刺槐EST-SSR标记PCR反应体系的优化

为建立一套适用于刺槐EST-SSR标记的PCR反应体系,采用L₁₆(4⁵)正交试验设计结合单因素试验,对刺槐EST-SSR PCR反应体系中的5个主要因素：引物、DNA模板、dNTPs、Mg²⁺和Taq DNA聚合酶进行优化试验。结果表明：在20μL反应体系中,各反应因素的最佳水平为0.5μmol/L引物、30 ng模板DNA、0.15 mmol/L dNTP、0.5 mmol/L Mg²⁺、1.0 U Taq DNA聚合酶。利用随机挑选的3个刺槐优良无性系品种和7对EST-SSR引物对优化体系进行验证,结果均能获得稳定、清晰的条带,证明该体系稳定可靠。此优化体系的建立为刺槐EST-SSR标记的开发以及利用EST-SSR标记深入研究和利用中国刺槐种质资源奠定基础。     

辣椒SRAP-PCR反应体系主要影响因素的单因素和正交设计优化

SRAP标记是一种新的分子标记技术,建立和优化所研究物种的SRAP反应体系是应用SRAP标记的技术关键.本研究以3个辣椒品种为试验材料,采用单因素试验设计对辣椒SRAP-PCR反应体系的5个主要影响因子(Taq 酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物浓度)设置8个不同的水平梯度,筛选出比较适宜的Mg2+、dNTP、Primer、Taq酶、模板DNA浓度的范围.在此基础上,进一步采用L16(45)正交设计对辣椒SRAP-PCR反应体系的五因素在四个水平上进行优化实验,得出了如下的优化体系:25μl体系中包含1.5 mmol/L的Me2+、0.2 mmol/L的dNTP、0.1μmol/L的单条引物、1 U的Taq酶和60 ng的模板DNA.经用24个辣椒材料进行扩增验证,该体系检测的结果重复性好,稳定性强.因此,本试验所获得的优化体系适用于辣椒的SRAP分子标记研究.     

花椰菜EST-SSR反应体系的优化

为获得花椰菜EST-SSR优化扩增体系,本研究以‘喜美’花椰菜为材料,采用单因素试验对EST-SSR反应体系的Mg2+、d NTP、Taq酶、引物和DNA浓度分别进行优化。研究结果表明,花椰菜EST-SSR25μL优化反应体系为:2.5μL 10×Buffer,2.0 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L d NTP,1 U Taq酶,0.56 mmol/L引物,100 ng DNA。利用该反应体系,选用引物EST529-1在10个花椰菜品种中进行优化反应体系的验证。结果显示扩增产物条带清晰明亮、多态性丰富且特异性强、重复性好,表明本研究所确定的反应体系适用于花椰菜的EST-SSR分子标记。     

食用向日葵SSR-PCR反应体系的优化

为建立食用向日葵分子标记反应体系,以食用向日葵四叶期叶片为DNA模板提取材料,采用单因素试验和正交试验设计,对SSR-PCR反应体系中的6因素(10×PCR Buffer、Mg2+、d NTPs、引物、Taq DNA聚合酶和DNA模板)在5水平上进行正交优化试验,并比较了不同浓度Mg2+、Taq DNA聚合酶、模板DNA对扩增效果的影响,结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响为Mg2+Taq DNA聚合酶(引物)DNA模板10×PCR Bufferd NTPs。最终建立食用向日葵SSR-PCR最佳反应体系为:在总体系为20μL的SSR-PCR反应体系中包括10×PCR Buffer 0.2mmol/L、Mg2+2.0 mmol/L、d NTPs 1.8 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.2 U、DNA 50 ng、引物1.5 mmol/L。     

万寿菊雄性不育系SRAP-PCR体系建立与优化

本研究以万寿菊雄性不育系2-2基因组DNA为试验材料,采用单因素和L16(45)正交设计对SRAPPCR反应体系的Mg2+、d NTPs、Taq酶、引物和模板DNA浓度进行优化,以得到最佳的SRAP-PCR反应体系。结果表明最佳反应体系为:20μL体系中Mg2+2.0 mmol/L、d NTPs 0.3 mmol/L、Taq酶0.75 U、引物0.2μmol/L、模板DNA 80 ng。应用建立的反应体系对退火温度进行优化,得到两步退火温度分别为35℃和50.2℃。最后用9个万寿菊雄性不育两用系材料组对所得PCR体系进行验证,证明该体系具有较高的稳定性和重复性,可为筛选与万寿菊雄性不育基因连锁的特异性标记奠定基础。     

白芥ISSR-PCR反应体系的建立与优化

本实验以产于四川、安徽、广东和青海的白芥农家品种为材料,采用单因素筛选和L16(45)正交设计相结合的方法,对白芥ISSR-PCR反应体系的Mg2+浓度、d NTPs浓度、引物浓度、Taq酶和模板DNA用量进行优化,建立最佳的白芥ISSR-PCR反应体系。结果表明:在20μL的PCR反应体系中,Mg2+浓度2.0 mmol/L、d NTPs浓度0.5 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.2 U、引物浓度0.4μmol/L、模板DNA 60 ng为最佳用量。用4个白芥农家品种对建立的ISSR-PCR反应体系进行验证,表明该反应体系稳定性高、可重复性好,同时筛选出条带清晰、多态性较好的18条引物。该反应体系的建立为白芥ISSR标记开发、种质资源鉴定与筛选、遗传多样性分析和分子标记辅助育种等提供了帮助。     

茶树TRAP反应体系的建立及正交设计优化

TRAP标记技术因操作简单、重复性好、效率高等特点得到广泛应用,但该技术在茶树中的研究报道较少,且茶树TRAP-PCR体系优化尚未见报道。笔者采用正交设计的方法,对茶树TRAP-PCR反应中Mg2+、Taq酶、dNTP、固定引物、随机引物5个因素进行了优化研究,建立了茶树TRAP-PCR最佳反应体系。该20 μL反应体系含有2 μL 10×PCR Buffer (Mg2+ free),50 ng模板DNA,1.75 mmo/L Mg2+,0.50 U Taq酶,0.20 mmol/L dNTP,0.20 mmol/L随机引物和0.20 mmol/L固定引物。根据优化结果,利用最佳反应体系,选用16个茶树品种对TRAP标记多态性进行了初步研究。     

芝麻RMAPD分子标记反应体系的正交优化及应用

RMAPD是将RAPD和SSR相结合而开发的新型分子标记。本研究采用L16(45)正交设计试验和单因素试验相结合的方法,对影响芝麻RMAPD-PCR反应的模板DNA、Mg2+、d NTPs、引物和Taq聚合酶等因素进行了优化。结果表明,芝麻RMAPD-PCR的最佳反应体系(15μL)为:模板DNA用量30 ng、Mg2+浓度2.0 mmol/L、d NTPs浓度0.3 mmol/L、RAPD引物浓度1.0滋mol/L、SSR引物浓度0.4滋mol/L和Taq聚合酶1.0 U。利用该PCR体系开展了芝麻遗传多样性分析和遗传群体多态性检测试验,21对随机引物组合在16个芝麻品种中共扩增DNA条带413条,每对引物扩增14~29条,平均19.7条,多态性比例为12.50%~62.96%,平均29.78%;RMAPD标记在F2群体植株中出现了亲本位点的分离。研究结果表明,该RMAPD-PCR反应体系稳定、可靠,RMAPD标记是一种可以用于芝麻遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建和分子标记辅助育种等研究的新技术。     

月季SSR-PCR反应体系的建立和优化

采用L16(54)正交设计和二因素完全随机试验,分析了月季SSR-PCR反应体系的主要成分Taq DNA聚合酶、样本浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度以及引物浓度对扩增结果的影响,建立了适合月季的SSR反应体系.研究结果表明:在20μL反应体系中,Taq DNA聚合酶宜加入1.5U,样本最适宜浓度为30～40 ng,Mg2+的最适浓度为1～1.5 mmol/L,dNTP最适浓度为0.2 mmol/L,单引物的最适浓度均为1μmol/L.用建成的反应体系对19对引物筛选,对12个月季品种扩增,3%的琼脂糖凝胶电泳检测,品种间DNA谱带多态性丰富,证明该体系稳定可靠.     

东方百合试管苗ISSR-PCR体系优化及引物筛选

为了对东方百合杂交育种获得的大量杂种后代进行分子标记早期鉴定,本研究采用单因素试验方法对模板DNA、Mg2+、Taq DNA聚合酶、d NTPs、引物等因子设置不同浓度梯度,建立了东方百合试管苗叶片ISSR-PCR最佳反应体系。反应体系为20μL,内含1×PCR Buffer、模板DNA 20 ng、Mg2+2.0 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.7 U、d NTPs 0.3 mmol/L、引物0.4μmol/L。PCR扩增程序采用Touchdown-PCR程序。利用优化后的体系对46条ISSR引物进行筛选,最终筛出3A37、3A61、UBC840、UBC841、UBC844等5条多态性高,重复性好的引物,且引物序列以二核苷酸重复序列为主。本研究可为利用ISSR分子标记开展东方百合杂种真实性鉴定提供技术方法和支持。