细菌核心基因组多位点序列分型(cgMLST)与溯源评价

细菌分型与溯源对食品安全监管、流行病学调查具有重要意义。全基因组分型技术以全基因组多位点序列分型(whole genome multilocus sequence typing, wgMLST)、核心基因组多位点序列分型(core genome multilocus sequence typing, cgMLST)、全基因组单核苷酸多态性(whole genome single nucleotide polymorphism, wgSNP)等为代表,具有分辨率高、重复性好的优点,能够实现精准溯源,逐渐成为细菌分型和溯源的主流技术。然而,wgMLST、wgSNP消耗巨大的计算资源,而且wgSNP对测序的准确性要求极高,推广难度大;相比之下,cgMLST需要较少的计算能力,应用性更强。本文重点介绍了细菌核心基因组的筛选、等位基因的赋值、cgMLST分型原理及操作步骤和细菌基因组溯源评价,为细菌的cgMLST分型与溯源提供了技术指导,有助于保证cgMLST分型结果的客观性和可比性。     

细菌全基因组测序技术用于沙门氏菌流行病学调查的可行性分析

为探讨细菌全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）技术在基层沙门氏菌防控中的优势与可行性，对前期分离的9株沙门氏菌进行细菌全基因组测序，并进行血清型预测、多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）和耐药基因分析，将全基因组测序结果与传统血清分型和耐药性分析结果进行对比。结果显示：基于全基因组测序数据的血清分型结果与传统血清分型结果符合率为100%，两种方法对9株沙门氏菌血清分型结果完全一致；两种方法分析出的β-内酰胺类、氯霉素类、喹诺酮类和氨基糖苷类药物的耐药基因与耐药表型符合率为100%，即耐药菌株中均含有4大类抗菌药物的耐药基因；用全基因组测序检测到利福平、磺胺类和四环素3大类抗菌药物的7个耐药基因，表明9株沙门氏菌可能对这3大类抗菌药物耐药。结果表明：全基因组测序结果与传统实验室诊断结果完全一致，且具有快速、低成本、操作简单等优势，并且随着测序技术的发展，其检测成本和周期将进一步缩减，因此基于细菌全基因组测序开发沙门氏菌快速分型和耐药性分析方法有一定的应用价值和可行性。     

陕西省犊牛安氏隐孢子虫多位点序列分型研究

为了对陕西省犊牛安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST),本研究基于4个基因位点对陕西省4个地区的36份犊牛(0~6月龄)C.andersoni阳性粪便样品进行PCR检测和序列分析。结果显示,15份C.andersoni分离株在CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3、CM-MS16 4个基因位点均被成功分型,形成A4、A4、A2、A1,A4、A4、A4、A1,A5、A4、A4、A1和A1、A4、A4、A1共4个MLST亚型。其中A4、A4、A4、A1广泛分布于各个养殖场与不同品种犊牛中,为该地区犊牛C.andersoni的优势亚型。该研究结果表明,陕西地区犊牛C.andersoni存在遗传多样性,具有多种MLST亚型。     

禽源沙门菌多重PCR检测方法的建立与应用

为了快速检测禽源沙门菌,根据已知的沙门菌全基因组序列,通过分析筛选出肠炎沙门菌、鸡伤寒沙门菌和鼠伤寒沙门菌三种血清型的特异保守序列,设计PCR引物,建立多重PCR检测方法。结果表明,该方法可以特异性检测肠炎沙门菌、鸡伤寒沙门菌和鼠伤寒沙门菌,检测灵敏度分别为6.413、4.363和8.724 pg/反应。临床样品检测结果表明,多重PCR方法的检测灵敏度(54/445)高于传统细菌学检测方法(33/445)。     

沙门菌PCR检测方法的建立

本实验根据沙门菌的侵袭性抗原保守基因肠毒素(STN)基因上的靶序列设计一对引物,对沙门菌基因组DNA进行PCR扩增,建立了沙门菌的PCR检测方法,与传统的细菌分离鉴定方法比较,该方法具有快速、特异、灵敏的特点,在沙门菌监测领域具有广阔的应用前景。     

乳房链球菌多位点序列分型和遗传进化特征分析

为探究中国不同地区来源的乳房链球菌（Streptococcus uberis，S.uberis）之间的多样性和遗传进化关系，本研究以部分地区分离到的38株乳房链球菌为研究对象，通过对其最小抑菌浓度（minimun inhibitory concentration，MIC）测定和全基因组框架测序，获取38株菌耐药性、耐药基因及毒力基因等相关信息；通过多位点序列分型技术（multilocus sequence typing，MLST）分析了7个管家基因的等位基因谱、序列型（sequence type，ST）和克隆复合体（clonal complexes，CCs），并构建系统进化树。MIC试验共采用15种抗生素，除头孢噻呋和氟苯尼考外，38株乳房链球菌对其中13种抗生素具有不同程度耐药，且江苏地区的耐药性明显强于新疆地区；耐药和毒力基因比对后发现，仅24株菌携带耐药基因，剩余14株则不携带耐药基因且属新疆地区分离株，与MIC试验结果相符；15种毒力基因中，除cfu、hasA/B和lbp外，余下12种毒力基因的携带率均高达100%。MLST结果表明，38株乳房链球菌共属于17个ST型，其中有15个ST型从未报道，仅supan01 1株菌属于ST-5 CCs。进化树结果揭示，38株分离株之间的亲缘性较远，分布呈地区依赖性，且中国部分地区当前流行的乳房链球菌与西方国家流行的菌株差异较大。本研究丰富了乳房链球菌的MLST分型数据库，为了解中国乳房链球菌遗传特性和分布特点提供了参考依据。     

新疆维吾尔自治区阿克苏地区某屠宰场羊源大肠杆菌MLST分型、耐药性分析和毒力基因检测

[目的]了解新疆维吾尔自治区阿克苏地区屠宰场羊源大肠杆菌的流行情况以及耐药性和毒力基因分布特征。[方法]从阿克苏地区某屠宰场采集健康羊的淋巴结、胴体拭子、粪便样本共30份,使用选择性培养基分离大肠杆菌,然后采用大肠杆菌特异性phoA基因对其进行分子生物学鉴定;利用PCR扩增及测序技术对大肠杆菌分离株进行多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）;采用K-B纸片扩散法开展分离菌株对抗菌药物的敏感性试验;应用PCR技术检测分离菌株的耐药基因和毒力基因携带情况;使用96孔板微量肉汤法测定分离菌株的生物被膜形成能力。[结果]从30份样本中分离得到14株大肠杆菌,分离率为46.67%;14株分离株分属于10个MLST型别;对复方新诺明（100%）、青霉素（85.71%）和四环素（50.00%）耐药率较高,9株菌具有多重耐药表型（64.29%）;在14株大肠杆菌中检测到blaTEM(85.71%)、aph(3′)（71.43%）、tetA(64.29%)、sul1(57.14%)和sul2(57.14%)等12种耐药基因,并且8株菌携带Ⅰ型整合子int-Ⅰ基因...     

沙门菌肠毒素基因克隆及序列分析

研究常见的不同血清型沙门菌肠毒素(stn)基因核苷酸序列之间的差异及其分布情况。根据沙门菌的stn核苷酸序列设计一对引物,应用PCR技术,分别对肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌进行PCR扩增,对扩增产物进行克隆及序列分析,并用所设计的引物检测7种血清型沙门菌(42株)。结果显示,3种沙门菌经PCR均扩增出749 bp的特异条带,DNA序列分析证实,沙门菌的stn核苷酸序列比较保守,42株沙门菌stn的检出率为100%。本试验成功克隆出沙门菌的stn,调查其在不同血清型沙门菌中的分布及序列分析,为进一步研究stn致病机理及研制减毒沙门菌活菌疫苗奠定了基础。     

甘肃部分地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的细菌多位点序列分型与毒力检测

为研究甘肃地区牛源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的耐药情况、基因型总体结构特征及毒力因子的分布情况,从甘肃省东、中和西部3个地区的3个县市采集41头罹患临床型乳房炎奶牛的93份乳样,采用鉴别培养基分离纯化细菌。采用K-B法对分离株进行耐药性分析,常规PCR方法检测mecA抗性基因和14种常见毒力基因以及多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)。结果显示,93份乳样中分离出28株金黄色葡萄球菌;分离株有不同程度的耐药且多为多重耐药(16株),多重耐药菌株占57.14%,未发现耐万古霉素菌株(VRSA),万古霉素敏感率为100%;28株分离菌中共检出mecA阳性11株,检出率为39.3%;共获得9个已知ST型;有12种毒力基因不同程度被检出,其中nuc、spa和coa检出率为100%,hlb、set1、clfA、FnBPA和seb阳性检出率均大于50%,sak、seg、PVL和sea的检出率依次为28.6%、7.9%、14.3%和21.4%,而FnBPB、hla基因未检出。研究结果可为甘肃省牛源金黄色葡萄球菌的耐药性评价、溯源分析和治疗提供参考依据。     

河南郑州地区奶牛源安氏隐孢子虫虫种鉴定及多位点序列分型研究

为了解河南省郑州地区奶牛隐孢子虫及安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni,C.andersoni)的亚型分布情况,本研究共采集3个奶牛场共973份奶牛新鲜粪便样品,采用显微镜检测方法进行隐孢子虫检测,对形态学鉴定的8份C.andersoni阳性样品分别基于SSU rRNA、Actin、HSP70和COWP基因位点进行虫种鉴定,基于CM-MS1、CM-MS2、CM-MS3和CM-MS16基因位点进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)分析。结果显示,隐孢子虫总感染率为2.77%(27/973),而且以断奶前犊牛感染率最高7.10%(12/169)。8份样品在不同基因位点均成功鉴定为C.andersoni分离株,并形成4个MLST亚型,其中A4、A4、A4、A1为优势亚型,A6、A4、A2、A1为新亚型,且不同亚型的卵囊大小具有显著差异。研究表明,河南省郑州地区奶牛隐孢子虫总体感染水平较低,但是对奶牛养殖业和牛奶产量仍然有较大影响,此外,C.andersoni存在多个MLST亚型,表明具有遗传多样性。