牦牛PrP c基因克隆与序列分析

朊病毒(prion)可引起人和动物的一系列神经退化性疾病，包括羊瘙痒病(serapie)、牛海绵状脑病(BSE)、人克雅氏病(CJD)等，这些疾病的共同特征是导致人和动物产生意识和运动功能的严重衰退直至死亡。正常朊蛋白(PrP^c)基因结构如何引起蛋白三维构象的变化及其构象病产生的机理尚不清楚，但朊蛋白病的潜伏期、个体敏感性、种间屏障等都与PrP^c基因结构的多态性相关。有学者报道了人、鼠、羊PrP^c基因多态性对朊病毒病的连锁关系。     

朊蛋白基因敲除无启动子打靶载体的构建策略

基因敲除是建立在同源重组技术基础之上的一种定点修饰基因组的实验方法,其与体细胞核移植技术的成功结合,已经成为一种有效的定点修饰、改造大动物基因组DNA片段的实验策略。朊蛋白是传染性海绵状脑病的致病蛋白。目前,在小鼠和绵羊中已经成功获得朊蛋白基因敲除的动物,但在牛中尚未有成功的报道。文章旨在介绍牛朊蛋白基因敲除无启动子打靶载体的构建过程及技巧,以为将来利用核移植技术生产敲除朊蛋白基因的克隆牛提供依据。     

添加西兰花种子水提物改善腊肉色泽和风味提高抗氧化性

为了分析西兰花种子提取物（Brassica oleracea L. seed extract,BSE）的体外抗氧化能力,以及其在广式腊肉中的应用效果,该文对不同BSE添加量的应用效果进行了分析,并与添加2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene,BHT）的应用效果进行了比较。基于基础配方,共制备了对照组（CT）、添加0.2% BSE组（0.2% BSE）、添加0.5% BSE组（0.5% BSE）、添加1% BSE组（1.0% BSE）、添加1.5% BSE组（1.5% BSE）和添加0.02% BHT组（BHT）6组样品。研究结果显示,BSE的体外总抗氧化能力与其在水溶液中的含量成正比;在脂质体系条件下,BSE的抑制诱导氧化作用呈现为先增加后降低的趋势,相比于1.0%添加量,添加量为1.5%时,样品的抑制诱导氧化作用明显降低（P<0.05）;相比于BSE,BHT具有明显的抑制氧化作用（P<0.05）;随着BSE添加量的增加,样品的硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance,TBARS）值呈现为降低的趋势,BHT样品TBARS值介于1.0%BSE和1.5%BSE样品之间;各加工方案样品均具有明显的主体特征风味,添加BHT样品的主体风味与其它样品有明显差异;1.5%BSE样品具有最高的亮度值（L*）和黄度（b*）,BHT样品具有最高的红度（a*）;通过对挥发性风味物质的分析结果显示,挥发性成分随添加方案的不同而各有差异。综合结果显示,添加1.5% BSE广式腊肉具有较理想的色泽、氧化状态和风味物质含量,可以替代BHT使用。     

利用RNA干扰抑制牛胎儿成纤维细胞中朊蛋白基因prnp的表达

疯牛病是由朊蛋白基因prnp编码的正常朊蛋白PrPc发生构象变化为致病性朊蛋白PrPsc而引起的传染性疾病,PrPsc在中枢神经的聚集引发了动物的传染性海绵状脑病.降低(下调)PrPc的表达量使其减少向PrPsc转化,是抑制疯牛病的有效途径.本研究利用RNAi技术,针对牛源cDNA序列设计了3段PrPc干扰序列及一个阴性对照,将其连接到RNA干扰载体pGenesil-1上,转染牛胎儿成纤维细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测有干扰序列的有效性,并用700μg/mL G418对细胞进行药物筛选.结果表明,3对干扰片段的抑制效率分别是51.2%、85.7%和74.6%,阴性对照的干扰效率是2.05%,得到了一个较为有效地干扰片段,并且筛选出了稳定转染的细胞单克隆,为进一步的体细胞核移植提供供体细胞.     

牛过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)基因第5外显子多态性与胴体、肉质性状的相关性

利用PCR-SSCP结合DNA测序方法对牛（Bostaurus）6个品种（秦川牛、南阳牛、郏县红牛、鲁西牛、安格斯和夏南牛）共计717个个体的过氧化物酶体增殖激活受体α（PPARα）基因第5外显子的SNP位点进行检测,并分析了该SNP位点与秦川牛的部分胴体、肉质性状的相关性。结果显示,在PPARα基因第5外显子的138bp处发生T→C突变。卡方检验结果显示,秦川牛和南阳牛处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P〈0.05）;南阳牛、郏县红牛、安格斯和鲁西牛处于Hardy-Weinberg平衡状态（P〉0.05）。多态信息含量（PIC）显示,这6个品种均属于中度多态（0.25〈PIC〈0.50）。相关分析结果显示,在背膘厚和眼肌面积指标中AA型个体对于秦川牛肉质有显著影响（P〈0.05）;而在系水力指标中BB型个体显著优于AA和AB型个体（P〈0.05）。这些结果提示,该位点突变可能是影响牛肉背膘厚、眼肌面积和系水力的主效QTN或与之紧密连锁,可作为肉牛产肉性状的辅助选择标记。     

谷朊粉基共混黏合体系的构建及在素肉饼中的应用

谷朊粉经水合作用形成面筋蛋白（Wheat Gluten Protein，WGP）网络结构，具有良好的黏弹性和延展性，但加热后其网络结构易破裂，稳定性较低。该研究利用谷朊粉、大豆分离蛋白（Soy Isolated Protein，SPI）、甲基纤维素（Methylcellulose，MC）、谷氨酰胺转氨酶（Glutamine Transaminage，TG酶）的原料特性，建立植物蛋白、亲水胶体、促凝胶酶的共混黏合体系，研究各组分对其理化性质、凝胶特性及结构的贡献和影响。结果表明，随着三种原料依次递进加入WGP，混合体系中二硫键含量分别较前一组降低81.03%、升高248.50%和0.70%，游离巯基含量升高68.79%、降低28.90%和20.44%，表面疏水性升高5.33%、降低6.85%、再升高17.17%，高分子量麦谷蛋白组分分子量则逐渐增加；持水性升高5.07%、2.91%、2.79%，凝胶强度升高104.14%、24.66%、3.52%；共混凝胶的储能模量和损耗模量均逐渐升高；TG酶加入后，阻止了α-螺旋逐渐向β-转角、无规则卷曲的转化，α-螺旋和β-折叠含量上升。可见共混黏合体系凝胶的分子间缠结点增多、凝胶性变强。虽然SPI的添加部分破坏了WGP网络结构，但SPI、MC、TG酶增加了蛋白的聚集程度和凝胶强度。扫描电镜观察显示，SPI镶嵌在WGP网络骨架中，形成半网络半填充的新架构形式；随着MC和TG酶的依次加入，在形成大量交联丝状结构的基础上，局部形成连续膜状结构将大豆拉丝蛋白（Soy Drawing Protein，SDP）粒子覆盖。说明SDP粒子被完整、紧密地包裹于谷朊粉-SPI-MC-TG酶共混黏合体系中。利用此黏合体系制成SDP基素肉饼，依次向复水SDP中添加四种原料，显示素肉饼的硬度、内聚性、咀嚼性和弹性等均得以提升。因此，该研究建立谷朊粉基共混黏合体系是改善SDP为主要原料的素肉制品品质的有效方法。     

用荧光染料（Hoechst 33342）和激光处理精子对牛卵母细胞体外受精的影响

用流动细胞计数法分离牛的Ｘ，Ｙ精子，需要对精子进行活体荧光染色及激光照射处理。本研究进行２个实验，以探索荧光染料（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）和激光对牛精子以及牛卵母细胞的体外受精和胚胎的体外培养的影响。实验１包括４个精子处理组：（１）０处理组（对照组）；（２）染色组，用９ｍｇ／Ｌ的Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２对精子进行染色；（３）激光照射组，用强度为１５０ｍＷ的激光对精子进行照射；（４）染色及激光照射组，综合（２）和（３）的处理。实验２用不同浓度的Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２处理精子，以研究染料浓度与体外受精效果的关系。实验结果表明，Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２作用于精子之后，能显著降低牛卵母细胞体外受精后的分裂率、囊胚率、一级囊胚率、囊胚孵化率及胚胎发育速度，而且降低的幅度随着染料浓度的升高而增加（卵裂率除外）。精子经激光照射后对体外受精的效果没有显著影响。     

牛分离精子对体外受精的影响

本研究的目的是测定流动细胞分离仪的精子对牛卵母细胞体外受精和胚胎发育的影响。共使用了4273个牛的卵母细胞和3种类型的精子（分离、染色未分离和未染色未分离）进行体外受精试验。这些精子分别来自于3头公牛，每头公牛重复试验3－5次，数据使用ANOVA程序进行统计分析。结果显示，用3种类型精子受精后的卵母细胞囊胚率无显著差异，分别为20．4％，22．62％和22．14％，但用分离精子受精后的卵裂率显著低于未分离的精子（53．66％比71．93％，P＜0．05）。所测度的3头公牛的卵裂率和囊胚率在不同公牛之间有所差异，H008号公牛所产生的囊胚明显低于H010号公牛组（分别为17．4％比25．1％，P＜0．05）。结果证明分离过程或染色并没有影响胚胎发育，流动细胞分离仪可以有效地用于牛胚胎的体外生产。此外，分离、染色未分离和未分离精子的受精和胚胎发育率，在不同公牛之间有差异的这一发现表明，选择能产生高质量精子的公牛精液进行精子分离，可以提高体外受精的效率。     

低氧下牦牛、黑白花牛肾间质成纤维细胞PDK1、Smad2、Caspase3等因子表达差异研究

为了比较低氧条件下不同海拔牛种肾间质成纤维细胞（RIFs）内PDK1、Smad2、Caspase3等因子的表达差异及细胞增殖差异,并进一步探究牦牛肾脏的高原低氧适应性特点,本研究采用牦牛和黑白花牛RIFs作为研究对象,低氧（1%O2）处理后,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹（WB）法检测细胞内PDK1等因子表达差异。波形蛋白（Vimentin）免疫组化染色鉴定结果显示,两种牛的原代RIFs纯度较高,可用于后续试验。低氧处理后,两种牛的RIFs内PDK1、Smad2及Caspase3的mRNA和蛋白表达均存在不同程度上调,且种属间存在显著差异（P<0.05）,牦牛HIF-1α、PDK1、Smad2及Caspase3等基因表达量于24 h达到峰值,之后下调,而黑白花牛基因则随时间呈递增趋势,且牦牛RIFs低氧下增殖能力低于黑白花牛。综上所述,低氧诱导的相关转录因子表达存在差异,两种牛RIFs的增殖能力存在差异,这可能是导致低氧下黑白花牛肾纤维化程度的加深,从而产生肾源性高原疾病的原因之一。本研究为比较不同海拔牛种肾脏的低氧适应性研究提供了基础数据,为探索牦牛肾脏...     

棉铃虫法胱氨酸蛋白酶底物特异性研究

为了研究棉铃虫（Helicoverpa armigera）半胱氨酸蛋白酶的底物专一性，进一步阐明该蛋白酶的性质和应用前景，从棉铃虫卵巢中 化了该蛋白酶，用电泳方法检测了该蛋白酶对牛血红蛋白（Hb）、牛血清蛋白（BSA）、卵黄磷蛋白（Vn）、明胶（gelatin）等4种动物蛋白，及大事产、玉米、马铃薯、豇豆、向阳花种子及棉籽蛋白等6种植物蛋白的水解作用，结果显示该酶对4种埃6种植物蛋白都有明显水解活性。用吸光度测定法测定了棉铃虫半胱氨酸蛋白酶对牛血红蛋白，牛血清蛋白、卵磷蛋白、明胶等4种底物的米氏常数（Km）值。结果显示棉铃虫半胱氨酸蛋白酶对牛血红蛋白和卵磷蛋白的水解产物的吸光度值较高，而对牛血清蛋白和明胶的水解产物的吸光度值较低。 测得该蛋白酶对牛血红蛋白、牛血清蛋白的水解产物的吸光度值较高，而对牛血清蛋白和明胶的水解产物的吸光度值较低。测得该蛋白酶对牛血红蛋白、牛血清蛋白、卵黄磷蛋白、明胶的Km值分别为10、0.91、0.08μmol/L和250mg/L，其中对卵黄磷蛋白的Km值最小，说明棉铃虫半胱氨酸蛋白酶与卵黄磷蛋白的亲和力量大，即卵黄磷蛋白是棉铃虫半胱氨酸蛋白酶的最适底物，同时用电泳方法检测了该蛋白酶对粗提的棉铃虫卵黄磷蛋白的水解作用，结果显示该酶对其有明显水解活性，由此推测该酶可能参与棉铃虫胚胎发育中卵磷蛋白的水解。     

中国牛科主要饲养品种朊蛋白基因种系发生分析

朊蛋白基因编码蛋白的具体生理功能还不清楚,但脑组织细胞中朊蛋白(PrPc)的异常构象形式(PrPc)的累积会引起传染性海绵体脑炎的发生.对于类似的蛋白构象病,与传统分类方法相比,以其基因序列进行种系发生分析将能够为该病种间(或品种间)的传播屏障的预测提供更为可靠的依据(van Rheede et al.,2003).     

Characterization of Protein Fractions of Rice Bran to Devise Effective Methods of Protein Solubilization

Proteins from the defatted brans of representative rice cultivars were fractionated into albumins, globulins, prolamins, and acid-soluble glutelins, accounting for 34, 15, 6, and 11% of the total bran proteins, respectively. The remaining insoluble residue protein, after treatment with 0.1M sodium hydroxide, resulted in the solubilization of 95% of the residue protein, representing 32% of the total bran protein. The relative molecular mass (M_r) values determined by size-exclusion HPLC were 10–100 kDa, 10–150 kDa, 33–150 kDa, and 25–100 kDa for the fully dissociated polypeptides of albumins, globulins, prolamins, and acid-soluble glutelins, respectively. Despite a breakdown of disulfide bonds of the residue protein during sodium hydroxide solubilization, the M_r of the majority of the fully dissociated polypeptides of this fraction ranged from 45 to 150 kDa. Insolubility of residue protein was due mainly to its strong aggregation and extensive disulfide bond cross-linking. Efficient methods may be developed for solubilizing up to 98% of rice bran protein by the use of dissociating and disulfide breaking agents currently in use in the food industry.     

Heat-Induced Fragmentation of the Maize Waxy Protein During Protein Extraction from Starch Granules

The starch granule of maize contains a characteristic set of tightly bound polypeptides. Granule-associated polypeptides are typically extracted from starch granules by heating starch granule suspensions at 90–100°C in a detergent such as SDS. Solubilized proteins are recovered by centrifugation and analyzed by gel electrophoresis. Previously identified tightly bound granule intrinsic proteins consist of the 85-kDa starch-branching enzyme IIb, the 76-kDa starch synthase I, and the 60-kD waxy (Wx) protein, also known as granule-bound starch synthase I. However, SDS extracts from starch granules of maize also contain a cluster of proteins ranging in mass between 47 and 32 kDa In this study, we analyzed this group of granule-associated proteins and found that each was recognized by the Wx antibody. A 15 amino acid N-terminal sequence from the 47-kDa polypeptide was identical to the predicted N-terminus of the Wx protein. Further analysis revealed that each immunoreactive polypeptide between 47 and 32 kDa was a heat-induced fragmentation product of the Wx protein. Conditions for the extraction of granule proteins were evaluated. Our results demonstrate that granule proteins are effectively released by mild extraction (10-min incubation at 72°C). Relative to the Wx protein, starch synthase I and starch branching enzyme IIb were less susceptible to thermal fragmentation. These results demonstrate that the 85-, 76-, and 60-kDa polypeptides are authentic granule-intrinsic proteins, and that the majority of polypeptides between 47 and 32 kDa are artifacts of high-temperature granule extraction procedures.     

绿色荧光蛋白的改进

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP)，是细胞生物学和分子生物学研究的一个重要的工具，已得到广泛的应用。为了进一步提高GFP的利用，TFP在几个方面得到了改进：（1）基因优化，包括去除隐蔽性内含子，在隐蔽内含子的结合位点引入植物内含子，合成密码子用于优化新基因，对GFP进行环状序列改变。（2）通过氨基酸替换提高GFP脱辅基蛋白在高温，如37℃条件下的正确折叠，以及改变GFP光谱特性。此外，把GFP和定位序列融合，能够提高它的亚细胞定位，从而减少毒性和增加荧光。     

Protein resources of wildSecale species

Summary The aim of this study was to find the eventual sources of increased protein content and of the changed balance between exogenic amino acids in caryopses protein of 9 wildSecale species (S. chaldicum Fed.,S. Kuprijanovii Grossh.,S. anatolicum Boiss.,S. montanum Guss.,S. silvestre Host,S. ancestrale Zhuk.,S. afghanicum Vav.,S. dighoricum Vav.,S. segetale Roshev.). A comparison was completed between the previous cited wild species and low and high protein rye cultivars ofS. cereale L. species, from the point of their amino acid composition and the ultrastructure of endosperm proteins. The wild species surpassed the cultivated varieties in protein content, useful protein content, and as much as twice the direct amount of some of the most important, from a nutritional point of view, amino acids, e.g. lysine or methionine. The first limiting amino acids were for wild species isoleucine, threonine and lysine. The wild species with the highest protein content differed significantly from the cultivated species in the amounts of protein matrix surrounding the starch granules in the deeper layers of endosperm cells.

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Proteinressourcen vonSecale-Wildarten

Zusammenfassung Von 9Secale-Wildarten (S. chaldicum Fed.,S. kuprijanovii Grossh.,S. anatolicum Boiss.,S. montanum Guss.,S. silvestre Host,S. ancestrale Zhuk.,S. afghanicum Vav.,S. dighoricum Vav.,S. segetale Roshev.) wurde das Protein der Karyopsen daraufhin untersucht, ob es darunter Sippen mit einem verbesserten Proteingehalt und einem geänderten Verhältnis von exogenen Aminosäuren gibt. Die genannten Wildarten wurden mit proteinreichen und proteinarmen Zuchtsorten vonS. cereale L. hinsichtlich der Aminosäure-Anteile und der Ultrastruktur des Endosperm-Proteins verglichen. Die Wildarten übertrafen die Zuchtsorten im Eiweißgehalt und im 'nutzbaren Eiweißgehalt und enthielten etwa die doppelte Menge der (unter dem Gesichtspunkt der Ernährung) wichtigsten Aminosäuren, wie Lysin und Methionin. Die ersten limitierenden Aminosäuren waren für die Wildarten Isoleucin, Threonin und Lysin. Die Wildarten mit dem höchsten Proteingehalt unterschieden sich signifikant in den Ausmaßen der Proteinmatrix, die die Stärkekörner von tiefer gelegenen Endospermzellen umgibt, von der Kulturart.

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Secale L.

(S. chaldicum Fed., S. kuprijanovi Grossh., S. anatolicum Boiss., S. montanum Guss., S. silvestre Host, S. ancestrale Zhuk., S. afghanicum Vav., S. dighoricum Vav., S. segetale Roshev.) ë . S. cereale L., , , . , , ( ) , . , . , ë .

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Presented as poster

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The authors thank M.Mauszyska and R.Izdebski for propagation of rye materials used in this research.     

板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光蛋白共定位载体的构建

低毒病毒-板栗疫病菌组合是研究病毒与宿主相互作用的一个优秀的模式系统。我们构建了含绿色荧光蛋白基因gfp的载体pCPXHY2GFP与含红色荧光蛋白基因rfp的载体pCPXG418RFP,并用于转化野生型菌株EP155,获得了以潮霉素为筛选标记、表达绿色荧光蛋白的转化株pCPXHY2GFP/EP155和以G418为筛选标记、表达红色荧光蛋白的转化株pCPXG418RFP/EP155。将载体pCPXG418RFP转化pCPXHY2GFP/EP155,获得的转化株能观察到绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白共定位的现象。板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光共定位载体pCPXHY2GFP与pCPXG418RFP的构建,为深入研究病毒与宿主相互作用的分子机制提供了强有力的研究材料。     

Levels of Protein and Protein Composition in Hard Winter Wheat Flours and the Relationship to Breadmaking

Protein and protein fractions were measured in 49 hard winter wheat flours to investigate their relationship to breadmaking properties, particularly loaf volume, which varied from 760 to 1,055 cm³ and crumb grain score of 1.0–5.0 from 100 g of flour straight‐dough bread. Protein composition varied with flour protein content because total soluble protein (SP) and gliadin levels increased proportionally to increased protein content, but albumins and globulins (AG), soluble polymeric proteins (SPP), and insoluble polymeric protein (IPP) levels did not. Flour protein content was positively correlated with loaf volume and bake water absorption (r = 0.80, P < 0.0001 and r = 0.45, P < 0.01, respectively). The percent SP based on flour showed the highest correlation with loaf volume (r = 0.85) and low but significant correlation with crumb grain score (r = 0.35, P < 0.05). Percent gliadins based on flour and on protein content were positively correlated to loaf volume (r = 0.73, P < 0.0001 and r = 0.46, P < 0.001, respectively). The percent IPP based on flour was the only protein fraction that was highly correlated (r = 0.62, P < 0.0001) with bake water absorption followed by AG in flour (r = 0.30, P < 0.05). Bake mix time was correlated positively with percent IPP based on protein (r = 0.86) but negatively with percent SPP based on protein (r = ‐0.56, P < 0.0001).