口蹄疫病毒株AF72 VP2的结构模拟与分析

为了分析FMDV AF72VP2蛋白结构和功能的关系.以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增目的基因,PCR纯化产物与pGEM-Teasy载体连接并转化JM109菌株,用凝胶电泳、PCR和SpeⅠ、SphⅠ双酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序.比对测序结果确定AF72 VP2的核苷酸序列,利用同源建模的方法建立AF72 VP2结构蛋白的3D结构,在此基础上,综合亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数预测AF72 VP2结构蛋白的B细胞抗原表位.分析表明,口蹄疫病毒VP1,VP2,VP3 和VP4在核苷酸水平上的变异率是无差异的(P>0.05);而他们在氨基酸水平上的变异率差异显著(P<0.05).该毒株与20株源于GenBank中的VP2氨基酸序列比对发现其保守区主要位于第1～23、37～51、66～76、85～101、124～142、165～199、205～219位.保守区氨基酸残基在维持VP2蛋白的空间构象和功能方面具有重要作用,其中1～10、129～140、165～176氨基酸区段是AF72 VP2结构蛋白可能的B细胞抗原表位区域,该结果将为进一步的FMDV多表位疫苗研究提供更有价值的参考信息.     

FMDV OA/58病毒株VP1蛋白结构构建与B细胞抗原表位的预测

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoR Ⅰ酶切法鉴定.运用同源模建得到OA/58 VP1蛋白3D结构,并结合理化性质、亲水性、可塑性和免疫原性进行分析,预测OA/58 VP1的抗原表位.结果 OA/58 VP1存在多个潜在的抗原表位位点,可能的蛋白质抗原表位区域:2～11,15～35,38～50,77～88,90～107,121～125,131～135,140～149,154～163,169～175,178～189,197～213.应用同源模建得到的OA/58 VP1蛋白3D模型来预测其B细胞表位,为进一步研究OA/58 VP1功能,构建突变体和选择表达新型OA/58 VP1蛋白分子提供有参考价值的信息.     

口蹄疫OA／58病毒株VP2蛋白结构模拟与B细胞抗原表位的分析

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pMD18-T载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和BamH I,Hind III双酶切法鉴定。运用同源模建得到OA/58 VP2蛋白三维空间结构,并结合理化性质、亲水性、可塑性和免疫原性进行分析,找出OA/58 VP2蛋白的B细胞抗原表位。结果表明,OA/58 VP2蛋白存在多个潜在的抗原表位,可能的蛋白质抗原表位区域:1~23,40~63,71~78,82~91,102~106,113~119,131~138,148~154,166~177,189~196,212~218。应用同源模建得到的OA/58 VP2蛋白三维空间结构来预测其B细胞表位,为进一步研究OA/58 VP2蛋白在引起易感宿主体液免疫应答方面提供了一种可视化的技术平台,并且为选择表达其他口蹄疫病毒株的VP2蛋白分子提供有参考价值的信息。     

口蹄疫病毒株OA/58 L蛋白酶的结构构建和功能分析

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T Easy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoR I酶切法鉴定。该毒株与A12,O1K,O1Campos和TW45/97毒株序列通过对比分析发现,L基因中有2个起始密码子,第二个是首选;并且确定氨基酸保守区主要位于第35～39,43～54,65～67,75～80,90～111,113～142,144～146,148～157,159～172和176～187位。L蛋白酶含有球状区域,碳端有一柔性杆状结构。合成的L蛋白酶可形成二聚体结构。第144位的Lys、148位的His和163位的Asp可能是L蛋白酶的活性位点。保守区氨基酸残基在维持蛋白的空间构像和功能方面具有重要作用。由拉马钱德兰图可证明本试验构建L蛋白酶的空间结构是合理的,它对于进一步的研究具有指导性。     

瘤胃保护性赖氨酸和蛋氨酸对小尾寒羊瘤胃发酵及粗饲料成分瘤胃降解率的影响

旨在研究瘤胃保护性赖氨酸和蛋氨酸添加水平及其配比对小尾寒羊瘤胃发酵及粗饲料成分瘤胃降解率的影响。选用装有永久性瘤胃瘘管、体重（45±2．6） kg的小尾寒羊10只,按完全随机原则进行3阶段试验,每阶段预饲期12 d,正试期3 d。对照组饲喂基础日粮,试验组分别在基础日粮中添加不同水平及配比的保护性赖氨酸和蛋氨酸。结果表明：保护性氨基酸添加水平及其配比对瘤胃液pH值、NH3-N浓度、VFA含量及其比例无明显影响（ P＞0.05）,但可不同程度提高菌体蛋白含量,其中I组极显著高于对照组（P＜0．01）;添加适当水平的保护性氨基酸,可明显提高DM、ADF的瘤胃降解率（P＜0．05）,而对CF、NDF瘤胃降解率无显著影响（P＞0．05）。本试验条件下,每只小尾寒羊日粮中保护性赖氨酸及蛋氨酸的添加量分别以8．4,2．4 g／d为宜。     

纳米硒对肉鸡免疫和抗氧化能力的影响

【研究目的】试验旨在研究纳米硒对肉鸡免疫和抗氧化性能的影响。【方法】选用1日龄Avian肉鸡225只,随机分为5个处理组,每组45只,设3个重复,每个重复15只。在玉米．豆粕型日粮基础上添加纳米硒（0、0．15、0．3、0．6、1．2mg／kg）,以饲喂基础日粮组为对照组,试验期6周。【结果】结果表明：（1）试验至14、28日龄时,纳米硒在0．15～1．2mg／kg的添加水平肉鸡的新城疫抗体效价、免疫器官指数高于对照组（P〉0．05）;42日龄时,纳米硒在0．3～1．2mg／kg的添加水平肉鸡的新城疫抗体效价、免疫器官指数显著高于对照组（P〈0．05）。14、28、42日龄时,纳米硒在0．6～1．2mg／kg的添加水平外周血T淋巴细胞转化率显著高于对照组（P〈0．05）。（2）14日龄时,纳米硒在0．6～1．2mg／kg的添加水平血浆中的总抗氧化能力（T-AOC）显著高于对照组（P〈0．05）;纳米硒在0．15～1．2mg／kg的添加水平血浆中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力、总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力、抑制羟自由基（OH．）能力高于对照组（P〉0．05）,丙二醛（MDA）含量低于对照组（P〉0．05）;纳米硒在0．3～1．2mg／kg的添加水平血浆中一氧化氮（NO）含量极显著低于对照组（P〈0．01）。28日龄时,纳米硒在0．3～1．2mg／kg的添加水平血浆中T．AOC极显著高于对照组（P〈0．01）;纳米硒在0．15～1．2mg／kg的添加水平血浆中GSH-Px活力显著高于对照组（P〈0．05）,MDA含量、NO含量显著低于对照组（P〈0．05）;纳米硒在1．2mg／kg的添加水平血浆中抑制OH．能力的显著高于对照组（P〈0．05）。42日龄时,纳米硒在0．15～1．2mg／kg的添加水平血浆中的T-AOC、GSH-Px活力、T—SOD活力、抑制OH．能力、MDA含量、NO含量都显著高于或低于对照组（P〈0．05）。【结论】因此,纳米硒在0．6～1．2mg／kg的添加水平对提高肉鸡免疫能力效果最佳;纳米硒在0．15～1．2mg／kg的添加水平可以很好的提高肉鸡的抗氧化能力。     

Cry1Ab毒蛋白对亚洲玉米螟生长发育的影响

为了明确Crylab毒蛋白是否对亚洲玉米螟具有控害作用．采用实验种群生命表的方法。研究了CrylAb毒蛋白对亚洲玉米螟的生长发育和种群增长的影响。结果表明．亚洲玉米螟在各个发育阶段对高浓度（50μg／mL）的CrylAb毒蛋白敏感，而对低浓度（0．1μg／mL）的CrylAh毒蛋白不敏感．10．0pμg／mLCrylAb毒蛋白处理的亚洲玉米螟幼虫历期显著低于对照和其它处理（P〈0．05）。50．0μg/mLCrylAb毒蛋白处理的亚洲玉米螟雌成虫产卵前期、单雌产卵量和雌成虫寿命均显著低于对照（P〈0．05）。1．0μg／mLCrylAb毒蛋白处理的亚洲玉米螟蛹重显著低于对照（P〈0．05）。50．0、10．0、1．0、0．1μg／mLCrylAb毒蛋白的人工饲料处理的亚洲玉米螟净增长率显著低于对照（P〈0．05）。而0．1μg／mLCrylAb毒蛋白处理的净增长率和世代平均周期均显著短于对照（P〈0．05）．．结果表明．CrylAb毒蛋白对亚洲玉米螟的种群增长有一定影响．且对亚洲玉米螟具有一定的控制作用。     

FMDV Asia1/HeB病毒株结构蛋白基因的克隆测序及B细胞抗原表位预测

对口蹄疫病毒Asia1/HeB株P1结构蛋白基因进行了扩增、克隆及序列测定.采用DNAStar Protean软件对P1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性、表面可及性及抗原指数等参数进行分析,综合预测其B细胞表位分布.结果表明,FMDV Asia I/HeB株P1基因长2 199 bp,包含完整的开放阅读框,编码733个氨基酸,其中VP1长633 bp,编码211个氨基酸,VP2长654 bp,编码218个氨基酸,VP3长657 bp,编码219个氨基酸,VP4长255 bp,编码85个氨基酸.P1结构蛋白的二级结构较为复杂,含有较多的β片层结构和转角结构,VP1、VP2和VP3上均有多个区域为B细胞优势表位,VP4上也有少量的潜在B细胞表位.与已鉴定的B细胞表位相比较,该方法预测的结果有较高的准确度.为试验确定FMDV AsiaI/HeB株P1结构蛋白的B细胞表位和反向疫苗学设计提供了理论基础.     

口蹄疫病毒株OA/58 3C蛋白酶的结构模拟和功能分析

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-TEasy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定。该毒株与Poliovirus,Hepatitis Avirus和Human rhi-novirus 89毒株3C序列对比分析发现核苷酸序列一致性分别为38.8%,37.1%和36.5%,氨基酸序列一致性分别为23.7%,19.2%和17.6%。通过Swiss-pdbViewer软件模拟出FMDVOA/58 3C蛋白酶的3D结构和表面模型。并鉴定出此毒株3C蛋白酶的活性中心为Cys31-His46-Asp84。     

皖麦38添加木聚糖酶对鸡表观代谢能值和氨基酸表观消化率的影响

用32只小公鸡进行代谢试验，研究高戊聚糖含量小麦品种皖麦38添加木聚糖酶对鸡表观代谢能值（AME）和氨基酸表观消化率的影响。结果显示，木聚糖酶使鸡的表观代谢能值（干物质基础）提高4．14％（P＜0．05），干物质消化率提高5．98％（P＜0．05），有机物消化率提高5．36％（P＜0．05），粗脂肪消化率提高3．01％（P＞0．05）。氨基酸表观消化率分析表明，木聚糖酶对赖氨酸和天冬氨酸的消化率分别提高5．19％（P＞0．05）和5．00％（P＞0．05）；组氨酸和脯氨酸的消化率分别提高3．67％（P＜0．05）和2．39％（P＜0．05）；亮氨酸、精氨酸、缬氨酸、丙氨酸、胱氨酸的消化率分别提高2．12％－4．18％不等；对其它氨基酸的消化率没有明显影响。     

O型口蹄疫病毒各编码基因及其产物变异率的分析

将从Genbank中提出的20株O型FMDV的全基因组分割成12个编码区域,即Lab、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D.通过方差分析,12个编码序列的相对变异率之间无差异(P>0.05);而这12种编码序列所对应的氨基酸相对突变率之间差异显著(P<0.01).利用Duncan法对这12种氨基酸序列相对突变率进行多重比较,发现3A蛋白的氨基酸相对突变率比其余11种蛋白的差异都显著(P<0.05);VP2、Lpro的氨基酸相对突变率与VP4、2A、2C、3Cpro、3Dpol之间存在差异(P<0.05);而VP4、2A、2C、3Cpro、3Dpol之间无差异.结果显示,O型FMDV自身RNA的转录和机体对FMDV施加的免疫压力不是造成FMDV变异的主要原因,而各种病毒产物的功能选择压力才是FMDV分子进化的主要原因.     

非洲马瘟病毒VP7基因的克隆与表达

为获得非洲马瘟病毒VP7蛋白,以用于制备AHS血清学诊断试剂并为AHS新型疫苗的构建奠定基础,笔者采用原核表达系统表达VP7蛋白。在GeneBank中查找非洲马瘟病毒VP7基因序列,人工合成VP7基因,将VP7基因片段克隆插入pBAD/Thio-TOPO表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌TOP10。经测序鉴定,筛选获得VP7基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,经L-Arabinose诱导表达VP7融合蛋白抗原。SDS-PAGE分析表明以终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖进行诱导,4h后表达可达到高峰,融合蛋白质量约54.72 kDa。Western blotting检测和间接ELISA表明诱导表达的融合蛋白能与非洲马瘟病毒VP7单克隆抗体发生特异性反应,说明蛋白有特异的免疫学活性。     

牛IL-6基因原核表达及其对口蹄疫病亚单位疫苗的佐剂效应研究

为了研究荷斯坦奶牛白介素6(IL-6)基因作为佐剂对VP1蛋白免疫效果的影响,分别克隆IL-6基因和VP1基因,连接到载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-6P-1/BoIL-6、pGEX-6P-1/VP1、pGEX- 6P-1/BoIL-6/VP1。重组质粒在大肠杆菌RS21中高效表达,动物试验检测IL-6作为分子佐剂对豚鼠免疫应答的影响。结果表明：构建的重组质粒在原核系统中正确表达,以包涵体形式存在。表达的融合蛋白三次免疫豚鼠后,检测发现IL-6/VP1组能够诱导产生高水平的体液免疫反应和细胞免疫反应,与疫苗组及VP1+FCS组免疫效果相当。本实验证实IL-6作为分子佐剂能够提高VP1的免疫效果。     

农杆菌介导轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化花生的研究

选用鲁花14与花育23花生品种, 通过农杆菌介导开展了轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化研究, 从转化植株中随机选取26株表现Kan抗性植株进行npt II基因的PCR检测, 结果有22株能扩增出620 bp左右的npt II基因条带, 阳性率约为84.62%。提取npt II基因显示为阳性的植株叶片DNA作模板, 用VP4基因特异引物进行PCR扩增, 经琼脂糖凝胶电泳分析, 所有npt II基因阳性的植株均扩增出了约2 350 bp的特异性条带, 而野生型没有。对部分转基因植株进一步进行PCR-Southern杂交和Southern杂交分析, 发现转基因植株中出现了阳性杂交信号, 表明VP4基因的确已经整合到花生的基因组中, 并且是1~2个拷贝。用RT-PCR分析了11株转G1VP4基因的植株, 证明插入鲁花14中的VP4基因已经正常转录, 利用Western blot方法检测筛选到的4株转基因花生, 分别提取其蛋白, 在30 kD处出现特异性蛋白条带, 这为获得转基因创新种质材料奠定了基础。     

农杆菌介导轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化花生的研究

选用鲁花14与花育23花生品种, 通过农杆菌介导开展了轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化研究, 从转化植株中随机选取26株表现Kan抗性植株进行npt II基因的PCR检测, 结果有22株能扩增出620 bp左右的npt II基因条带, 阳性率约为84.62%。提取npt II基因显示为阳性的植株叶片DNA作模板, 用VP4基因特异引物进行PCR扩增, 经琼脂糖凝胶电泳分析, 所有npt II基因阳性的植株均扩增出了约2 350 bp的特异性条带, 而野生型没有。对部分转基因植株进一步进行PCR-Southern杂交和Southern杂交分析, 发现转基因植株中出现了阳性杂交信号, 表明VP4基因的确已经整合到花生的基因组中, 并且是1~2个拷贝。用RT-PCR分析了11株转G1VP4基因的植株, 证明插入鲁花14中的VP4基因已经正常转录, 利用Western blot方法检测筛选到的4株转基因花生, 分别提取其蛋白, 在30 kD处出现特异性蛋白条带, 这为获得转基因创新种质材料奠定了基础。     

对虾白斑综合症病毒(WSSV)蛋白激酶wsv083的初步研究

为探讨VP19和VP28是否由蛋白激酶wsv083催化发生磷酸化,将wsv083、VP19和VP28分别进行原核表达。将wsv083蛋白、wsv083表达菌株的裂解液上清以及去磷酸化的wsv083蛋白分别和2种膜蛋白相互作用,以及将wsv083、VP19和VP28的表达质粒共转化至同一菌株中进行表达。结果均未能发现VP19和VP28被磷酸化,但发现wsv083蛋白自身具有苏氨酸和酪氨酸磷酸化的现象。改变wsv083表达质粒,wsv083蛋白同样出现了磷酸化现象。而在将wsv083的序列改变使其失去激酶活性后,表达出的wsv083蛋白不再具有磷酸化的现象。因此认为VP19和VP28的磷酸化不是由wsv083催化产生,wsv083能够自我磷酸化。     

~(252)Cf裂变中子辐照玉米种子生物学效应初步研究

为了探索快中子辐照玉米种子的生物学效应,筛选适宜的中子辐照剂量,以获得基因定位、克隆及其功能分析的突变体材料,采用252Cf裂变中子源对玉米自交系LY8405和PH6WC种子进行辐照,结果表明,低吸收剂量(0.36~4.19 Gy)的中子辐照玉米干种子后,对自交系LY8405的出苗率有一定的抑制作用,对自交系PH6WC的出苗率有一定的促进作用;2份材料M1畸变率、变异率、遗传总变异率,随着辐照剂量的增加有逐步升高的趋势,其中辐照剂量为4.19 Gy时对LY8405最为有效,畸变率、变异率、遗传总变异率分别为27.8%,38.9%,66.7%;辐照剂量为2.48 Gy时对PH6WC最为有效,畸变率、变异率、遗传总变异率分别为7.1%,14.3%,21.4%;M2株高、穗位、叶片数、雄穗分枝数、穗长、穗粗、穗行数、轴粗等主要农艺性状变异随辐照剂量的增加,其变异系数也随之增加。研究表明,不同基因型玉米种子对快中子辐射剂量的敏感性不同,初步认为2.00~4.19 Gy的辐照剂量是玉米252Cf裂变中子辐照处理的适宜剂量。     

花生突变体的EMS诱变及分子检测

化学诱变能有效的创造各种突变体,确定诱变的适宜条件能提高诱变效率,更好地拓展花生种质资源。本研究采用化学诱变剂EMS处理2个花生品种的种子外植体,设置5个处理浓度(0.3%,0.6%,0.9%,1.2%,1.5%)和5个处理时间(0.5h,1h,3h,5h,7h)共25个组合,以半致死量为选择标准,确定了中花5号的适宜诱变组合为0.9%7h,1.2%5h,远杂9102的适宜诱变组合为0.6%7h,0.9%7h.对中花5号M0代植株的一些生物学性状进行观察,发现EMS对其产生了明显的生理损伤,两个品种对EMS的敏感性有差异,但差异性不大。对部分突变体进行分子检测,结果表明其DNA已经发生变异.     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1上B细胞表位的筛选鉴定

以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增结构蛋白VP1基因,PCR纯化产物与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,对经凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对获得AF72 VP1的核苷酸序列和推导氨基酸序列,综合分析结构蛋白VP1的亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数,预测其潜在B细胞抗原表位并人工合成表位肽段,利用间接ELISA对潜在表位肽段进行筛选鉴定,结果显示,表位VP1a和VP1d为病毒株AF72结构蛋白VP1的优势B细胞表位,该结果为进一步的FMDV多表位疫苗研究提供有价值的参考依据.