兽医微生物菌种简易保藏方法

菌种是一项重要的生物资源,在科研和教学中发挥“活标本”或“活图书”的作用。先进的保藏方法如液氮保藏法、真空冷冻干燥保藏法等需要昂贵的仪器设备,并且一般的单位不具备这样的条件。为了使菌种的生命更好地得以延续,并保持它们原有的生物学特性,以便更好地为教学科研服务,本文就实验室常用的几种简易、安全、可靠的菌种保藏方法分述如下。     

3株瘤胃源乳酸菌冻干保护效果初步研究北大核心

试验旨在确定最佳保护剂组合及保藏温度,提高乳酸菌制剂冷冻保藏效果。试验以戊糖片球菌、海氏肠球菌、戊糖乳杆菌为研究对象,采用真空冷冻干燥技术,探究不同保护剂及保藏温度对乳酸菌冻干存活率及保藏存活率的影响。结果显示,保护剂3 (脱脂乳9.51%、葡萄糖7.56%、麦芽糊精7.77%)对戊糖片球菌和戊糖乳杆菌冻干保藏效果最好,冻干后存活率分别为81.80%和79.90%;保护剂1 (脱脂乳12%、海藻糖1%、谷氨酸钠1%、甘油3%)对海氏肠球菌冻干保藏效果最好,冻干后存活率为84.83%。乳酸菌冻干粉在-80℃条件下保藏效果更好。研究表明,采用保护剂1、-80℃保藏对3种乳酸菌制剂的长期保藏效果最好。     

兽医微生物学菌种简易保藏方法探讨

菌种是一项重要的生物资源,在科研和教学中发挥“活标本”或“活图书”的作用。先进的保藏方法如液氮保藏法、真空冷冻干燥保藏法等需要昂贵的仪器设备,而一般的单位不具备这样的条件。为了使菌种的生命更好地得以延续,并保持它们原有的生物学特性,以便更好地为教学科研服务,本     

副猪嗜血杆菌毒力菌株和猪支气管败血波氏杆菌毒力菌株双重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种能同时检测副猪嗜血杆菌(Hps)毒力菌株和猪支气管败血波氏杆菌(Bb)毒力菌株快速、准确的诊断方法,依据毒力血清型Hps OMP P2和Bb DNT基因序列分别设计合成引物,通过优化反应条件,成功建立了同时检测Hps毒力菌株和Bb毒力菌株的双重PCR方法。本试验建立的双重PCR法特异性强,重复性好,最低可检测核酸质量浓度分别达到1.79×10-3 g/L及8.3×10-3 g/L。使用该方法对来自四川地区部分猪场的36份猪呼吸综合征(PRDC)病料进行检测,结果检出率分别是33.33%和5.56%,与单一PCR结果一致,但高于细菌分离鉴定的准确率。试验结果表明该方法具有临床实用性,为四川地区Hps和Bb的诊断和预防奠定基础。     

酸奶生产用直投式乳酸菌发酵剂研究

对酸奶常用发酵剂菌种德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌亚种S-1、嗜热链球菌G1208的高密度细胞培养条件,低温真空冷冻干燥中抗冷冻保护剂的选择等进行了研究。结果发现,德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌亚种S-1在改良MRS培养基中的最佳培养条件为:培养温度43℃,起始pH值6.0,最高活菌数为1.2×109cfu/mL;采用3%蔗糖+3%海藻糖+10%β-环糊精+10%甘油+1%酵母膏+10%脱脂奶作为冻干保护剂,经低温冷冻干燥后,存活率为40.8%。嗜热链球菌G1208的最佳培养条件为:培养温度37℃,起始pH值7.0,对培养基配方进行优化后,最高活菌数为1.7×109cfu/mL;采用3%海藻糖+1%酵母膏+10%脱脂奶作为保护剂经低温冷冻干燥后,存活率可达96%。     

微生物简易保藏方法及其应用

微生物菌种保藏技术是微生物学及相关学科研究与发展的基础.如在医学、食品、环保、发酵工业等领域里的科研、生产中应用比较广泛.尤其在畜牧兽医行业中,做好微生物菌种的保藏工作是进行兽医生物制品研制与生产、益生素开发、畜禽养殖场环境生物控制研究等必要的工作前提.但是,先进的保藏方法如液氮保藏法、真空冷冻干燥保藏法等需要昂贵的仪器设备,且一般单位尚不具备这样的条件.如何在普通的实验条件下,实现简易、安全、可靠有效保藏呢?为此,笔者介绍几种简易方法可较好地解决这一问题。     

保加利亚乳杆菌B9冷冻保护剂的优化

保加利亚乳杆菌B9(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus B9)是一株具有优良酸乳发酵性能的乳杆菌。为开发B9菌株活性,为工业化发酵剂生产提供稳定菌种,本研究利用液氮深冷的方式对B9菌株进行冷冻保藏。以冷冻存活率评价指标,在对冷冻保护剂种类进行筛选,对保护剂配方进行正交优化,并确定菌体与保护剂最佳混合比例。结果表明,脱脂乳粉、甘油、海藻糖及Vc四种保护剂能对保加利亚乳杆菌B9起到良好的保护作用;正交优化确定保护剂配方为脱脂乳粉10%、甘油3%、海藻糖5%、Vc 0.075%(m:m),可使菌体解冻后存活率达到91%。     

山东省副猪嗜血杆菌分子流行病学调查及其外膜蛋白P2基因的表达纯化

根据副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)外膜蛋白(outer membrane proteins,Omp)P2基因序列(GenBank登录号:FJ685754.1)设计引物,对2015～2016年在山东省不同地区采集的225份病料进行PCR扩增和遗传演化分析,结果发现2015年和2016年Hps检出阳性率分别为7.63%、7.48%,细菌分离确定225份样品中17份为阳性;Hps菌株之间的氨基酸同源性在86.7%～99.7%,同源性较高的蛋白具有交叉反应性。构建Hps omp P2基因原核表达载体,确定OmpP2蛋白的最佳诱导温度,通过亲和层析Ni-IDA树脂纯化,获得高纯度的OmpP2蛋白,Western blot确定纯化的OmpP2蛋白与不同血清型的Hps阳性血清均存在良好的反应原性。本研究为进一步探索Hps OmpP2的生物学特性及对副猪嗜血杆菌病的血清学诊断、亚单位疫苗的开发奠定了基础。     

应用响应面法优化副猪嗜血杆菌冻干保护剂

旨在对副猪嗜血杆菌HS1712冻干保护剂进行优化，提高菌株在冷冻干燥后的存活率。以冻干存活率为评价指标，对配方中甘油、海藻糖、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、牛血清白蛋白(BSA)等5种成分缺失，考察其对副猪嗜血杆菌冻干存活率的影响。在此基础之上，结合单因素变量试验，应用Box-Behnken响应面法对脱脂奶粉、甘油、海藻糖的添加比例进一步优化。结果表明，配方中甘油、海藻糖缺失后，副猪嗜血杆菌冻干存活率显著下降(P<0.05)。通过对Box-Behnken试验结果进行回归模型拟合，得到最佳添加比例为脱脂奶粉6.8%、甘油2.2%、海藻糖2.7%,具体配方成分及添加比例为脱脂奶粉6.8%、甘油2.2%、海藻糖2.7%、PVP 0.5%。使用优化后配方进行冻干验证，副猪嗜血杆菌HS1712平均冻干存活率为79.20%,与预测值(80.87%)无显著性差异(P>0.05),表示模型可靠。上述结果表明，优化后的冻干保护剂可显著提高副猪嗜血杆菌HS1712冷冻干燥后的存活率。     

干燥和贮存对瘤胃固氮菌和纤维素分解菌存活率和活性的影响

为研究干燥和贮存对瘤胃固氮菌和纤维素分解菌存活率和活性的影响,本试验以瘤胃中分离的自生固氮菌和纤维素分解菌作为试验菌株,经过冷冻干燥和室温干燥处理,室温贮存30 d和90 d。平板计数法测定干燥菌株活菌数,通过瘤胃体外发酵评定干燥后存活菌株的活性。按活菌量4×109cfu/L(纤维素分解菌和固氮菌的活菌数比为4∶1)添加于瘤胃体外发酵体系中,培养24 h测定发酵参数、干物质降解率和产气量。结果表明:(1)冷冻干燥处理的菌株存活率高于室温干燥,后者为前者的53%~77%。(2)与对照组相比,室温干燥降低了产气量和干物质降解率(P0.05),但两种干燥方法处理的菌株对发酵pH值、氨氮(NH3-N)浓度、菌体蛋白含量、产气量和干物质降解率无显著影响(P0.05)。由此可见,冷冻干燥菌株存活率高于室温干燥,但两种干燥方法处理后存活菌株活性相近。     

鸭疫里氏杆菌保存条件的探讨

本试验对鸭疫里氏杆菌三水、南海各1株菌分别用室温-营养琼脂斜面法(A法)、4℃-营养琼脂斜面法(B法)、室温-石蜡油-营养琼脂斜面法(C法)、4℃-石蜡油-营养琼脂斜面法(D法)、鸭疫甘油复方保护剂法(E法)五种方法进行保存条件筛选。结果,A法最长保存时间为15天;B法最长保存时间为36天;D法最长保存时间为71天;C法保存至71天仍部分样本有存活;E法保存至71天全部样本仍存活。用E法进一步作鸭疫里氏杆菌多个菌株保存试验,结果珠海株、南海一场株、肇庆林文株、鸭疫V株、海丰株依次达到120天、195天、207天、385天、404天、540天仍有存活。试验结果为本菌种作短中期保存和长期保存提供了有效方法。     

家蚕病原细菌的甘油冷冻保存试验初报

家蚕病原细菌的保存,是家蚕病害防治研究及实验教学的基础环节之一。目前,家蚕病原细菌的保存,大多采用普通斜面低温保存法。因需每月转接一次,费事费力,比较麻烦。作者借鉴基因工程菌株的甘油冷冻保存法［１、２］,尝试进行家蚕病原细菌的长期保存,现将初步结果报道如下。１材料与方法１．１供试菌种 沙雷铁氏菌(Serratia marcescens)、黑胸败血病菌（Bacillus sp.）和青头败血病菌（Aeromonas sp.)由苏州大学蚕桑学院蚕桑系提供。１．２菌种保存方法 参照基因工程菌株的冷冻保存方法稍作修改。在２ｍｌ菌种冻存管中加１ｍｌ３０…     

水貂假单胞菌脂多糖菌苗研制初报

<正> 由假单胞菌引起的水貂出血性肺炎,传播快,流行时间长,死亡率高,对水貂饲养业有较大的危害。为了控制该病的发生与传播,我们用分离到的菌株,进行了脂多糖菌苗的研制,经实验动物证明效果良好。 一、水貂假单胞菌病脂 多精苗苗的制备 (一)Ho l、菌种:于1977年从某场暴发的水貂和毛丝鼠出血性肺炎病死水貂的心血和肝脏中分离而得。菌种经鉴定后用冷冻干燥法保存,通过小白鼠15代将菌株毒力提高后使用。     

胸膜肺炎放线杆菌真空冷冻干燥保护剂的比较

为研究胸膜肺炎放线杆菌(APP)在真空冻干保存中不同浓度、不同种类保护剂对菌株存活的影响,选用胸膜肺炎放线杆菌血清3型(S3)菌株与100 g/L的脱脂奶粉、200 g/L的脱脂奶粉、100g/L的脱脂奶粉 50 g/L的蔗糖3种保护剂混合后冻干,经过一定的时间后,复苏冻干菌种,观察胸膜肺炎放线杆菌存活率.结果表明,100g/L的脱脂奶粉 50 g/L的蔗糖作为保护剂对APP的保护效果最好,冻存菌株解冻后存活率95%以上,APP形态典型,CAMP特性未发生改变.     

屠宰生猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药物敏感性分析

为调查屠宰生猪副猪嗜血杆菌(Hps)的隐性感染情况,本研究从陕西省某规模化生猪屠宰场采集80份病变肺脏,应用PCR方法进行Hps核酸检测,无菌取阳性肺脏,通过平板划线分离获得疑似Hps,进一步对分离菌进行形态观察、培养特性分析、卫星现象观察、生化试验和分离菌核酸片段序列分析,纯化获得Hps分离菌;用药敏纸片法分析Hps分离菌株对常用药物的敏感性。结果显示,从80份病变肺脏中检出39份Hps阳性,阳性率48.75%(39/80);从39份Hps阳性肺脏中分离获得3株疑似Hps,分离菌在显微镜下呈革兰氏阴性、短杆状;在添加有胎牛血清和NAD的TSA平板上生长良好;在金黄色葡萄球菌周围呈现出典型的"卫星现象"生长;能发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麦芽糖和阿拉伯糖,不发酵甘露醇;PCR扩增序列与Hps同源性在98%以上。药物敏感性试验结果显示,3株分离菌对环丙沙星、恩诺沙星和氟苯尼考等抗菌药物高度敏感,对青霉素、林可霉素和甲氧苄啶等抗菌药物耐药。本研究获得的Hps分离株为疫苗研制提供了基础材料,为生猪养殖场选择敏感药物防控Hps感染提供了参考依据。     

禽源大肠埃希菌Biolog鉴定和系统发育分析

采用Biolog和16S rRNA基因序列分析法对中国兽医药品监察所菌种室收集保藏的18株大肠埃希菌(Escherichia coli)进行了鉴定.菌株经纯化培养,用Biolog微生物鉴定系统进行了鉴定,结果表明18株菌株为大肠埃希菌.提取基因组DNA,采用16S rRNA通用引物,用PCR进行16S rRNA基因序列扩增,扩增产物纯化后进行测序.序列经人工校对后用Clustal X 1.83软件进行比对分析,采用Mega 3.1软件构建系统发育树,结果表明18株菌株为大肠埃希菌.     

枯草芽孢杆菌的培养

细菌固体培养具有对设备条件要求低、耗能低、细菌繁殖量高的特点。枯草芽孢杆菌作为微生物饲料添加剂具有广泛的应用价值。本实验通过计数细菌的繁殖数量 ,探讨了最适于枯草芽孢杆菌生长的固体培养基的组成和收获时间。1　材料1 .1　菌种　枯草芽孢杆菌菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。1 .2　培养基　营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、固体培养基 ,全都自行制做。2　方法2 .1　菌种培养　将芽孢杆菌菌种在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上 ,然后在恒温箱内 37℃培养 2 4 h,即可见到一层白色圆整、边缘光滑的枯草芽孢杆菌菌落…     

猪源肠道嗜酸乳杆菌的分离、鉴定与驯化

本文旨在分离筛选适于在猪肠道生长的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)菌株。选用仔猪新鲜粪便,利用MRS培养基,以平板划线法分离纯化菌株;采用形态、生理生化和16 SrRNA基因序列分析对分离菌株进行鉴定;通过逐步提高培养基酸度、胆盐浓度和培养温度,对分离菌株进行驯化。结果表明:1)经分离纯化获得的菌株La-5,被鉴定为嗜酸乳杆菌。2)驯化后的菌株La-5c在pH=1.5~3时存活率比原始菌株La-5高出36%~44%,极低pH(1.5)条件下仍有37%的存活率。3)在0.03%~0.3%胆盐中的存活率为85%~90%,而原始菌株La-5为28%~53%。4)在50℃时的存活率为66.1%,而原始菌株La-50.01%。由此可见,与仔猪粪便分离纯化的嗜酸乳杆菌原始菌株La-5比较,驯化获得的菌株La-5c具有耐低pH、高浓度胆盐及高温的特性。     

花椒籽发酵做固体饲料的研究

花椒籽中含有大量蛋白质和油脂,但也含有酰胺类(麻味)物质。本文通过对实验室保藏菌种的培育和筛选,确定降解花椒酰胺类物质的菌种,并通过正交试验,将菌种在适宜条件下继续各自单独培养及混合培养。结果表明:产朊假丝酵母(Candida utilis)及白地霉(Geotrichum candidum)的混合菌种降解花椒酰胺类物质的效果最好。经过重复试验验证,菌种的最佳降解生长条件为:温度28℃,料液比1:1,接种量10%,时间24h。生长元素添加最佳条件为:(NH4)2SO40%,KH2PO40.2%,MgSO40.01%,葡萄糖0.5%。花椒酰胺类物质平均残留量为3.5776mg/g。     

冷冻真空干燥活疫苗的真空度检测

冷冻真空干燥活疫苗(简称冻干疫苗),是指将活疫苗按适当比例,与含有大量水份的稳定剂混合成为悬浮液,分装后放入冷冻真空干燥机(简称冻干机)中,经预先冻结,在低温和真空条件下使水份升华,干燥成疏松多孔状、体积不变的干燥制品。由于冷冻干燥是在低温真空状态下完成的,可以保护蛋白质不变性,减少氧化环节,使微生物和某些酶活性不受影响。同时冻干疫苗在真空状态下封口保存,具有保存时间长,使用时加稀释液能迅速溶解,复原性状不变等优点。是目前活疫苗最常用的保存方法。冻干疫苗真空度的检测最直观、简便的方法是用市售的高频火花真空检测器…