福建省猪伪狂犬病病毒新流行株gD、gE基因遗传变异分析

为了解福建地区猪伪狂犬病病毒(PRV)流行毒株的分子生物学特性与变异规律。本试验分离了2011-2013年福建省不同地区的11株PRV,并对其gD、gE基因进行遗传变异分析。结果表明,福建地区被检测的规模化猪场均存在野毒感染,病料接种PK-15细胞均能出现典型的细胞病变,分离的毒株接种家兔能出现典型的伪狂犬病症状。PRVgD、gE基因序列分析表明,自2011年福建地区PRV同源性较高且处于一个独立的分支,表明福建地区流行的PRV可能存在一定的抗原变异。     

猪伪狂犬病病毒变异毒株HeNZK-2014的分离鉴定及gE基因序列分析

为了解猪伪狂犬病病毒（PRV）变异毒株的特点,本研究采集临床疑似PRV感染发病猪的淋巴结等组织样品进行PCR鉴定,选取仅PRV阳性的组织样品经研磨除菌后取上清接种于PK-15细胞进行病毒分离培养、蚀斑纯化、PCR和间接免疫荧光法（IFA）鉴定,采用Reed-Muench法测定PRV的TCID₅₀,接种小鼠并观察临床症状,对纯化的PRV和死亡小鼠脑组织样品进行gE基因PCR扩增及测序分析。结果显示,PRV阳性病料接种于PK-15细胞24 h后出现典型细胞病变（CPE）,经3轮蚀斑纯化后PCR和IFA鉴定结果均为阳性,分离株命名为HeNZK-2014,其TCID₅₀为10^-9.77/0.1 mL;以1×10⁸个TCID₅₀病毒悬液接种小鼠22 h后可引起小鼠出现奇痒、撕咬、死亡等典型猪伪狂犬病症状,死亡小鼠脑组织样品PRV PCR检测结果为阳性;纯化病毒和死亡小鼠脑组织样品gE基因核苷酸序列同源性为100.0%,与GenBank中2011年以前登录的经典毒株位于不同分支,与2011年之后中国流行毒株位于同一分支,在第48和496位各有1个天冬氨酸（D）的插入,具有变异毒株的典型特征。本研究成功分离了1株PRV变异毒株,为进一步开展针对PRV变异毒株的疫苗及其防控研究奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒FZ-2012株的分离鉴定及其gE基因的遗传演化分析

从福建省某猪场采集疑似猪伪狂犬病的病料接种PK-15细胞,通过PCR法、动物试验证实所分离的病毒为猪伪狂犬病毒(PRV),命名为FZ-2012,经测定该病毒株TCID50为10-9.40/0.1mL。根据Gen Bank已公布的PRV gE基因序列设计了1对特异性引物,将PCR扩增片段进行克隆测序,与国内外已发表的2012年以来15个新分离毒株、11个经典毒株进行同源性比对分析,并构建遗传进化树。结果表明:FZ-2012株gE基因序列全长1740 bp,编码579个氨基酸,与新分离毒株gE基因氨基酸序列的同源性为97.6%~99.3%,与经典毒株的氨基酸序列同源性为95.0%~98.6%;遗传进化关系表明,FZ-2012毒株与新分离毒株同属一分支,而与经典毒株分属2个不同分支。本研究首次报道福建省存在PRV新流行毒株,为丰富福建省猪伪狂犬病的分子流行病学和开发猪伪狂犬病新型疫苗奠定基础。     

猪伪狂犬病病毒野毒株的分离鉴定及gC、gD基因序列分析

2019年河南某猪场暴发疑似猪伪狂犬病疫情,本试验采集发病猪的病料组织,进行伪狂犬病病毒(PRV)毒株的分离鉴定,并分析分离毒株的生物学特性。结果显示：分离毒株HNCY的TCID₅₀为10^-8.48/0.1 mL;一步生长曲线显示,分离毒株在12～24 h复制较快,48 h到达最高峰;分离毒株对小鼠具有较强的致死性,且肺脏中病毒含量最高;序列分析显示,HNCY株gC基因核苷酸序列与国内外PRV分离毒株的同源性为95.9%～100.0%,gD基因同源性为98.9%～100.0%;gC氨基酸序列与国内外PRV分离毒株的同源性为92.9%～100.0%,gD氨基酸同源性为97.5%～100.0%,且国内同源性高于国外;遗传进化分析显示,HNCY分离株gC、gD基因与欧美毒株在不同的大分支上,亲缘关系远;与国内分离株在同一分支上,且与2011年之前分离的PRV毒株在不同的小分支上,表明HNCY分离株属于国内变异毒株。     

猪伪狂犬病病毒北京株的分离鉴定

从北京某猪场疑似猪伪狂犬病发病死亡仔猪脑及内脏中分离到1株病毒并进行了鉴定。该分离毒株接种ST细胞24 h后出现圆缩、聚集、脱落等典型的细胞病变(CPE);分离毒株能够被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;分离病毒接种家兔后,引起家兔出现奇痒等典型的伪狂犬病临床症状;同时根据GenBank公布的PRV的gD基因设计引物并扩增出特异性的目的片段,扩增产物经过测序比较,表明扩增产物序列为猪伪狂犬病病毒基因序列。以上结果证实该病毒为猪伪狂犬病病毒,依据分离地点命名为猪伪狂犬病病毒北京株。     

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE基因序列分析

从福建省某猪场疑似伪狂犬病的发病3日龄仔猪的脑、肺脏中分离到1株病毒.该病毒接种家兔出现了典型的伪狂犬病症状,接种PK-15细胞36 h后出现了圆缩、集聚、脱落等典型的细胞病变,猪伪狂犬病病毒阳性血清能特异性中和该分离病毒.根据已发表的伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列,设计并合成了一对引物,采用PCR方法可扩增特异性298 bp的DNA片段.测序结果与GenBank中有代表性的6株参考毒株相应基因序列比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.5%~99%和91.8%~98%.系统进化树结果表明分离株与湖北分离株Ea株亲缘关系最近.     

两株猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及gB、gC和gE基因的分子特征分析

为探明近年来河南省猪伪狂犬病病毒(PRV)的遗传变异情况,本研究于2017年采集河南漯河和中牟地区疑似伪狂犬病发病养殖场送检的脑组织病料,通过细胞盲传、噬斑纯化、间接免疫荧光试验、Western blotting和透射电镜技术进行病毒分离鉴定。TCID_(50)法测定分离毒株的病毒滴度、生长曲线,通过小鼠感染试验测定分离毒株对小鼠的致死性。对gB、gC和gE基因进行PCR扩增、测序,并与参考毒株序列进行比对分析。结果显示,对PCR鉴定阳性的病料在PK-15细胞盲传后,两份病料在6代内均出现细胞病变,通过间接免疫荧光试验、噬斑纯化和透射电镜技术,成功分离鉴定了两株PRV,分别命名为HeN-LH株及HeN-YM株。分离毒株在PK-15细胞上的生长曲线显示,HeN-LH和HeN-YM株在感染后36 h病毒滴度分别可达10~(8.35)和10~(6.63) TCID_(50)/mL。用不同浓度的病毒接种小鼠,结果显示,HeN-LH和HeN-YM株LD_(50)分别为10~(2.13)及10~(3.25) TCID_(50)。对gB、gC和gE基因全长扩增测序后构建遗传进化树,结果显示,两株PRV毒株与Bartha、Fa和Ea等经典株的亲缘关系相对较远,而与2011年以来国内不同省份分离的PRV变异株亲缘关系较近。氨基酸序列比对分析显示,与其他变异株相似,gB、gC和gE基因均发生了多个氨基酸的变异,且在特定的位点存在特征性的氨基酸插入和缺失。本研究成功分离鉴定了两株PRV变异株,分离株对小鼠均表现出一定的致病性,本试验结果可为河南省伪狂犬病的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。     

伪狂犬病病毒FJMH1907b株的分离和gD基因的演化分析

为探究福建省新流行的猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)gD基因的遗传进化情况,根据GenBank已公布的PRV gD基因序列设计1对特异性扩增引物,对新分离PRV FJMH1907b株的gD基因进行PCR扩增、测序,与国内外已发表的15个毒株进行同源性比对分析,并构建遗传进化树.新分离FJM...     

潍坊某猪场一起伪狂犬病的诊治

2014年9月山东潍坊某猪场发生疑似猪伪狂犬病疫情,采集病死仔猪的脑组织等,利用Vero细胞做病毒分离,并设计一对伪狂犬病病毒(PRV)g E基因片段的特异性引物对分离病毒进行PCR鉴定及家兔接种试验。结果表明:脑组织上清液接种Vero细胞后有典型的细胞病变;PCR扩增产物电泳后显示出990bp长的目的片段,目的片段基因序列与6株PRV毒株的g E基因序列核苷酸同源性在97.7%~100%之间,证实该病毒为PRV;分离病毒接种家兔出现典型的伪狂犬病症状。临床诊断结合实验室鉴定以及动物接种试验,确诊该病例为猪伪狂犬病。     

一例猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及综合防治措施

无菌采集疑似猪伪狂犬病病猪脑组织,进行病毒的分离鉴定。经PCR检测为阳性的病料接种PK-15细胞进行病毒分离,将所分病毒暂命名为SC株。蚀斑实验测定病毒滴度,并采用PCR和琼扩实验对其进行进一步鉴定。结果:PRV阳性病料接种PK-15细胞,传至第5代后产生稳定细胞病变,主要表现为细胞变圆、变亮、聚堆且可见典型的空斑,而对照组细胞贴壁生长良好;基于PRV gE基因的PCR检测,扩增产物为378 bp,与预期目的条带一致;用病毒蚀斑技术测定该分离株的滴度为2.65×104 PFU/mL;琼扩实验显示病毒原液至32倍稀释后均能与PRV阳性血清形成可见沉淀线。以上结果均表明所送检病猪为PRV阳性,据此为猪场提出综合防治措施。     

猪伪狂犬病病毒福建株gB、gD基因的克隆和序列分析

参照已发表的扩增伪狂犬病毒（pseudorabies virus, PRV）gB和gD表位基因的PCR扩增引物合成2对引物,以福建分离株（LY株）提取的DNA为模板,得到目的片段gB、gD基因的长度分别为578和653 bp,并进行了克隆和测序,然后与国内外其他分离株进行了核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分析,并构建了遗传进化关系图。结果表明,LY株与GenBank中收录的国内外有代表性的标准参考分离株相比,gB、gD基因核苷酸序列的同源性分别为74.9%～98.8%、97.2%～98.1%;氨基酸序列的同源性分别为62.9%～96.4%、94.5%～96.8%。进化分析结果表明,LY株与目前国内流行的毒株在同一个进化分支内,和Ea株（湖北）、LA株（山东）亲缘关系最近,与国外分离株有一定差异。     

鉴别猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法的建立和应用

为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因缺失疫苗和野毒感染的快速鉴别诊断方法,本研究根据猪伪狂犬病野毒具有gD表面抗原基因和gE毒力基因,而基因缺失疫苗只有gD基因无gE基因的特性,针对gD/gE基因的5'端核苷酸序列自行设计引物,建立鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测.结果表明,成功建立了鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,该方法灵敏度高,最低检出限为100拷贝/μL;重复性好;特异性强,可特异性地扩增出PRV细胞毒中的gD和gE基因及gE基因缺失疫苗毒中的gD基因,但对PK-15细胞和猪流行性腹泻病毒等其他8种病原扩增不出任何条带;自835份临床疑似PRV感染病料中共检测出PRV gD和gE基因双阳性样品即野毒感染阳性样品267份,PRV gD基因单阳性样品28份,选取该方法检测出的26份PRV野毒感染阳性样品用于病原分离培养,两种方法的符合率为96.1%.说明本试验建立的二重PCR鉴别诊断方法快速、灵敏、特异,对于临床上疫苗毒和野毒感染的快速鉴别诊断具有重要意义.     

猪伪狂犬病病毒HP-SY2022株的分离鉴定

为了解猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)野毒株的特点,本研究对沈阳某养殖场疑似感染PRV的组织病料进行PCR鉴定、病毒分离和纯化、gD、gE基因序列测定及分析、动物回归实验。结果显示：分离株能在ST细胞中产生典型的细胞病变,且PCR显示为PRV阳性;通过gD、gE基因进行序列分析发现,分离株与2011年后分离的PRV变异株位于同一进化分支;氨基酸位点分析发现分离株与PRV变异株具有相同的变异模式。进一步研究其致病性,将纯化后的病毒液接种PRV抗体阴性21日龄健康仔猪,感染仔猪出现典型的PR症状,如呼吸困难、转圈、流涎和划水动作,且在试验期内仔猪全部发病(5/5),其中4头死亡(4/5)。综上,本研究成功分离到一株PRV变异株,将其命名为HP-SY2022。这一研究为丰富我国PRV分子流行病学及后续的免疫防控提供了参考。     

一例牛急性感染伪狂犬病病毒的分离鉴定

山东东营地区某牛场发生以流涎、眼睑肿大、表现为神经症状为主的疾病,通过采集病牛鼻腔试子,提取病毒基因组DNA,感作乳仓鼠肾(BHK-21)细胞,经细胞传代培养出现明显特征病变。以伪狂犬病病毒(PRV)高度保守的gB基因扩增引物进行PCR扩增,获得特异性的DNA片段,连接PMD18-T载体,测序鉴定与PRV SC株同源性高达99%以上。确诊为牛感染伪狂犬病病毒。     

Isolation and Identification of Variant HeNZK-2014 of Pseudorabies Virus and Sequence Analysis of gE Gene

In order to learn the situation of pig pseudorabies virus (PRV) variant in this study, tissue samples such as lymph nodes which were collected from clinical pigs with suspected PRV infection were identified by PCR. PRV positive sample were inoculated on PK-15 cells after grinding and degerming, with further experiment including virus isolation, plague purification, PCR and IFA identification, TCID₅₀ confirmed by Reed-Muench method, inoculation test and observation of clinical symptoms in mice. The gE gene of purified PRV and brain tissue samples of dead mice were identified by sequencing analysis. The results showed that the virus grown on PK-15 cells could produce typical cytopathic effect (CPE) after 24 h; After three rounds of plaque purification,the isolate was PRV positive identified by PCR and IFA, and nominated as HeNZK-2014; The TCID₅₀ of the isolate was 10^-9.77/0.1 mL; The virus in 1×10⁸ TCID₅₀ inoculation was able to cause itching, tearing, death in infected mice, and PRV could be detected in tissues of dead mice; The molecular genetic variation analysis of gE gene by PCR amplification and clone sequencing indicated that the gE gene from brain tissue of infected mice shared 100.0% homology with HeNZK-2014, and located in a relatively independent branch with newly pandemic isolates in recent years after 2011, but was far from the classical strains before 2011, and both had two insertion of aspartic acid (D) at sites of 48 and 496 amino acids, which were considered to be the typical characteristics of PRV variants. This study successfully isolated a PRV variant, which laid a foundation for further research on vaccine development, prevention and control against PRV variants.     

三种PCR方法诊断猪伪狂犬病的比较研究

针对伪狂犬病毒gD基因的不同片段设计三对引物，分别进行PCR扩增用于猪伪狂犬病的诊断，扩增的三个片段的长度分别为262bp、217pb以及1203bp的全基因。通过比较发现，这三种PCB诊断方法均具有很高的特异性和敏感性，值扩增gD基因内部262bp的PCR诊断方法种具有突出优点，其退火与延伸合成一步，其操作可于1h内完成，敏感性更高，更适于猪伪狂犬病的快速诊断。     

Isolation,Identification and Phylogenetic Analysis of Important Functional Genes of Porcine Pseudorabies Virus LC Strain

To find out the reason of the reproductive failure in pregnant sows in a hoggery in Guangdong, the mixture with brain, lymph nodes and lungs of farm abortion stillbirth were identified by PCR, virus isolation and culture, tissue culture infective dose (TCID₅₀) assay, homology and phylogenetic analysis of the important functional genes (gB, gC, gD and gE) and animal test. The results showed that the mixture was proved to be porcine pseudorabies virus (PRV) positive samples. The typical cytopathogenic effect was induced in the third passage of Vero cell and the titer of the fifth passage was 10^-6.8/0.1 mL. The sequence analysis and phylogenetic relationship of gB, gC, gD and gE genes showed that it was a Chinese PRV variant, which was named as LC strain. The typical pseudorabies clinical and pathological symptoms were presented in 12-week-old piglets inoculated with LC strain. The results demonstrated that a local pseudorabies virus had been isolated, suggesting that the Bartha-K61 vaccine was not fully effective for controlling the current epidemic of pseudorabies in China.     

猪伪狂犬病病毒LC株的分离鉴定及其重要功能基因的进化分析

为确诊广东某猪场母猪流产发病原因,本研究收集该猪场流产死胎的脑、淋巴结、肺脏混合液,进行PCR鉴定、病毒分离培养、半数组织培养感染剂量（tissue culture infective dose,TCID₅₀）测定、猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）重要功能基因（gB、gC、gD、gE）序列测定和进化分析及动物回归试验。结果显示,病料混合液为PRV阳性,接种Vero细胞传至第3代即出现稳定的细胞病变（CPE）,第5代TCID₅₀达到10^-6.8/0.1 mL,PRV gB、gC、gD、gE基因序列测定、同源性及进化树分析显示为,PRV中国变异株,命名为LC株。动物试验显示,LC株对12周龄猪具有一定致病性,可形成PRV典型临床症状及病理变化。本研究分离到一株PRV流行毒株,推测当前使用疫苗Bartha-K61株尚无法完全控制新毒株的流行。