水稻黄单胞菌水稻变种的rpfA基因的定位和次级克隆

水稻黄单胞菌水稻变种产生两种顺乌头酸酶（ＸｏｏＡｃａｎＡ和ＸｏｏＡｃａｎＢ）,编码ＸｏｏｃａｎＡ的ｒｐｆＡ基因已被克隆在重组质粒ｐＧＸＮ３０００中。本工作通过转座子Ｔｎ５Ｂ２０诱变ｐＧＸＮ３０００,鉴定了ｒｐｆＡ基因的位置及其转录方向,并进一步将含有完整ｒｐｆＡ基因的４．８ｋｂＡｓｐ７１８ＥｃｏＲⅠ片段次级克隆到了多用途载体质粒ｐＩＪ３２００。     

互补野油菜黄单胞菌野油菜致病型T113突变体胞外多糖产生的DNA …

以从野油菜黄单包菌野油菜致病型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐｓｔｒｉｓ）胞外多糖突变体Ｔ１１３中克隆的含转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５及共两侧相邻序列的１２．３ｋｂＥｃｏＲＩＤＮＡ片段为探针,从野生型菌株８００４中克隆以与突变位点的相对应的６．５ｋｂＥｃｏＲＩ片段,克隆于载体ｐＬＡＦＲ３上的该片段能反式互补突变株Ｔ１１３的胞外多糖产生,说明该片段上有含有至少一个与胞外多糖产生的     

互补野油菜黄单胞菌野油菜致病型T113突变体胞外多糖产生的DNA片段的克隆

以从野油菜黄单胞菌野油菜致病型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）胞外多糖突变体Ｔ１１３中克隆的含转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５及其两侧相邻序列的１２．３ｋｂＥｃｏＲＩＤＮＡ片段为探针,从野生型菌株８００４中克隆到与突变位点相对应的６．５ｋｂＥｃｏＲＩ片段,克隆于载体ｐＬＡＦＲ３上的该片段能反式互补突变株Ｔ１１３的胞外多糖产生,说明该片段上含有至少一个与胞外多糖产生有关的基因。     

苜蓿中华根瘤菌042B与公共结瘤基因nodABC有关的大片段物？…

将苜蓿中华根瘤菌０４２Ｂ总ＤＮＡ提取,用Ｓａｕ３ＡＩ部分酶切后回收２０－３０ｋｂ长的片段,以ｐＬＡＦＲ３为载体,构建基因文库。用苜蓿中华根瘤菌ｎｏｄＡＢＣ作探针,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交获得了三个阳性克隆Ａ,Ｂ和Ｃ,将这３个阳性克隆所携带的质粒分别命名为ｐＸＣＡ,ｐＸＣＢ,ｐＸＣＣ。在辅助质粒ｐＲＫ２０１３的帮助下,将这３个质粒分别转入ｎｏｄＣ＾－突变株ＡＫ１６５７后接种苜蓿,携带ｐＸＣＢ质粒的接合     

慢生型大豆根瘤菌nfe基因的分子克隆

ｎｆｅＣ基因是从慢生型大豆根瘤菌中克隆到的,与竞争结瘤有关的基因。本研究从慢生型大豆根瘤菌菌株ＧＸ２０１的ｐＬＡＦＲ３为载体的基因文库中,筛选出与ｎｆｅ同源基因克隆。以转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５诱变获得了ｇｕｓ基因表达的Ｔｎ５ｇｕｓＡ５插入突变质粒。     

在大肠杆蓖TG1中克隆和表达苏云金芽胞杆菌cryI基因

本研究分离并提纯苏云金芽胞杆菌８０１０菌株的质粒ＤＮＡ，经ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ双酶解后与ＤＩＧ标记的ｃｒｙＩ基因ＥｃｏＲＩ－Ｆ片段的ＲＮＡ探针杂交，显示出分子量分别为６．５６ｋｂ和４．４ｋｂ的阳性片段。用Ｂｌａｓｓｍｉｌｋ回收４．４ｋｂ的阳性片段并与双功能载体ｐＲＩＴ５重组，转化感受态大肠杆菌ＴＧ１细胞，通过斑点杂交和快检获得含４．４ｋｂ片段的克隆株Ｔ２，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳表明它表达了１３０ｋＤ     

鸡生长激素受体基因的克隆与部分序列分析

利用高盐法从鸡血中提取高分子量ＤＮＡ，以λＥＭＢＬ３为载体构建了鸡染色体文库，用鸡生长激素受体ｃＤＮＡ基因的部分序列作探针，从文库中筛选得到３个阳性克隆。通过对阳性克隆Ｉ插入片段的酶切和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，表明它含有全长的鸡生长激素受体基因，建立了该基因的限制性酶切图谱。将插入片段亚克隆到ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）质粒上，对含有基因５’端序列的２．５ｋｂＥｃｏＲＩ酶切片段进行了序列分析。     

不带抗药性基因的nifA质粒的构建

本研究克隆了萤光假单胞菌ＡＳ１．５５（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡＳ１．５５）的亮氨酸基因（ｌｅｕ＾＋）ＥｃｏＲＩ片段（－６．６ｋｂ）,并获得含有该片段的重组质粒ｐＢＲ３２２－ＬＥＵ。从ｐＢＲ３２２－ＬＥＵ质粒中分离出ｌｅｕ＾＋ＥｃｏＲＩ片段,将其插入到ｎｉｆＡ质ｐＭＣ７１Ａ的ＥｃｏＲⅠ位点使氯霉素抗性基因失活,从而构建了不带抗药性基因ｎｉｆＡ质粒ｐＭＣ７１Ａ－ＬＥＵ。     

指导的基因在动物乳腺特异性表达载体的构建

为了实现外源蛋白质在动物乳腺中特异性表达,采用ＰＣＲ法扩增了ＢＬＧ ３’端含第６,７外显子及ｐｏｌｙ（Ａ）加尾信号下游约２００ｂｐ的０．８７ｋｂ片断。以山羊ＢＬＧ ５’的３．２ｋｂ（含第１,２外显子）启动子,山羊ＢＬＧ ３’０．８７ｋｂ序列,鸡α－珠蛋白基因簇π基因上游的－２．４￣－５．３ｋｂ ＨｉｎｄⅢ序列,绿色荧光蛋白ＧＦＰ及原核载体ｐＧＥＭ－７ｚｆ构建了ｐＧＥＭ－７ｚｆ－ＧＦＰ－ＭＡＲ－５’     

慢生型大豆根瘤菌菌株GX201的脯氨酸脱氢酶基因(putA)的分子克隆

根据已报道的脯氨酸脱氢酶基因（ｐｕｔＡ）序列,通过ＰＣＲ方法,从慢生型大豆根瘤菌菌株ＧＸ２０１的总ＤＮＡ中扩增到—ＰＣＲ产物。序列分析表明,该ＰＣＲ产物的长度为４１８ｂｐ,与已报道的ｐｕｔＡ基因具有９３．５％的同源性。以广谱寄主范围质粒ｐＬＡＦＲ３为载体,在大肠杆菌ＤＨ５α中构建了ＧＸ２０１的基因文库,并以该ＰＣＲ产物为探针,从基因文库中筛选到一重组质粒ｐＧＸＮ３００。     

苏云金芽胞杆菌新菌株S184 cry1Ab基因的克隆

通过对ＧｅｎＢａｎｋ中ｃｒｙ１类基因序列的保守区进行分析,设计一对针对其保守区的引物Ｙ５－１（ＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＧＡＧＧ）和Ｙ３－１（ＧＣＴＧＴＧＡＣＡＣ ＧＡＡＧＧＡＴＡＴＡＧＣＣＡＣ）,对苏云金芽胞杆菌（Ｂａｘｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ,Ｂｔ）新菌株Ｓ１８４质粒ＤＮＡ进行扩增,得到一大小为１．５ｋｂ的ＤＮＡ片段,序列分析显示该片段与ｃｒｙ１因基因高度同源。以此片段为     

水稻白叶枯病黄单胞菌编码顺乌头酸酶的rpfA基因的鉴定

通过生化功能分析，证实了水稻白叶枯病黄单胞菌野生型菌株Ｔ３０００产生两种顺乌头酸酶（分别命名为ＸｏｏＡｃａｎＡ和ＸｏｏＡｃａｎＢ）。通过三亲本接合的方法，将获得的含水稻白叶枯病黄单胞菌ｒｐｆ基因簇的重组质粒ｐＧＸＮ３０００导入甘蓝黑腐病黄单胞菌ｒｐｆＡ基因突变体８４７６中。经生化功能分析证实，８４７６／ｐＧＸＮ３０００中含有水稻白叶枯病黄单胞菌的顺乌头酸酶ＸｏｏＡｃａｎＡ；同时还证实了ＰＧＸＮ３０００能互补８４７６，恢复其合成胞外酶和胞外多糖的能力及致病性．这表明在ＰＧＸＮ３０００中含有一个完整的水稻白叶枯病黄单胞菌的顺乌头酸酶基因，该基因具有类似甘蓝黑腐病黄单胞菌ｒｐｆＡ基因的功能．因此将该基因命名为水稻白叶枯病黄单胞菌ｒｐｆＡ基因。     

转座子报告基因Tn5gusA5诱变甘蓝黑腐病菌分离与致病相关的突变体

构建携带报告基因的转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５于广谱性ｃｏｓ质粒ｐＬＡＦＲ１上，利用Ｔｎ５ｇｕｓＡ５诱变野生型甘蓝黑腐病黄单胞菌，筛选与致病性有关的因子（胞外多糖，胞外酶）突变体，通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和报告基因ｇｕｓ表达验证，突变体是由转座子诱变所致。     

鼠伤寒沙门氏菌I相鞭毛蛋白基因fliC^i的克隆,鉴定

以提纯的鼠伤寒沙门氏菌８７０５染色体ＤＮＡ为材料，经ＥｃｏＲ Ｉ消化，过柱（ＳｅｐｈａｒｃｙｌＳ－４００），得到大于４００ｂｐ的酶切片段；然后随机克隆到质粒ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）中，转化大肠杆菌ＬＣ２ａ（ｈａｇ＾－，ｒｅｃＡ＾－）；在氨苄青霉素平板上共得到６０１３个转化子，从中筛选出１个有动力的克隆，小量制备质粒ＤＮＡ，经酶切电泳鉴定，该克隆的外源片段大小为１５．３ｋｂ，将其命名为ｐＧＩ４０１５。     

与黄原胶生物合成相关的"1.9" kb EcoRI DNA片段的序列测定分析

对Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ（下称Ｘｃｃ）８００４菌株染色体基因组中９．４ｋｂＨｉｎｄⅢＤＮＡ的“１．９”ｋｂＥｃｏＲＩ酶切片段的测序分析结果表明,该ＥｃｏＲＩＤＮＡ片段的实际长度为１．８８ｋｂ。在核苷酸水平上与Ｘｃｃ的ｇｕｍ基因有９８％的一致性;这一ＥｃｏＲＩ片段上有两个有意义的ＯＲＦ：ＯＲＦ１和ＯＲＦ２。ＯＲＦ１是一个不完整的ＯＲＦ;在氨基酸水平上,ＯＲＦ１和ＯＲＦ２的推断性编码产物蛋白分别与ｇｕｍＡ基因编码的ＧｕｍＡ及ｇｕｍＢ基因编码的ＧｕｍＢ蛋白有１００％的一致性。因此在１．８８ｋｂＥｃｏＲＩ片段上存在一完整的ｇｕｍＢ基因。     

固氮粪产碱菌基因文库的构建及ntrC的克隆

采用广泛寄主范围的粘粒载体ｐＬＡ２９１７构建粪产碱菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ的基因文库。以巴西固氮螺科菌Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ｎｔｒＣ ＤＮＡ为探针，经菌落杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交筛选获得含ｎｔｒＣ－ｌｉｋｅ基因的阳性克隆ｐＬＡＦ５８，建立了含ｎｔｒＣ同源序列的９．５ｋｂ ＳａｃＩ片段的物理图谱，采用巴西固氮螺菌ｎｔｒＢ ＤＮＡ探针杂交证明粪产碱菌ｎｔｒ     

盐单胞菌C6与耐盐有关DNA片段的克隆和序列分析

提取盐单胸菌（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）Ｃ６的总ＤＮＡ,用Ｓｑｕ３ＡⅠ部分酶切,回收１５－３０ｋｂ的ＤＮＡ片段,以ｐＬＡＦＲ３为载体在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α中构了该菌的基因文库。以Ｃ６的基因文库为供体,以费氏中华根瘤菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｆｒｅｄｉｉ）盐敏感菌株ＲＣ３－３＇为受体,在辅助质凿ｐＲＫ２０１３的协助下进行三亲本杂交,在选择培养基上筛选到接合子ＲＷＨ１５和ＲＷＨ１７。质粒检     

联合固氮遗传工程菌的田间释放与风险评价

应用遗传工程技术分别将含有ｎｉｆＡ＾ｃＤＮＡ片段的质粒及含有Ｔｎ５：：ｎｉｆＡ的广泛宿主自杀性质粒ｐＳＺ３６转入了三个联合固氮菌，即粪产碱菌，阴沟肠杆菌及催娩克氏菌中；把Ｔｎ５：：ｎｉｆＡ－ｎｔｒＣ转入了粪产碱菌野生型菌株Ａ１５０１。这些转化结合子在高铵下表现出固氮活性，并能集聚在水稻根表，而野生型菌在相同条件下远离水稻根表。这些菌株的田间释放实验在严格控制条件下进行，应用＾１５Ｎ稀释技术测定其固     

用接合转移方法构建杀虫防病荧光假单胞菌

以经过改造的含有转座子Ｔｎ５的自杀质粒ｐＳＵＰ２０２１为载体，通过接合转移将苏云金杆菌杀虫蛋白基因ｃｒｙ Ｉ Ａ（ｃ）片段插入生防细菌荧光假单胞菌Ｐ３０３菌株染色体组。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析分别证实杀虫基因的导入和杀虫蛋白的表达。室内生物测定结果表明新构建的ＰＴ２１０、ＰＴ２１２等荧光假单胞菌工程菌菌株不仅保持了野生型自然菌株对小麦全蚀病良好的抑菌活性，而且表现出对小菜蛾和玉米暝     

水稻白叶枯病黄单胞菌赖氨酰－tRNA合成酶基因的定位、克隆及分析

以３２Ｐ标记的甘蓝黑腐病黄单胞菌赖氨酰－ｔＲＮＡ合成酶基因为探针，将水稻白叶枯病黄单胞菌同功的基因定位于ｐＧＸＮ３０００１．６ｋｂ的ＢａｍＨＩ片段上．通过ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交，标记置换等方法初步证实：在稻白叶枯病黄单胞菌中只有一个拷贝的赖氨酰－ｔＲＮＡ合成酶基因，该基因失活对病菌是致死的。