发酵乳杆菌对LTA诱导的牛子宫内膜细胞炎性损伤干预作用的研究

旨在研究发酵乳杆菌能否通过抑制NF-kB信号通路的激活,调控下游炎性细胞因子,进而对脂磷壁酸(LTA)所诱导的牛子宫内膜细胞(BEND)炎性损伤发挥保护作用,并通过体外试验对其作用机制进一步研究,为解决牛子宫内膜炎的治疗难题提供方向。以牛子宫内膜细胞为研究对象,LTA和发酵乳杆菌分别作为毒药与解药来建立体外细胞试验模型,测定细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的分泌量和炎性相关基因TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、TLR2、MyD88、NF-kB p65 mRNA的表达量。结果表明:LTA组、LTA+Lf组、Lf组炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的蛋白表达水平均高于对照组。LTA组与对照组比较差异极显著(p0.01);Lf组与对照组比较,TNF-α、IL-6细胞因子差异不显著(p0.05),IL-1β、IL-8细胞因子差异显著(p0.05);LTA+Lf组与LTA组比较,TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的蛋白表达量显著降低(p0.05)。LTA组、LTA+Lf组、Lf组的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、TLR2、MyD88、NF-kB p65基因mRNA的表达量均高于对照组。LTA组与对照组相比,7种基因m RNA的表达量极显著增加(p0.01);Lf组与对照组相比,TNF-α、IL-6基因mRNA的表达量增加不显著(p0.05),IL-8基因mRNA的表达量增加显著(p0.05),IL-1β、TLR2、MyD88、NF-kB p65基因mRNA的表达量极显著增加(p0.01);LTA+Lf组与LTA组相比,7种基因mRNA的表达量均极显著降低(p0.01)。发酵乳杆菌能够抑制NF-kB信号传导通路,调控炎性细胞因子的表达与释放,抑制炎性反应的发生,缓解LTA的细胞毒性,对LTA诱导的牛子宫内膜细胞炎性损伤起干预作用。     

Ctr1mRNA表达水平与细胞内CuZn-SOD活性的相关性

采用半定量RT-PCR法检测不同铜水平对猪传代肾细胞(PK15)中特异性铜转运蛋白Ctr1基因mRNA表达水平的影响,以β-actin为内参考,对各试验组cDNA同时进行PCR扩增;采用黄嘌呤氧化酶法对各实验组细胞内CuZn-SOD活性进行检测。猪肾PK15细胞Ctr1基因mRNA表达量在铜添加量在7.8～62.5μmoL·L-1范围时,其表达量呈双相反应;实验各组细胞内CuZn-SOD活性均高于对照组(P0.05),以Ⅳ组与其它各组差异显著(P0.05)。细胞表面Ctr1基因mRNA的表达量与细胞内CuZn-SOD活性呈反向性关系。     

番茄红素通过下调异柠檬酸脱氢酶1诱导胃癌细胞凋亡

目的 探究番茄红素对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制.方法 不同剂量番茄红素处理胃癌细胞株SGC-7901、MGC-803,用MTT法检测细胞增殖,Hoechst 33258染色、流式细胞仪检测细胞凋亡、线粒体膜电位(MMP)、活性氧(ROS),免疫印迹检测异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)、IDH2蛋白表达.结果 番茄红素呈剂量依赖性抑制SGC-7901、MGC-803细胞增殖.大于25 μmol/L番茄红素诱导SGC-7901细胞凋亡,增加ROS水平;50 μmol/L番茄红素降低MMP,下调IDH1蛋白表达(P＜0.01或0.05).结论 番茄红素可抑制胃癌细胞增殖、诱导凋亡;促凋亡机制可能是通过下调IDH1,阻断细胞ATP生成和提高细胞内ROS.     

SIRT1在5-FU耐药胃癌细胞中的表达及其对细胞化疗耐药的影响

目的探讨沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)在5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)耐药胃癌细胞(SGC-7901/5-FU)中的表达情况及其对细胞化疗耐药的影响。方法通过定量RT-PCR和Western blot方法检测SIRT1 mRNA与蛋白在5-FU敏感的SGC-7901亲本细胞、SGC-7901/5-FU细胞及在SIRT1-siRNA转染后的SGC-7901/5-FU细胞中的表达;选择高干扰效率的SIRT1-siRNA转染SGC-7901/5-FU细胞,CCK8法检测5-FU对转染细胞的活性影响,流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响,Western blot法检测其对细胞p-Akt、Bax、Bcl-2和P-pg表达的影响。结果 SGC-7901/5-FU细胞中的SIRT1 mRNA与蛋白表达水平均显著高于SGC-7901亲本细胞(P0.001);SIRT1-siRNA转染SGC-7901/5-FU细胞后,SIRT1的mRNA与蛋白表达均显著降低(P0.001);5-FU作用后,SIRT1-siRNA转染组的SGC-7901/5-FU细胞增殖活性明显下降(P0.001),细胞凋亡明显增加(P0.001),且细胞中的p-Akt、Bcl-2和P-pg含量明显下降(P0.001),Bax含量明显上升(P0.001)。结论 SIRT1在5-FU耐药胃癌细胞中高表达,干扰SIRT1表达后可通过抑制细胞增殖与促进细胞凋亡来提高耐药胃癌细胞对5-FU的敏感性,这可能与细胞增殖通路相关蛋白、凋亡以及细胞多药耐药性相关蛋白变化相关。提示抑制SIRT1可作为降低胃癌多药耐药性及提高胃癌对化疗药物敏感性研究的一个新思路。     

接头蛋白LNK抑制胃癌细胞增殖和侵袭能力的研究

为分析人接头蛋白LNK(hLNK)对胃癌发生发展的影响,克隆并包装含hiLNK基因的重组慢病毒并感染人胃癌细胞株SGC-7901以建立稳定过表达hLNK的细胞系SGC-7901-hLNK(7901-hLNK);Western blot验证该稳转细胞系中hLNK的表达水平,平板克隆试验分析hLNK过表达对其增殖的影响;Transwell小室试验分析hLNK过表达对胃癌细胞侵袭能力的影响;并对细胞内信号分子p-Jak2、p-Stat3、p-p38、Jak2、Stat3、p38的活化水平进行分析.结果表明:过表达hLNK的人胃癌细胞株7901-hLNK得到成功构建,该细胞的增殖、侵袭能力较对照组明显被抑制,且细胞中p-Jak2、p-Stat3水平显著下调.这一研究提示,hLNK可能作为一种抑癌因子在胃癌中发挥作用,其主要通过下调Jak2-Stat3信号通路抑制癌细胞的增殖、侵袭.     

球虫感染对蛋鸡肝脏和肠道mdr1、mrp2和bcrp mRNA表达水平的影响

为探索球虫感染对蛋鸡肝脏和肠道组织中多药耐药蛋白基因(mdr1)、多药耐药相关蛋白基因(mrp2)和乳腺癌耐药蛋白基因(bcrp) mRNA表达的影响,采用荧光定量PCR方法,以β-actin为内参,对球虫感染蛋鸡以及健康蛋鸡的肝脏、十二指肠、空肠、回肠中的mdr1和mrp2及bcrp mRNA进行相对定量测定.结果表明:与健康对照鸡比较,球虫感染导致mdr1mRNA表达水平在十二指肠中有显著上调(P=0.043),而在其他组织中mRNA表达水平均无显著差异(P＞0.05);mrp2mRNA表达水平在健康和球虫感染蛋鸡的肝脏及肠道中均无显著差异(P＞0.05);bcrp mRNA表达在肝脏(P=0.021)、回肠(P=0.021)、空肠(P=0.021)中均出现显著性下调,在十二指肠中则变化不显著.结论:球虫感染可使蛋鸡组织中的部分ABC(ATP-binding cassette)转运子的mRNA表达水平发生变化,但是不同基因在不同组织的变化趋势不同.提示:疾病期间用药可能会对药物的吸收和排泄有影响.     

SIRT7对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂和乳糖合成关键基因表达的调控

[目的]本试验旨在探讨去乙酰化蛋白7(sirtuin 7,SIRT7)对奶牛乳腺上皮细胞(DCMEC)合成乳蛋白、乳脂和乳糖关键基因表达的影响。[方法]以体外原代培养的中国荷斯坦奶牛DCMEC为试验材料,纯化后转染质粒p CDNA3.1-SIRT7,继续培养48或72 h后收集细胞。采用RT-qPCR和Western blot法检测乳蛋白、乳脂和乳糖合成关键基因mRNA和蛋白的表达;通过特异性试剂盒检测胞内和培养基中甘油三脂(TG)含量。[结果]1)乳蛋白:与对照组相比,过表达SIRT7可显著提高αs1-酪蛋白基因(CSN1S1)、β-酪蛋白基因(CSN2)和ETS转录因子基因(ELF5) mRNA水平,促进CSN2蛋白合成,激活雷帕霉素靶蛋白(m TOR)磷酸化; 2)乳脂:与对照组相比,过表达SIRT7可显著提高乳脂合成关键因子过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1) mRNA和蛋白水平,显著增加细胞内甘油三酯(TG)含量; 3)乳糖:与对照组相比,过表达SIRT7可显著提高乳糖合成关键因子葡萄糖转运蛋白1(GLUT1) mRNA表达。[结论]在体外培养条件下,过表达SIRT7可促进DCMEC中乳蛋白、乳脂和乳糖合成关键基因的表达。     

猪STC-1 siRNA设计及其基因沉默效率检测

根据猪肌肉斯钙素(STC)mRNA序列设计3对小干扰RNA(siRNA)、阴性对照siRNA,转染PK15细胞后,通过荧光观察转染效率和基因表达效率,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)及Western blot测定细胞内siRNA基因沉默后STC-1siRNA及蛋白的表达水平。结果表明:3个STC-1siRNA转染细胞后均有较高的荧光信号;STC-132细胞组STC-1mRNA和STC-1蛋白相对表达水平都最低,该组与其他组差异极显著。结果说明成功设计出STC-1siRNA序列,为后续通过调控STC-1表达研究其在肌肉发育中的功能奠定了基础。     

葛根素对延黄牛原代脂肪细胞分化的影响

为探究葛根素对牛前体脂肪细胞分化的调控作用,在脂肪形成过程中将葛根素加入到培养基中,观察其对成脂分化的影响。分别采用油红O染色法及甘油三酯酶法检测脂肪细胞分化过程中的脂滴积聚及细胞内的甘油三酯含量;采用qRT-PCR和Western blot技术检测成脂分化过程中脂肪形成相关转录因子CCAAT-增强子结合蛋白α(C/EBPα)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的mRNA和蛋白的表达水平。结果表明:低浓度的葛根素能促进脂肪细胞的分化,增加细胞内的甘油三酯含量,促进成脂标志基因的mRNA及蛋白的表达。葛根素的添加可促进脂肪分化,增加脂肪沉积,这为进一步研究延黄牛脂肪沉积作用机制以及改善牛肉品质奠定基础。     

5种细菌鞭毛素蛋白诱导细胞因子IL-4、IFN-γ mRNA的表达水平

选择5种不同细菌来源的鞭毛素蛋白刺激猪外周血淋巴细胞,利用荧光定量PCR检测相关细胞因子白介素4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ)mRNA的表达水平,进一步选择4个含量(0.1、1.0、5.0、10.0μg·m L~(-1))的创伤弧菌鞭毛素蛋白,探讨其诱导IFN-γ的表达效果.结果表明,鞭毛素蛋白可以显著提高IFN-γmRNA的表达水平(P0.05),以创伤弧菌(Vibrio vulnificus MO6-24/O)的效果最佳.4个含量的创伤弧菌鞭毛素蛋白均能显著提高猪外周血淋巴细胞IFN-γmRNA的表达量(P0.05),其中以5.0μg·m L~(-1)为创伤弧菌鞭毛素蛋白的最适含量.本试验主要目的是筛选一种能够有效提高猪免疫功能的细菌鞭毛素蛋白,为挖掘新型疫苗佐剂提供基础.     

五指山小型猪近交系主动脉内皮细胞体外培养模型的建立和TLR2介导炎症相关因子的表达

【目的】探讨五指山小型猪近交系主动脉内皮细胞体外分离培养和鉴定的方法,研究LPS对内皮细胞TLR2表达的影响及TLR2介导内皮细胞炎症因子的表达情况。【方法】以3—4月龄的五指山小型猪近交系为试验材料,取其胸腹主动脉,采用0.1%I型胶原酶消化分离主动脉内皮细胞。利用细胞吸收DiI-Ac-LDL试验和流式细胞仪检测CD31的特异表达两种方法进行内皮细胞的鉴定。1 μg•mL-1LPS刺激内皮细胞0、6、8和12 h,实时荧光定量PCR检测TLR2和TLR4的表达量;1 μg•mL-1LPS刺激内皮细胞12 h后,10 μg•mL-1LTA孵育0、6和12 h,实时荧光定量PCR检测炎症因子IL-6、IL-8和黏附分子ICAM-1的表达量。【结果】分离得到的主动脉内皮细胞呈铺路石样整齐排列,且生长状态良好;细胞膜上表达CD31分子和Ac-LDL的受体,证实分离得到的细胞是血管内皮细胞。LPS刺激后细胞TLR2 mRNA水平的表达量明显升高（P＜0.05）,而TLR4 mRNA水平表达量无明显变化。添加LTA孵育后,细胞炎症因子IL-6、IL-8和黏附分子ICAM-1的mRNA水平表达量较对照明显升高（P＜0.05）。【结论】成功建立了五指山小型猪近交系主动脉内皮细胞体外培养模型,并检测到TLR2在LPS刺激内皮细胞后表达量升高,能够介导细胞炎症相关因子的表达。     

CFL2特异性siRNA的设计与筛选及其在C2C12细胞中的定位

设计并合成了2条特异性抑制CFL2的siRNA,用其转染C2C12细胞后分别采用RT-PCR和western blot检测细胞CFL2 mRNA和蛋白的表达情况,并用免疫荧光法对CFL2进行细胞定位。结果表明,设计的2条siRNA均能不同程度地抑制CFL2的mRNA和蛋白表达,当siRNA浓度为50 nmol/L时,其对CFL2-1 mRNA和蛋白的抑制率分别为88%和84%。     

TLR21在斑马鱼免疫功能中的作用研究

［目的］研究斑马鱼TLR21受体家族的作用。［方法］用各种纯组分刺激斑马鱼,研究斑马鱼TLR21受体家族（zTLR21.1、zTLR21.3、zTLR21.4）的表达量变化,推测它们的功能。［结果］zTLR21.1对于LTA刺激无反应,对于LPS、ployI：C和Glucan刺激都有上调反应。zTLR21.3和zTLR21.4对于LPS、LTA和ployI：C刺激均无反应,对于Glucan刺激有明显上调变化。［结论］zTLR21.1可能是一种能够识别大部分抗原的模式识别受体。zTLR21.3和zTLR21.4的功能很类似,可能都是酵母的特异识别受体。     

不同病原性相关分子模式对大黄鱼头肾巨噬细胞免疫功能的影响

为研究不同病原性相关分子模式（PAMP）对大黄鱼头肾巨噬细胞免疫功能的影响，本研究分别将脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、肽聚糖（peptidoglycan，PGN）、脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）、胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）与提取的大黄鱼头肾巨噬细胞进行孵育，测定大黄鱼头肾巨噬细胞的呼吸爆发活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性、溶菌酶（LZM）活性和免疫相关细胞炎症因子（TNFα，IL1β，IL8，IL10，CXCL9，MYD88，TLR3和TLR8）的表达情况。结果显示:（1）LPS，PGN，LTA，MDP均能显著提高大黄鱼头肾巨噬细胞的呼吸爆发活性和LZM活性，同时显著降低SOD和CAT两种抗氧化酶的活性；（2）在LPS和LTA刺激下，8种免疫相关细胞炎症因子TNFα，IL1β，IL8，IL10，CXCL9，MYD88，TLR3和TLR8均呈显著性上调趋势；在PGN和MDP刺激下，除IL8，CXCL9外，其余6种免疫相关细胞炎症因子均显著性上调。结果表明，4种病原相关分子模式LPS，PGN，LTA，MDP均能显著影响大黄鱼头肾巨噬细胞的非特异性免疫应答能力和免疫相关细胞炎症因子的表达。     

脂多糖对猪肺泡巨噬细胞分泌IL-1β及TNF-α的影响

研究了脂多糖的浓度、刺激时间对猪肺泡巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α的影响。分别用不同浓度的脂多糖和不同的刺激时间处理猪肺泡巨噬细胞,收集细胞,提取RNA,用实时荧光定量PCR方法检测IL-1β、TNF-αmRNA表达水平;同时收集培养上清,用ELISA检测试剂盒检测IL-1β、TNF-α蛋白表达水平。结果表明,脂多糖浓度(1~1000ng/mL)对IL-1β、TNF-α影响显著(P<0.05);刺激时间(1~24h)对IL-1β、TNF-α影响显著(P<0.05),且蛋白的表达水平迟于mRNA的表达水平。脂多糖诱导猪肺泡巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α具有剂量、时间依赖性。     

牛TLR2全长基因表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达(英文)

[目的]构建牛TLR2全长基因表达质粒,并在HEK293细胞中表达。[方法]利用RT-PCR技术克隆TLR2基因的全长编码区,连接到pMD18-Tsimplevector,再亚克隆到pEGFP-N1载体,得到包含TLR2基因全长的重组真核表达质粒。将重组质粒瞬时转染到HEK293细胞。流式细胞计数法和共聚焦显微镜法检测转染效率和表达蛋白在细胞中的定位;qRT-PCR法检测TLR2 mRNA在HEK293/boTLR2中的表达。最后,通过脂膜酸刺激HEK293/boTLR2细胞试验来分析TLR2蛋白的生物活性。[结果]成功克隆TLR2基因全长并连接到真核表达载体,并在HEK293细胞中表达。在LTA刺激的条件下,转染重组质粒的细胞比未转染的HEK293细胞分泌更多IL-8。[结论]本研究建立的细胞模式为TLR激动剂和拮抗剂的筛选提供快速有效的手段,有利于开展TLR激动剂和TLRs相互作用的研究。     

牦牛C1H21orf62基因的克隆、生物信息学及表达分析

应用RT-PCR方法克隆牦牛C1H21orf62基因并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR方法检测C1H21orf62基因在有角牦牛和无角牦牛角芽组织的mRNA表达.结果表明,C1H21orf62基因编码区全长662 bp,编码161个氨基酸.C1H21orf62是一种亲水性蛋白,含有13个潜在的磷酸化位点,但无跨膜域和信号肽.C1H21orf62基因mRNA在无角牦牛角芽组织的表达水平极显著高于有角牦牛.     

孕酮对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-1 mRNA表达的影响

旨在研究孕酮(P4)对绵羊输卵管上皮细胞内β-防御素-1( SBD-1) mRNA基因表达的影响及可能参与的信号通路,利用10~(-8) mol/L P4培养绵羊输卵管上皮细胞2 h、6 h、12 h、24 h、48 h,利用RT-qPCR技术检测 SBD-1 mRNA的表达变化,选取P4诱导 SBD-1 mRNA表达的最佳时间。分别添加P4核受体阻断剂RU-486、蛋白激酶C (PKC)阻断剂H-7、蛋白激酶A (PKA)阻断剂H-89干预绵羊输卵管上皮细胞1h,再使用P4处理细胞。结果显示,用10~(-8)mol/L P4诱导绵羊输卵管上皮细胞6 h, SBD-1 mRNA表达显著升高;添加RU-486和H-89显著抑制P4诱导的 SBD-1 mRNA的表达;添加H-7后 SBD-1 mRNA的表达量无显著性差异。以上结果表明,P4诱导的绵羊输卵管上皮细胞中 SBD-1 mRNA的表达通过孕酮核受体(PR)和PKA信号通路介导,与PKC信号通路激活无关。     

GPNMB通过调控MITF下游色素相关基因表达影响黑色素细胞色素的生成

【目的】探究GPNMB是否会通过调控MITF及其下游色素相关基因的表达来影响黑色素细胞中色素的生成,为进一步阐明GPNMB对黑色素细胞中色素生成的具体机制提供理论依据。【方法】首先对小鼠GPNMB核酸序列进行检索,通过对GPNMB和慢病毒表达载体序列分析来筛选出合适的酶切位点,在此选取SalⅠ和XbaⅠ作为酶切位点。并对GPNMB基因序列设计含有SalⅠ和XbaⅠ酶切位点的全长引物,克隆GPNMB基因全长序列,将含有酶切位点的GPNMB基因片段与T载体进行连接,送华大基因测序。将构建成功的T载体提取质粒,双酶切后将其与含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒表达载体相连接,送华大基因进一步测序确认。使用质粒中提试剂盒获得大量去内毒素的GPNMB慢病毒真核表达载体。通过体外培养小鼠黑色素细胞,选择细胞对数生长期利用细胞转染技术过量表达GPNMB。观察转染后黑色素细胞形态特征变化和绿色荧光蛋白的表达量,收集黑色素细胞,并对其进行转染效率验证,黑色素含量进行测定,以及经Real-time PCR和Western blot检测转染后PMEL、MITF、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的mRNA和蛋白的表达量。【结果】与正常组(Control)相比试验组(Vector-GFP-GPNMB)、空载组(Vector-GFP)中黑色素细胞的形态特征无明显变化,并且试验组、空载组的绿色荧光蛋白表达量显示5μg DNA/孔转染效率最高。相对于空载组和正常组,试验组的GPNMB mRNA和蛋白水平都显著的升高(P0.01)。与空载组相比,试验组黑色素含量升高1.34倍,差异显著(P0.01)。Real-time PCR检测结果显示,MITF mRNA显著降低2.25倍(P0.01);PMEL mRNA显著升高1.59倍(P0.05);TYRP1 mRNA显著升高2.35倍(P0.01);TYRP2 mRNA显著升高1.60倍(P0.01);TYR mRNA升高1.65倍和OA1 mRNA升高1.5倍,但变化不明显。Western blot检测结果显示,MITF蛋白显著降低1.59倍(P0.01);TYR蛋白显著升高1.23倍(P0.01);TYRP2蛋白显著升高4.35倍(P0.01);OA1蛋白显著升高1.31倍(P0.05);TYRP1蛋白升高1.05倍,但变化不明显。【结论】GPNMB过量表达使MITF下游基因PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表达量增加,却使MITF的表达量降低,由此表明GPNMB可能受非MITF调控路径调节PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表达,从而影响黑色素的生成。