相对含水量显著低于野生型拟南芥,并积累了更多的脯氨酸和丙二醛。qRT-PCR检测发现处理之后逆境胁迫指示基因ATCAT1、 ATDREB2A和ATRD29A在转基因拟南芥中的表达量显著升高,而ATLEA3的表达量显著下降。上述结果表明MsHB7基因的过表达可降低转基因拟南芥的耐旱性,为进一步开发利用该基因提供理论依据。     

桑树Ca~(2+)/H~+反向转运体基因MCAX-1的克隆及序列与表达分析

植物体内的Ca2+/H+反向转运体在Ca2+介导的营养和信号转导中发挥着重要作用。选择桑树幼叶cDNA文库中功能注释为Ca2+/H+反向转运体基因(CAX)的一条EST序列设计引物,通过cDNA末端快速扩增(RACE)与反转录PCR(RT-PCR)在桑品种育71-1的幼叶中克隆获得该基因的全长cDNA序列,命名为MCAX-1(GenBank登录号:JN716318)。序列分析显示:MCAX-1全长1 784 bp,包括197 bp的5'端非翻译序列和243 bp的3'端非翻译序列,含有一个1 344 bp的完整ORF,编码447个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为47.93 kD,等电点为5.67。构建的桑树和其它植物基于CAX蛋白氨基酸序列的系统进化树显示:桑树与盐地碱蓬(Suaeda salsa)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)等有较近的亲缘关系。半定量RT-PCR分析表明:MCAX-1在桑树幼芽、嫩叶、根和幼花中的表达量较高,在韧皮部、木质部和成熟果实中的表达量较低;MCAX-1在低温胁迫下的表达量减少,-1℃时几乎无表达,在干旱胁迫下的表达量随着胁迫时间延长逐渐达到最大值之后又迅速降低,在盐分胁迫初期的表达量无变化,但胁迫18 d时表达量明显降低。初步推测MCAX-1与桑树的抗逆性能有一定关联。     

桑树钙调素蛋白基因MCaM-3的克隆及序列分析与诱导表达

钙调素蛋白(calmodulin CaM)作为真核生物细胞内的多功能Ca2+结合蛋白,在调节植物的生长发育、环境适应性和抗逆性方面具有重要作用。利用桑树表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)克隆了一个编码桑树CaM基因的全长cDNA序列,命名为MCaM-3(GenBank登录号:GQ303247)。序列分析表明,MCaM-3全长951bp,存在143 bp的5′端非翻译序列(5′-UTR)和358 bp的3′端非翻译序列(3′-UTR),其开放读码框(ORF)长450bp,编码149个氨基酸,预测蛋白质分子质量为16.85 kD,等电点为3.95。用在线软件SMART分析显示,MCaM-3蛋白含有4个Ca2+结合基序(EFh)结构域,可以结合Ca2+。同源分析表明,CaM基因在桑树与拟南芥、杨树、大豆、小麦、水稻、玉米各物种间具有很高的保守性。基于桑树和其它19个物种CaM基因的系统进化分析表明,桑树与蓖麻、烟草、大黄、樱桃的亲缘关系较近。半定量RT-PCR检测表明,与正常生长环境相比,MCaM-3基因mRNA的转录水平在低温、干旱、盐胁迫条件下均显著提高,初步推测MCaM-3基因与桑树的抗逆性有一定关联。     

蒙古冰草MwDREB3基因的克隆及表达分析

以蒙古冰草(Agropyron mongolicum)为研究材料,利用同源序列法克隆得到1个DREB3类转录因子基因,命名为MwDREB3,采用实时荧光定量RT-PCR技术分析MwDREB3 基因的表达特征,为蒙古冰草优异抗性基因的挖掘和利用提供理论依据.结果表明:该基因全长1056bp,包含1个完整的开放阅读框,长度为774bp,编码257个氨基酸,该蛋白近5'端含有1个保守的AP2结构域.系统进化树分析表明MwDREB3 编码的蛋白与小麦(Triticum aestivum)的DREB、山羊草(Aegilops columnaris)DRF1的进化关系较近.该基因在干旱、高盐、ABA诱导条件下,表达量上调;在低温条件下,表达量下调.     

日本结缕草ZjZFN1基因对拟南芥的转化及其耐旱性分析

锌指蛋白在植物干旱胁迫中起重要作用,尽管已经在各种植物中克隆并鉴定了编码这些蛋白质的基因,但是它们在日本结缕草中的功能和潜在的转录机制还不清楚。通过花序侵染法将ZjZFN1基因及其启动子转化拟南芥,并通过草铵膦/潮霉素抗性筛选和PCR鉴定,获得转基因株系。ZjZFN1的启动子能够驱动GUS基因的表达,在甘露醇处理下的GUS基因表达水平显著高于对照;在拟南芥中过表达ZjZFN1降低了种子发芽率,减弱了植物对干旱胁迫的适应性和植物在干旱胁迫下的生长状况;干旱处理后,转基因植株中的丙二醛含量高于野生型植株,而脯氨酸含量显著低于野生型植株;实时荧光定量分析表明对过表达ZjZFN1的拟南芥进行干旱处理后,POD、SOD、P5CS、LEA的表达水平降低,而APX的表达水平升高。ZjZFN1基因的过表达可减弱植物的耐旱性,为进一步开发利用该基因奠定基础。