利用农杆菌注射法鉴定番茄黄化曲叶病毒的沉默抑制子

利用农杆菌注射法鉴定了番茄黄化曲叶病毒的沉默抑制子V2。将分别携带目标基因与GFP表达载体的农杆菌共注射到本氏烟草中,2 d后GFP瞬时高量表达。西瓜褪绿矮化病毒BV1基因表达载体和空载体pBIN分别与GFP共侵染7 d后,GFP表达量由于寄主沉默机制而急剧减弱。V2基因表达载体与GFP表达载体共侵染叶片7 d后,GFP仍保持高水平表达,说明V2作为番茄黄化曲叶病毒沉默抑制子可阻止寄主的沉默机制。农杆菌注射法可快速方便筛选植物病毒沉默抑制子。     

利用绿色荧光蛋白GFP研究不同启动子在蝉棒束孢菌中的表达活性

利用农杆菌介导转化(Agrobacterium-mediated transformation,ATMT)的方法,将3个来源于蝉棒束孢菌(Isaria cicadae)、2个来源于稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的启动子在蝉棒束孢菌中驱动绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达。通过荧光显微镜观察GFP荧光亮度和荧光定量PCR检测GFP基因的转录水平,比较不同启动子的转录活性,并利用筛选出的高表达活性载体pKD5-GFP观察小G蛋白Rho在蝉棒束孢菌中的定位。结果表明:来源于稻瘟病菌的H3启动子在蝉棒束孢菌中对GFP基因具有较高的起始转录功能,小G蛋白Rho在孢子和新生菌丝阶段均有表达。研究结果可为在蝉棒束孢菌中进行外源基因表达和遗传研究提供参考。     

非组培依赖的发根农杆菌介导的薄壳山核桃转化体系构建

[目的]建立一种简单高效的农杆菌介导薄壳山核桃Caryaill inoinensis的转化体系.[方法]以薄壳山核桃钟山的幼苗为材料,采用四因素(菌种、菌液浓度、处理部位、苗龄)三水平正交试验进行农杆菌侵染薄壳山核桃茎部诱导发根,并通过DNA检测及GFP荧光验证.[结果]影响发根农杆菌侵染薄壳山核桃生根诱导率的因素大小...     

应用绿色荧光蛋白报告基因优化辣椒的遗传转化体系

 以‘中椒5 号’甜椒和‘湘研10 号’辣椒子叶外植体为试料, 绿色荧光蛋白GFP 基因为报告基因, 通过观察检测愈伤组织的荧光表达与特异PCR 扩增鉴定, 分析了工程菌液pH 值、共培养基中乙酰丁香酮(AS) 的浓度、共培养时的温度与共培养时间对农杆菌转化辣椒效率的影响。结果表明, 在pH5.2、共培养基中加入AS 200 μmol·L ^{- 1} 、23 ℃黑暗条件下, 农杆菌与辣椒子叶共培养5 d , 有利于辣椒子叶的遗传转化,‘中椒5 号’、‘湘研10 号’愈伤组织荧光表达率均达到了40 %。     

萝卜遗传转化体系的建立

系统研究了影响根癌农杆菌介导的萝卜(Raphanus sativus L.)遗传转化的若干因素,建立了萝卜遗传转化体系:即切取萝卜带柄子叶外植体,先进行2 d预培养,用OD600为0.3~0.5的EHA105农杆菌菌液侵染5~7 min后,再进行5 d共培养,然后将外植体转接到MS+6-BA 6 mg.L-1+NAA 0.05 mg.L-1+Cef 500 mg.L-1的培养基上进行7 d延迟筛选,再将外植体转接到MS+6-BA 6 mg.L-1+NAA 0.05 mg.L-1+Cef 500 mg.L-1+Hyg 5 mg.L-1的培养基上进行10 d的抗性筛选。结果共获得126个抗性芽,其中8个抗性芽经PCR检测扩增出目的基因的启动子BcA9,约850bp,阳性率为6.3%,初步验证目的基因已经转入萝卜再生芽中。     

圆叶葡萄‘Noble’的芪合成酶STS启动子的功能分析

【目的】分析圆叶葡萄‘Noble’的芪合成酶(stilbene synthetase,STS)基因上游调控序列的顺式作用元件及其功能,为研究白藜芦醇在葡萄抗病机制中的作用提供理论基础。【方法】在前期通过染色体步移法分离得到圆叶葡萄‘Noble’芪合成酶Mr STS基因上游调控序列的基础上,利用Plant CARE在线启动子预测工具对其顺式作用元件进行初步预测,构建该启动子5’端侧翼序列缺失表达载体,启动报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达,并通过农杆菌介导法真空瞬时转化离体葡萄叶片,研究激素和霜霉菌诱导条件下GFP蛋白的活性差异。【结果】PlantCARE在线预测结果表明,Mr STS基因上游调控序列含有启动子的特定结构,如TATA-box、CAAT-box,另外也含有一些与逆境相关的顺式作用元件,如ABA响应元件ABRE、Me JA响应元件CGTCA-motif、赤霉素响应元件P-box、激发子响应元件Box-W1和胁迫响应元件TC-rich repeats等;不同诱导条件下,5’端侧翼序列缺失表达载体启动GFP蛋白的活性存在显著差异。【结论】Mr STS基因上游调控序列含有启动子核心区域和与逆境相关的顺式作用元件,并受ABA、Me JA和霜霉菌的诱导。     

绿色荧光蛋白基因转化柑橘胚性愈伤组织与高效再生

采用根癌农杆菌介导法对13份柑橘胚性愈伤组织进行绿色荧光蛋白基因(gfp)的转化,短时间内获得了温州蜜柑、橘橙杂种GWZ等11份柑橘材料的82个转化细胞系,其中佛罗斯特脐橙和日辉橘最易转化,分别获得28个和25个转化细胞系。选取3份材料的不同转化细胞系进行gfp的PCR分析,均获得了预期的gfp片段。研究表明,GFP标记可以在转化早期快速检测并分离转化子,及时剔除逃逸体,获得纯合的转化系;高水平的gfp表达不影响转化细胞增殖、生长和分化。这些带有GFP标记的转化细胞系为柑橘的有关基础研究提供了良好的试材,目前正用于柑橘体细胞杂交和不同倍性愈伤组织的社会化控制现象与机理等研究。     

极具潜力的重组药用蛋白的毛状根表达系统研究

对植物表达系统产生重组药用蛋白进行了简单的介绍,重点论述了利用发根农杆菌诱导的毛状根培养系统表达重组药用蛋白的研究及应用情况。     

根癌农杆菌介导的食用菌遗传转化研究进展

对根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化的机制和已成功应用的食用菌种类、转化的具体过程以及影响转化效率的因素等方面进行综述,总结目前农杆菌介导转化法在食用菌基因功能和外源蛋白表达上的应用,分析农杆菌介导食用菌构建随机插入突变体库等方面的问题,并对食用菌无筛选标记遗传转化的应用前景进行展望,以期为食用菌的转基因研究和工程菌株育种提供参考。     

萝卜抗真菌蛋白基因Rs-AFPs在大肠杆菌中的表达及其转化番茄的研究

 通过基因工程手段将萝卜抗真菌蛋白基因Rs-AFP_{1( 2)} 插入大肠杆菌表达载体pTrxFus中并诱导表达, 其融合表达产物约22 kD, 约占总可溶蛋白的0. 45% ( 0. 5%) 。抑菌活性试验表明: 重组Rs-AFP_{1( 2)}有抑菌活性, 其中Rs􀀁AFP2 较Rs􀀁AFP1 抑菌活性强。构建了Rs-AFP₂ 基因的植物表达载体pBIAFP₂。利用农杆菌介导法将pBIAFP₂ 导入番茄中, 并诱导出完整的植株32 株。对其中28 株进行PCR 和PCR-Southern Blot 检测, 其中17 株呈阳性。对经PCR Southern Blot 检测呈阳性的植株进行Southern Blot 检测, 6 株呈阳性。