水稻种子胚乳蛋白的双向电泳分析技术

为探讨水稻灌浆期间与籽粒充实相关蛋白表达的变化，建立了一套适于水稻种子胚乳蛋白双向电泳分析技术，探讨了胚乳蛋白的提取、纯化以及双向电泳的一些关键技术．结果表明，通过乙醇铵沉淀、高压等电聚焦和两步平衡等方法可以获得较好的分析结果，获得胚乳蛋白斑点数约350个，等电点范围在3．0～9．0，其中大部分集中在4．0～7．0．     

蜂蜜蛋白提取以及双向电泳技术分析蜂蜜蛋白条件优化

[目的]研究蜂蜜中蛋白质提取的有效方法,优化蜂蜜蛋白电泳条件。[方法]该试验使用丙酮、钨酸钠、硫酸铵、尿素-硫脲4种方法提取蜂蜜中的蛋白并进行比较,然后进行双向电泳分析,对影响双向蛋白电泳的IPG胶条的选择、蛋白质上样量、等电聚焦时间等主要因素进行优化。[结果]试验表明,采用硫脲法提取蜂蜜蛋白获得的蛋白含量最高,硫脲法和丙酮沉淀法获得的蛋白纯度最好,而硫脲法因干扰物质较少、易于裂解适于双向电泳技术,采用硫脲法提取的蜂蜜蛋白选择IPG胶条p H 5~8,蛋白上样量为150μg,等电聚焦时间达到32 000 V·h的情况下能充分地聚焦,获得的双向电泳图谱最佳,优化后的洋槐蜜双向电泳图谱上可检测到326个蛋白点,重复性和分辨率均较好。[结论]蜂蜜类含糖样品中使用硫脲法提取蛋白能减少糖类物质干扰。     

菜籽蛋白质组双向电泳技术体系的优化研究

[目的]建立适用于菜籽蛋白质组研究的双向电泳技术。[方法]以湘油17号为材料,对双向电泳技术中的样品制备方法、凝胶浓度、上样量等条件进行了优化。[结果]使用TCA一丙酮法提取菜籽总蛋白最佳,所获蛋白在2-DE图谱上获得的点数最多。当采用pH3～10IPG胶条和12％的凝胶、上样量为250μg时,可得到背景清晰、重复性好、蛋白点分辨率较高的双向电泳图谱。[结论]为开展油菜种子蛋白质组学研究奠定了基础。     

茭白线粒体蛋白双向电泳体系建立

[目的]建立适合于茭白线粒体蛋白质组分析的双向电泳技术体系,为进一步开展茭白线粒体差异蛋白质组学研究提供参考.[方法]以茭白为试验材料,比较不同线粒体提取纯化方法、IPG胶条pH范围及蛋白上样量等条件对双向电泳图谱的影响.[结果]差速离心(3000~14000×g)联合Percoll不连续密度梯度离心(20%∶24%∶40%=2∶4∶2)对茭白线粒体的提取纯化效果优于仅采用差速离心.采用改良酚抽法提取茭白线粒体蛋白,17 cm、pH 3~10的IPG胶条,1.0 mg上样量,12% SDS-PAGE进行双向电泳,0.12%考马斯亮蓝G-250胶体考染法染色,茭白线粒体蛋白主要分布在pH 4~8范围内,pH 3~4和pH 8~10范围内蛋白点较少;进一步选用pH 4~7和pH 5~8的IPG胶条对茭白线粒体蛋白进行双向电泳,分离效果均明显提高,且pH 4~7范围内IPG胶条的双向电泳图谱清晰,蛋白点分辨率较高.分别采用0.8、1.0和1.2 mg 3个不同的上样量进行双向电泳,结果表明上样量为1.0 mg时,电泳图谱质量最好.[结论]通过差速离心联合Percoll不连续密度梯度离心提取纯化茭白线粒体,并控制好双向电泳体系的pH范围、上样量等因素,可获得蛋白质点清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱.     

菜籽蛋白质组双向电泳技术体系的优化研究(英文)

[目的]建立适用于菜籽蛋白质组研究的双向电泳技术。[方法]以湘油17号为材料,对双向电泳技术中的样品制备方法、凝胶浓度、上样量等条件进行了优化。[结果]使用TCA-丙酮法提取菜籽总蛋白最佳,所获蛋白在2-DE图谱上获得的点数最多。当采用pH3～10IPG胶条和12%的凝胶、上样量为250μg时,可得到背景清晰、重复性好、蛋白点分辨率较高的双向电泳图谱。[结论]为开展油菜种子蛋白质组学研究奠定了基础。     

鸳鸯茉莉花瓣蛋白质双向电泳技术的优化

为探索适用于鸳鸯茉莉花瓣蛋白质双向电泳技术的方法,采用酚抽提取法对IPG胶条及蛋白质上样量等关键步骤进行优化。结果显示,鸳鸯茉莉花瓣蛋白质在p H值为4.0-7.0,24 cm IPG胶条范围分离效果较好,并且当上样量为1.5 mg时,在双向电泳图谱上检测到的蛋白点较多且清晰,分辨率较好。     

野生稻种子胚乳蛋白的提取及双向电泳条件的确立

为揭示野生稻与栽培稻之问种子贮存的差异,建立了一套适合于水稻胚乳蛋白双向电泳分析的技术。探讨了种子胚乳蛋白的提取、纯化以及双向电泳的一些关键技术。结果表明,直接使用提取液（7M尿素,2M硫脲,4％3-[3-（胆酰氨丙基）二甲铵基]丙磺酸内盐,0．5％等电聚焦缓冲液3—10,40mM二硫苏糖醇）对单位米粉进行抽提后,直接离心上样,可以防止样品蛋白的丢失,保证样品蛋白的完整性,而在等电聚焦时,延长除盐时问,可以有效地减少凝胶中的横纹和竖纹,通过二向电泳分析结果,我们从合系41种子胚乳中得到蛋白斑点数约为310个,从滇超9号种子胚乳中得到蛋白点数约为327个,普通野生稻中得到蛋白点数约为331个,药用野生稻种子胚乳中得到蛋白点数约为346个,疣粒野生稻种子胚乳中得到蛋白点数约为278个。     

适于番茄叶片蛋白质组分析的双向电泳优化体系的建立

[目的]建立适于番茄叶片蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)技术,为开展番茄蛋白质组学研究奠定技术基础.[方法]对番茄叶片蛋白质提取方法、蛋白质裂解液、上样量、胶条pH范围等关键步骤进行优化.[结果]采用三氯乙酸／丙酮法提取番茄叶片总蛋白质,含有7 moL/L尿素,2 mol/L硫脲,4; CHAPS,30 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)裂解缓冲液,上样量为100 mg,以pH 4 ～7、18 cm的IPG胶条在12; SDS-PAGE凝胶浓度下进行双向电泳,得到了蛋白点均匀分布、低峰度蛋白点较为清晰,蛋白点数目多且分辨率高的2-DE图谱.[结论]建立了一套适于番茄叶片蛋白质分析的双向电泳技术体系,为下一步在蛋白组学水平上分析番茄逆境胁迫等相关蛋白提供了技术支持.     

棉花纤维蛋白双向电泳体系的建立

[目的]探索一套适合于棉花纤维蛋白的双向电泳技术,为研究棉花纤维发育的蛋白质组学奠定基础.[方法]以陆地棉徐州142为材料,比较了三种不同蛋白质提取方法以及不同裂解液组成对双向电泳的影响,并在蛋白上样量和染色方法等方面进行了探索与优化.[结果]利用饱和酚-甲醇醋酸铵法提取的棉花纤维蛋白,其蛋白含量较高,且SDS-PAGE电泳条带清晰;样品溶解于含有硫脲和CHAPS的裂解液中,其蛋白溶解度增加;不同的蛋白上样量比较结果表明,第一向等电聚焦固相pH梯度胶条(7 cm)的最适上样量为300 μg;同时,经改良后的考马斯亮蓝染-脱色后,2-D图谱的背景清晰,分辨蛋白斑点数增加.[结论]研究建立了一套适用于棉花纤维蛋白总蛋白质组分析的双向电泳方法.     

分蘖洋葱叶片总蛋白提取与双向电泳条件优化

以分蘖洋葱叶片为试验材料,比较3种不同蛋白质提取方法对2-DE蛋白质双向电泳结果的影响,并对其中的蛋白上样量、SDS-PAGE凝胶浓度及双向电泳重复性进行筛选与优化。结果表明,与酚提取法和改良的酚提取法相比,TCA-丙酮提取法提取分蘖洋葱叶片总蛋白的操作简便,所得双向电泳图谱背景清晰,蛋白质点圆滑,数量及质量均较好,是一种切实可行的提取分蘖洋葱叶片总蛋白方法。应用Image Master 2D Platinum 7.0软件对图谱进行分析,凝胶上检测到超过650多个蛋白质点,不同凝胶之间蛋白质的匹配率达92.5%,具有较高的分辨率和重复性,建立一套适用于分蘖洋葱叶片总蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)方法。     

海滨木槿叶片蛋白质双向电泳体系的建立

为建立一套适合海滨木槿叶片蛋白质组学分析的双向电泳体系,以海滨木槿无性系叶片为材料,分别采用裂解液法、三氯乙酸一丙酮沉淀法、改良酚抽法分离纯化蛋白质,选用24empH3—10的IPG胶条,并对不同上样量、等电聚焦程序、平衡时间等电泳条件进行优化。结果表明：采用改良酚抽法提取蛋白质,上样量为每IPG胶条1000μg,总聚焦功率90kV·h,平衡时间15min,胶体考马斯亮蓝染色,可得到蛋白质点数目多、分辨率高的双向电泳图谱。重复性试验结果显示,该体系具有很好的稳定性及可重复性,可满足海滨木槿蛋白质组学研究的要求。     

大麦淀粉胚乳发育期间程序性细胞死亡的研究

 【目的】大麦胚乳发育过程中,淀粉胚乳细胞变成死细胞,本研究阐明这种死亡方式是一种特殊形式的程序性细胞死亡（PCD）。【方法】利用透射电镜和荧光显微镜观察淀粉胚乳细胞核的结构变化,利用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL检测DNA断裂,并对抗氧化酶活性动态和籽粒灌浆速率进行测量。【结果】伴随淀粉胚乳发育进程,大麦淀粉胚乳细胞核呈现出核变形、染色质凝集、核膜破裂和核瓦解形成核残体等一系列PCD过程中核的变化特征。琼脂糖凝胶电泳和TUNEL结果都表明,核DNA发生了有规律的断裂,但DAPI染色结果却表明,核残体并没有从死亡的淀粉胚乳细胞中消失,而是分散存在于淀粉粒之间。Evan’s blue染色表明,死亡的淀粉胚乳细胞在胚乳组织中是随机发生的。在淀粉胚乳细胞核衰退解体和无核的胞质发育过程中,胚乳内抗氧化酶都存在一定的活性,籽粒的粒重也在不断增加。【结论】大麦淀粉胚乳在核衰退解体和无核化的胞质发育时期,胚乳细胞维持较高的代谢活性,没有表现衰退解体特征,直到被贮藏物质所充实才死亡,淀粉胚乳细胞的发育是一种特殊形式的PCD过程。     

苔藓植物双向凝胶电泳蛋白样品制备的优化

比较了苔藓植物小立碗藓3种蛋白样品制备方法,结果分析表明,直接研磨法和三氯乙酸（TCA）/丙酮（acetone）沉淀法检测的蛋白点的数量相差不明显;直接研磨法提取蛋白所得到的2-DE图谱蛋白点模糊,分辨率低,横竖条纹干扰严重;三氯乙酸（TCA）/丙酮（acetone）沉淀法分离效果较好,分辨率有所提高.改良的酚抽提/乙酸铵沉淀法检测的蛋白点远远多于前两种方法,所得到的图谱质量最高,分辨率大大提升,蛋白点分布均匀清晰,横竖条纹干扰也很少,凝胶背景干净,是最佳的小立碗藓蛋白样品制备的方法.     

白桦木质部蛋白提取方法的建立1）

以白桦（ Betula platyphylla Suks．）木质部为试验材料,分别采用TCA—丙酮提取、酚提取和试剂盒提取3种方法提取白桦木质部总蛋白。利用试剂盒定量和聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向电泳技术比较3种提取方法的蛋白质提取效率、提取质量。同时对酚提取法进行改良,建立适用于白桦木质部蛋白的提取方法。研究结果表明,改良的酚提取法提取的白桦木质部蛋白提取量最大,电泳条带清晰,丰富,质量较高。2－DE电泳得到的蛋白凝胶背景干净,蛋白质点清晰。因此,改良的酚提取法是较适合于白桦木质部蛋白的提取方法。     

青杨双向电泳实验体系的建立

用改良丙酮沉淀法、三氯乙酸（TCA）-丙酮沉淀法和酚抽法抽提青杨Populuscathayana的蛋白质,分别获得了437,603和721个蛋白斑点,以酚抽法提取的分离纯化方法效果最佳,不仅能很好地提取蛋白,而且能有效去除样品中的盐分。通过比较,分析了双向电泳不同条件对电泳结果的影响,确立了300μg·IPG胶条^-1的最佳上样量、90000V·h的聚焦时间以及20min平衡时间的双向电泳条件。研究还比较了氯化钠胁迫前后双向电泳图谱差异,发现有46个蛋白点存在差异,其中10个下调,36个上调（4个新诱导表达）。     

NaHCO3胁迫下刚毛柽柳叶片蛋白质差异表达谱的建立

目的为了研究刚毛柽柳响应盐胁迫的作用机制, 本研究以刚毛柽柳叶片为材料, 对叶片总蛋白质的提取方法进行优化, 探究出适用于双向电泳的刚毛柽柳叶片总蛋白质的提取方法, 并建立NaHCO₃胁迫下刚毛柽柳叶片差异蛋白质的表达谱。方法本研究比较了改良Tris-三氯乙酸, 改良Tris-三氯乙酸+PVP40, 改良Tris-三氯乙酸+丙酮和植物蛋白提取试剂盒法4种提取植物蛋白质的方法提取刚毛柽柳叶片总蛋白质的差异, 并利用蛋白质双向电泳用技术研究NaHCO₃胁迫后刚毛柽柳叶片蛋白质表达变化, 建立了盐胁迫下刚毛柽柳叶片差异蛋白表达谱。结果采用改良Tris-三氯乙酸法提取刚毛柽柳叶片蛋白质, 利用该方法可获得高质量的蛋白质样品, 所得到的双向电泳凝胶图谱中蛋白质分离效果好、图谱分辨率高, 通过ImageMaster 2D Platinum 7.0凝胶分析软件对NaHCO₃处理0和12 h的双向电泳凝胶图谱进行分析, 获得了25个响应盐胁迫的差异表达蛋白质, 并分析了差异表达蛋白量的变化。结论研究结果表明, 利用改良Tris-三氯乙酸法提取刚毛柽柳叶片蛋白质适用于双向电泳体系, 该方法可以用于对刚毛柽柳叶片蛋白质组学的研究。本研究建立了NaHCO₃胁迫下刚毛柽柳叶片差异蛋白质的表达谱, 为进一步分析刚毛柽柳耐盐分子机制奠定了基础。