IGF-Ⅰ、GH和CLA对脂肪前体细胞增殖、分化和基因表达的影响

为探讨类胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、生长激素(GH)和共轭亚油酸(CLA)对不同部位来源脂肪前体细胞的增殖和分化程度的影响,以大鼠(Rattus norveaicus)为实验模型,分别从附睾及皮下脂肪组织分离得到脂肪前体细胞,并在不同浓度的IGF-Ⅰ、GH和CLA处理后,用MTT法检测脂肪前体细胞的增殖,用油红O染色法检测脂肪前体细胞的分化聚脂程度。实验结果表明,各剂量IGF-Ⅰ和CLA均能够显著地促进大鼠附睾及皮下脂肪前体细胞的增殖与分化,但GH对大鼠附睾及皮下脂肪前体细胞的增殖与分化均无明显作用。为进一步观察IGF-Ⅰ和CLA对皮下脂肪组织的作用机制,实验采用半定量RT-PCR法检测细胞中PPARγ和C/EBPα基因表达水平,结果发现,100ng/mL IGF-I可显著上调大鼠脂肪前体细胞中PPARγ与C/EBPα基因表达水平;48ng/m LGH和100μmol/L CLA可显著促进PPARγ基因表达,但对C/EBPα mRNA表达无显著影响。结果示IGF-I可能主要通过上调PPARγ与C/EBPα基因的高水平表达进而促进大鼠脂肪前体细胞的分化,而CLA对脂肪前体细胞的作用在上调PPARγ的表达的同时,还作为PPARγ的配体激活该受体而发挥作用。     

表皮生长因子（EGF）对牛前脂肪细胞增殖和分化的影响

以分离新生牛腹股沟白色脂肪组织的前脂肪细胞进行原代培养为基础,采用MTT比色法和油红O提取比色法研究表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对牛前脂肪细胞增殖及分化的影响,同时通过半定量RT-PCR检测不同浓度EGF处理细胞第8天时对分化标志基因脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty-acid-binding protein,A-FABP)mRNA表达的影响.结果表明,10 ng/mL EGF能极显著地促进前脂肪细胞的增殖(P<0.01),在分化诱导后添加不同浓度的EGF在第8天均可促进脂肪细胞的分化,并能促进脂肪细胞分化标志基因LPL、PPARγ和A-FABPmRNA的表达.EGF可以促进牛前脂肪细胞的增殖和分化.     

miR-196a-1在3T3-L1脂肪细胞分化中的表达及作用

为研究miR-196a-1在脂肪形成中的作用,从3T3-L1细胞基因组中扩增miR-196a-1前体序列,构建miR-196a-1的表达载体,获得稳定表达miR-196a-1的3T3-L1细胞株,成脂诱导后检测脂肪细胞分化关键转录因子的mRNA表达和脂滴累积情况。结果表明,miR-196a-1在3T3-L1细胞分化过程中表达上调,在诱导分化的第2天达到高峰,并在之后的分化过程中恢复到正常水平;稳定表达miR-196a-1的3T3-L1细胞株中miR-196a-1的持续高水平表达导致脂肪形成关键基因过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)和脂蛋白脂酶(LPL)的mRNA水平及脂滴累积明显增加。这些结果指明,miR-196a-1促进3T3-L1脂肪细胞分化,利用所构建的稳定表达miR-196a-1的细胞株可进一步研究miR-196a-1调节脂肪形成的分子机制。     

西农萨能奶山羊PPARγ基因启动子结构与功能分析

过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)是核受体家族成员,作为配体激活型转录因子,在调控脂肪酸代谢和脂滴形成等方面发挥重要作用。为分析PPARγ基因启动子结构及功能,完善奶山羊(Capra hircus)乳脂代谢调控网络,本研究以西农萨能奶山羊全血DNA为模板,通过PCR技术扩增PPARγ基因5′侧翼序列,并克隆得到7个长度不同的缺失片段,分别连接pGL3-basic载体构建重组体,利用双荧光素酶报告系统检测各重组质粒活性,结合生物信息学分析确定其转录核心区域;并通过启动子定点突变和过表达CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT enhancer binding protein alpha,C/EBPα)研究转录因子C/EBPα对PPARγ基因的转录调控。结果表明,克隆得到的PPARγ基因启动子序列全长为2 328 bp(包含转录起始位点上游2 181 bp,GenBank登录号:MG770492.1),启动子上无典型的真核生物元件TATA框,但存在C/EBPα、肝X受体(liver X receptor,LXR)、胆固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element binding protein,SREBP)及特异性蛋白1(specificity protein 1,SP1)等多个转录因子结合位点;缺失片段分析结果表明,PPARγ基因启动子核心区域位于转录起始位点上游194~108 bp,且启动子上存在负调控元件;转录因子C/EBPα通过结合位于启动子上游119 bp处的C/EBPα结合元件而调控PPARγ基因的转录。本研究为后续开展PPARγ调控羊奶脂肪酸代谢的机理研究提供了资料。     

过表达miR-128a抑制大鼠前体脂肪细胞分化

为阐明miR-128a在大鼠前体脂肪细胞分化过程中的功能,本实验检测了大鼠(Rattus norvegicus)前体脂肪细胞成脂分化过程中miR-128a的表达,明确其在分化过程中的表达趋势;构建miR-128a的腺病毒过表达载体并侵染大鼠前体脂肪细胞,随后采用Real-time PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平检测了成脂标记基因过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)和脂肪酸结合蛋白2(adipocyte protein 2,aP2)的表达;过表达miR-128a的大鼠前体脂肪细胞在第10天进行油红O染色,从形态学上观察成脂分化情况.结果显示,miR-128a的表达量在脂肪细胞诱导分化第二天降到最低点,随后维持在第0天的水平.在过表达miR-128a后,大鼠前体脂肪细胞成脂标记基因PPARγ和aP2的蛋白表达量与对照相比显著下降,脂滴明显少于对照组.实验结果表明:在大鼠前体脂肪细胞中过表达miR-128a能够抑制前体脂肪细胞的分化;并且通过PPARγ mRNA和蛋白水平的差异性变化,结合miRNA的作用机理,推测PPARγ有可能是miR-128a的靶基因.本实验也为研究miR-128a在脂肪细胞分化中发挥作用的机理提供了理论基础.     

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路参与沉默信息调节因子1(Sirt1)抑制小鼠脂肪沉积

探讨沉默信息调节因子1(Sirt1)对小鼠脂肪沉积的抑制作用和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响。用Sirt1的激动剂白藜芦醇(100mg·kg-·1d-1)和抑制剂尼克酰胺(500mg·kg-·1d-1)灌胃处理小鼠(Mus mussulus)15d,记录小鼠体质量变化,测定小鼠皮下脂肪、附睾脂肪和肾周脂肪的沉积量,试剂盒测定血脂指标,同时利用Real-timePCR分析与脂肪生成密切相关的转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)和脂解基因甘油三酯水解酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)、围脂滴蛋白(Perilipin)及生脂基因脂肪酸合成酶(FAS)mRNA的表达水平,检测mTOR通路关键因子雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体S6蛋白激酶1(S6K1)和真核启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)mRNA表达水平。与对照组相比,白藜芦醇处理组小鼠体质量增加量和体脂含量均显著降低(P<0.01),血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL-C)浓度均显著降低(P<0.01),而高密度脂蛋白(HDL-C)浓度升高(P<0.01),mTOR通路关键因子mTOR、4EBP1和S6K1mRNA表达水平降低(P<0.01),脂代谢相关基因PPARγ、SREBP1及成脂基因FASmRNA表达水平显著降低(P<0.01),脂解相关基因ATGL、HSL和PerilipinmRNA表达水平显著升高(P<0.01);烟酰胺处理组小鼠体质量、附睾脂肪以与皮下脂肪沉积量增加缓慢(P>0.05),肾周脂肪沉积量增加(P<0.05),血清中LDL-C浓度升高(P<0.05),HDL-C浓度降低(P<0.01),mTOR通路关键因子mTOR和4EBP1mRNA表达水平升高(P<0.01),而脂代谢调控相关因子PPARγ和SREBP1mRNA水平升高(P<0.05),ATGLmRNA表达量显著降低(P<0.05),FAS、HSL和PerilipinmRNA表达量变化不显著(P>0.05)。表明激活Sirt1可减少脂肪合成,增加脂肪分解,从而降低体脂沉积,而mTOR信号通路参与这个过程。     

CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)与脂蛋白酯酶(LPL)基因在不同尾型绵羊品种尾部脂肪组织中的表达

本研究旨在发现CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)和脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)基因的表达对绵羊尾部脂肪含量的影响。本研究根据NCBI上牛(Bos taurus)C/EBPα基因(GenBank登录号:NM_176784.2)全长设计引物,克隆C/EBPα基因CDs序列,并用生物信息学方法分析序列和蛋白的特征;分别采用实时荧光定量PCR技术和Western blot技术检测C/EBPα和LPL基因在9月龄陕北细毛羊(长瘦尾型)、同羊(长脂尾型、短脂尾型)、西藏羊(短瘦尾型)、滩羊(长脂尾型)和哈萨克羊(肥臀型)5个品种绵羊(Ovis aries)共计18个个体的尾部脂肪组织中mRNA与蛋白的表达水平。结果表明,绵羊C/EBPα基因(GenBank登陆号:KF830871)编码区序列全长1 062 bp,编码353个氨基酸,理论等电点为7.25,相对分子量为37.15 kD,与牛C/EBPα基因的相似性达99%,其编码的蛋白含一个典型的亮氨酸拉链结构;C/EBPα和LPL蛋白与mRNA表达趋势大致相同,均在脂尾型(同羊和滩羊)和肥臀型(哈萨克羊)绵羊尾部脂肪组织中具有较高的表达水平,而在瘦尾型(陕北细毛羊和西藏羊)绵羊尾部脂肪中具有相对较低的表达水平,且在同一品种内,同羊长脂尾型尾部脂肪中C/EBPα和LPL mRNA与蛋白表达水平均显著高于短脂尾型(P0.05)。本研究成功克隆绵羊C/EBPα基因编码区序列全长,证明C/EBPα和LPL基因表达水平与绵羊尾部脂肪的沉积有显著相关性,为进一步探寻阻断尾部脂肪过度沉积的机制,实现既能节约饲养成本又能充分发挥本品种的优良生产性能这一目的提供基础资料。     

日粮共轭亚油酸对黄羽肉鸡腹脂沉积的影响及机理研究

选择1日龄黄羽肉鸡60只,随机分成2组。在实验组中添加3%共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA),对照组日粮中添加3%的食用菜籽油。49日龄屠宰,采集腹部脂肪组织。用RT-PCR方法,以β-actin为内标,相对定量测定腹脂中鸡生长激素受体（cGHR）、胰岛素样生长因子-1（cIGF-1）、胰岛素样生长因子Ⅰ型受体（cIGF-ⅠR）、过氧化物增殖剂活化受体γ（cPPARγ）、脂联素（cAdiponectin）及其Ⅰ型受体（cAdipoⅠR）的mRNA丰度。结果显示：CLA处理使肉鸡的腹脂沉积下降了20.93%（P<0.05）,分别使腹脂中鸡cGHR mRNA和cPPARγ mRNA降低了24.74%（P<0.05）和66.52%（P<0.01）;而对cIGF-1、cIGF-ⅠR、cAdiponectin、cAdipoⅠR 基因表达无显著影响（P>0.05）;数据提示：CLA降低肉鸡脂肪沉积的作用可能通过GH途径和PPARγ通路介导,而与IGF-1和（或）GH-IGF-1途径、Adiponectin 的作用无关。     

猪成熟脂肪细胞分离培养及去分化研究

成熟脂肪去分化技术可为研究脂肪细胞分化提供均一的前体脂肪细胞。本研究分离培养了猪成熟脂肪细胞,并去分化为前体脂肪细胞。本实验采用Ⅱ胶原酶消化后离心分离1~3日龄仔猪(Susscrofa)皮下脂肪组织,天花板法培养获得成熟脂肪细胞。显微镜下观察脂肪细胞去分化形态学变化,并在成脂诱导培养液的作用下诱导再分化。采用油红O染色法检测分化不同时期细胞脂滴聚集效率,脂滴的累积随诱导的进行不断增加。RT-PCR检测成熟脂肪细胞标志基因过氧化物酶体增殖物活化受体(PPARγ)和和脂肪酸结合蛋白4(FABP4)的mRNA相对表达量,分化早期基因表达水平较低,其表达水平在分化过程中持续增高,在分化后期PPARγ相对表达量与诱导分化前增加了2.8倍,FABP4增加了约62倍(差异显著P<0.05)。说明去分化获得的前体脂肪细胞在成脂诱导培养液作用下,可有效地分化为成熟脂肪细胞。本研究优化了猪成熟脂肪细胞分离和培养体系,并通过去分化获得具有再分化能力的前体脂肪细胞,为进一步深入研究猪脂肪细胞分化与代谢提供技术平台。     

Conjugated linoleic acid regulates phosphorylation of PPARγ by modulation of ERK 1/2 and p38 signaling in human macrophages/fatty acid-laden macrophages

Stimulation of macrophages by a variety fatty acids causes activation of MAP kinases (MAPKs). The consequences arising from down-regulation of MAPKs may be a limitation in the activity of PPARγ, which is modulated by a modification catalyzed by these kinases. Phosphorylation of MAP kinases-ERK1/2 and p38 as well as PPARγ was determined by real-time polymerase chain reaction and Western blotting in human macrophages cultured with conjugated linoleic acids (CLAs). We demonstrated that CLA isomers alter MAP kinase phosphorylation and PPARγ activation. Phosphorylation of ERK1/2 was diminished in cells cultivated with cis-9,trans-11 CLA, whereas phosphorylation of p38 was reduced by trans-10,cis-12 CLA. PPARγ was phosphorylated mainly by ERK1/2, and consequently, PPARγ phosphorylation was suppressed mainly by cis-9,trans-11 isomer. In human adipocytes, cis-9,trans-11 C 18:2 raised the activation of PPAR and several of its downstream target genes. We suggest that a similar process may also occur in human macrophages.     

慢病毒介导shRNA干扰颗粒体蛋白前体(GRN)促进猪前体脂肪细胞分化

为研究颗粒体蛋白前体(granulin,GRN)在脂肪细胞发育过程中的作用,本实验构建了GRN短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒干扰载体,包装并感染猪前体脂肪细胞,采用油红O染色、油红O提取比色法检测猪前体脂肪细胞分化情况,采用Real-time PCR法检测成脂关键基因mRNA的表达变化情况。结果显示,GRN慢病毒干扰载体病毒滴度在5×107TU/mL以上,病毒感染前体脂肪细胞后显著降低了GRN的表达,shRNA2干扰效率最高,达到76%,沉默GRN后能够促进猪前体脂肪细胞分化;脂肪细胞分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、固醇调节原件结合蛋白(SREBP-1c)、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(ap2)和脂蛋白酯酶(LPL)基因mRNA表达量均升高。结果表明,降低GRN基因表达促进了猪前体脂肪细胞分化,揭示GRN在猪前体脂肪细胞分化过程中可能起到抑制作用。     

成年鲁西牛肌内前脂肪细胞的分离培养

建立牛肌内前脂肪细胞体外培养方法，旨在更深入地研究组成肌肉内脂肪组织的肌内前脂肪细胞的增殖分化特性及其影响因素。选取来自成年育肥鲁西黄牛第6与第7肋骨间的肌肉内脂肪组织，利用Ⅰ型胶原酶消化法分离获得牛肌内前脂肪细胞。培养出的细胞成分均一，增殖旺盛，分化率高，经形态学动态变化观察、生长曲线、油红O脂肪染色提取法及对胰岛素和地塞米松反应的测定，证明是功能活跃的前脂肪细胞，并在体外重现了其增殖分化过程，同时经染色体核型分析证明体外培养的细胞倍性正常，可以用于后续研究。本试验成功分离得到了成年育肥牛肌内前脂肪细胞，这为下一步研究肌内脂肪的沉积机制，改善牛肉品质奠定了基础。