基于Gateway技术的拟南芥雄性不育GHF基因表达载体的构建

随着模式植物拟南芥全基因组测序工作的完成更多雄性不育相关基因功能需要阐明。利用拟南芥突变体库,从反向遗传学角度进行突变基因的功能研究需要构建相应的载体进行互补实验。Gateway技术是一种高效,快速的克隆系统。笔者利用Gateway克隆技术成功构建拟南芥GHF基因表达载体,并遗传转化拟南芥,为进一步阐明该基因功能奠定了基础。     

利用Gateway克隆技术大规模克隆拟南芥转录因子

随着越来越多基因组全序列的测定完成,基因组的研究进入了功能研究阶段。功能基因组的研究需要把大量基因连入不同载体,传统的酶切连接构建载体的方法不能满足这种大规模克隆的需要。Gateway技术是一种高效的大规模克隆系统,而且对载体和宿主没有依赖性。本文利用Gateway大规模克隆技术将16个拟南芥转录因子的ORF克隆入植物表达载pPTV和酵母表达载体pYTV中,酵母融合表达实验和Westem-blot检测证明了该克隆途径的可行性,并且得到的His-Tag融合蛋白,为拟南芥转录因子的大规模蛋白质组学研究奠定了良好的基础,同时基因序列的聚类分析为将来进一步的功能研究提供了有利信息。     

应用Gateway技术构建水稻OsDAD1基因的RNA干涉载体

近年来,RNA干涉广泛应用于植物基因功能研究.Gateway技术是通过采用多重载体高效构建目标基因及任何DNA片段克隆和表达载体的研究平台,该技术以λ噬菌体的位点特异性重组体系为基础,两端具有重组位点的DNA片段或目标基因可以非常容易地被重组克隆到含同源重组位点的载体上.这种以重组为基础的克隆体系目前已被广泛应用于分子生物学中来分析基因的功能.本文应用Gateway技术体系替代传统载体构建方法,构建了水稻基因OsDAD1的RNA干涉载体,从而证明了Gateway技术的可行性.     

拟南芥AtZFN3基因RNA干扰载体的构建与表达

为了构建具有发夹结构的RNAi表达载体来研究拟南芥AtZFN3基因表达的效果。根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)锌指蛋白AtZFN3基因序列,设计含有酶切位点的两对特异性引物。以拟南芥cDNA为模板,分别合成用于构建干扰载体的正、反义DNA片段,将正、反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置上,构建含有发夹结构的RNAi载体pART-ZFN3。利用农杆菌介导法,将pART-ZFN3转化到拟南芥中,PCR检测证实获得了5株转基因植株,经荧光定量PCR检测,证明了转基因植株中AtZFN3基因表达量显著低于未转基因的植株。结果表明:具有发夹结构的RNAi载体pART-ZFN3已构建成功,它对拟南芥AtZFN3基因的表达具有抑制作用,为深入分析拟南芥AtZFN3基因功能提供了基础。     

津田芜菁隐花色素CRY1 RNA干涉载体的构建

隐花色素CRY1在拟南芥光形态建成及光信号转导中起重要作用,在津田芜菁(Brassica rapaL. subsp. rapa ‘Tsuda’)中是否起相同作用尚未报道。本研究利用实验室已克隆得到的津田芜菁CRY1基因的cDNA全长序列,在NCBI进行序列比对,选取特异的片段。同时根据Gateway克隆技术特点,设计含有attB接头的引物。利用高保真的LA Taq DNA聚合酶,通过PCR方法在目的片段的两端加上attB序列。通过BP反应和LR反应将CRY1基因片段克隆到pH7GWIWG2(I)双元干涉载体。对重组载体pH7GWIWG2(I)-CRY1的鉴定结果表明成功构建了CRY1基因的干涉载体。利用Gateway克隆技术构建植物干涉表达载体简便易行,该结果为遗传转化研究其功能奠定了基础。     

蜻蜓凤梨AfPIN的克隆、载体构建及遗传转化

本研究以蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata)为材料,利用RACE技术克隆到跟生长素输出载体同源的基因,命名为Af PIN。序列比对分析表明:Af PIN推测的氨基酸序列含有PINs的IM(internalization motif)保守结构和一个高度保守的生长素输出载体(auxin efflux carrier,AEC)蛋白结构域,与番茄(Solanum lycopersicum)、豌豆(Pisum sativum)、芥菜(Brassica juncea)、小麦(Triticum aestivum)的PIN同源性分别为67%、67%、60%和67%。本研究构建了Ca MV-35S-GUS-Af PIN表达载体,利用农杆菌介导法侵染拟南芥花序,通过GUS染色和PCR检测,结果表明表达载体构建成功并成功转入拟南芥中。本研究已从蜻蜓凤梨中成功的克隆出Af PIN、构建了Ca MV-35S-GUS-Af PIN表达载体并转化到拟南芥中,为研究Af PIN的基因功能和乙烯诱导凤梨科植物开花机理奠定基础。     

杨树SRK2C基因的克隆及其遗传转化

在杨树全基因组序列信息的基础上,根据拟南芥渗透胁迫诱导基因SRK2C的全长cDNA序列,在杨树基因组上定位并克隆获得了3个SRK2C同源基因全长cDNA序列.运用Gateway定向克隆技术构建了杨树SRK2C基因的过量表达载体,并进行了T89杨遗传转化研究,获得了一批转SRK2C基因T89杨植株,PCR检测表明目的基因已经整合到了杨树基因组中,实时定量荧光RT-PCR结果也进一步证实,目的基因在T89杨转基因植株中有较高水平的表达丰度.为进一步分析杨树PtSRK2C基因功能奠定了基础,也为进一步开展林木的抗逆机制和林木抗逆遗传改良研究提供了依据.     

棉花GhERF14基因在拟南芥中的功能验证

随着分子生物学的不断发展,在模式植物拟南芥中初步探索分析基因功能的方法日渐成熟。为了探索棉花GhERF14基因的功能,构建过表达载体,通过转基因技术转入拟南芥中,通过筛选纯化获得纯合体转基因植株,观察表型,发现GhERF14基因对拟南芥的生长状况有一定的抑制作用,初步分析基因的功能为后续研究奠定一定的基础。     

甘蓝型油菜甜菜碱醛脱氢酶基因(BnBADH-1)的克隆与真核表达载体的构建

根据已知的拟南芥甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH1)序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术从甘蓝型油菜中克隆出油菜甜菜碱醛脱氢酶基因(BnBADH-1)全长。测序和分析结果表明,BnBADH-1的cDNA全长1506bp,编码一个包含501个氨基酸残基、分子量为55kD、等电点(pI)为5.16的假定蛋白质;核酸序列和氨基酸序列与拟南芥的同源性分别为90.24%和93.41%。利用片段两端的粘性末端酶切位点BamHⅠ和SacⅠ将cDNA片段连接在真核表达载体pBI121上;PCR鉴定表明,过量表达载体pBI121-BnBADH-1已成功构建,为下一步的基因功能分析做好了准备。     

拟南芥DUF647家族成员RUS4植物表达载体的构建及亚细胞定位

ROOT UV-B SENSITIVE4 (RUS4)是拟南芥DUF647蛋白家族的一个功能未知的成员。RUS1和RUS2曾经报道和根UV-B-感应途径相关联,并在拟南芥早期幼苗形态发生和发育中发挥重要作用。为了探究RUS4的分子功能,本研究对RUS4蛋白进行了亚细胞定位分析。首先,我们通过Gateway TOPO载体系统,构建了融合蛋白表达载体pMDC83-RUS4;然后,通过农杆菌介导的花苞转化法,获得了转化pMDC83-RUS4的转基因拟南芥株系;对转基因植物叶肉原生质体的荧光显微镜观察显示,RUS4-GFP信号与叶绿体的自发荧光共定位,说明RUS4蛋白定位叶绿体中。该结果为进一步研究RUS4的分子功能奠定了良好的基础。     

Gateway技术快速构建百合双价抗病毒RNAi表达载体

为获得适合转化百合的双价RNAi表达载体,以感病百合叶片的总RNA为模板,分别扩增400 bp左右的LSV和LMoV CP基因。通过重叠延伸PCR技术获得长约800 bp的LSV-LMoV融合基因。利用Gateway技术,通过BP反应及LR反应将LSV-LMoV融合基因克隆到双元载体pH7GWIWG2(Ⅱ),成功构建了含两种病毒基因的RNAi表达载体pH7GWIWG2(Ⅱ)-LSV-LMoV。将构建好的双价表达载体导入农杆菌EHA105,PCR和测序表明所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致。     

适于植物转基因体系优化的绿色荧光蛋白表达载体构建及其瞬时表达验证

在建立和优化植物的转基因体系时,通常期望转化载体同时具有适用植株范围广、尺寸较小、具有多重选择标记或报告基因等优点。为此,通过Gateway技术,构建了含有绿色荧光蛋白基因GFP的植物表达载体pGWB14-GFP,并经PCR鉴定和测序验证了序列的准确性。利用基因枪转化法,将该载体转入洋葱表皮和小麦叶片中,通过荧光显微镜检测,发现绿色荧光蛋白在洋葱表皮细胞和小麦叶片表皮细胞中均能瞬时表达,表明pGWB14-GFP在双子叶和单子叶植物中都能正常发挥功能。本载体在双子叶和单子叶植物植物中都可使用,大小低于17 kb,含有GFP报告基因,具有两套卡那霉素和潮霉素选择标记基因,用于在细菌和植物中筛选,为植物转基因体系的构建和优化提供了功能强大的转化载体。     

茉莉花香气相关基因JsGDS启动子的克隆及功能分析

大根香叶烯合成酶在植物萜类化合物合成中具有重要作用。前期从茉莉花cDNA文库中克隆获得香气相关基因Js GDS基因,但是其表达调控机制还不是很清楚,本研究拟采用染色体步移法从茉莉花基因组中克隆了Js GDS上游1 646 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子片段中包含启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box以及光调控元件、赤霉素应答元件、ABA应答元件、MeJA应答元件等多个与生长发育或者逆境胁迫相关的顺式作用元件。利用Gateway技术构建Js GDS启动子的GUS融合载体及其系列缺失体,并获得拟南芥遗传转化植株。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色。结果表明,Js GDS启动子及缺失体均具有驱动下游基因转录的活性。本研究为进一步探究Js GDS基因的调控和表达机制提供理论依据。     

Isolation and Characterization of GhLEA3 Gene from Upland Cotton and Its Expression in Response to Low Temperature Stress

[Objective] Based on the analysis of cotton GhLEA3 gene structure and its expression model in chilling stress, we investigated the resistance function of GhLEA3 in response to cold stress. [Method] We cloned GhLEA3 from upland cotton by homologous sequence cloning way. We analyzed the properties of the GhLEA3, and constructed phylogenetic tree by bioinformatics analysis. We constructed the transient expression vector 35S∷GhLEA3-GFP by In-Fusion connection technology and studied the subcellular localization of GhLEA3. The expression of GhLEA3 gene in leaves of TM-1 at three-leaf stage under low temperature stress treatments (4 ℃, 24 h) was performed. Agrobacterium tumefaciens mediated floral dipping method was used to transform the gene with expression vector 35S∷GhLEA3-GFP into Arabidopsis thaliana wild type. Low temperature germination experiment at 4 ℃ was conducted to verify germination ability of the transgenic Arabidopsis thaliana T₃ seed. The transgenic Arabidopsis seedlings were treated at 4 ℃(low temperature), and all the leaves were taken to measure their electrical conductivity. [Result] The coding sequence of GhLEA3 gene is 1 218 bp, which encodes 405 amino acids. GhLEA3 protein includes 4 functional domains of PF02987. Phylogenetic analysis showed that the similarity of amino acid sequences between upland cotton GhLEA3 and Arabidopsis thaliana AtLEA3 was 52.6%. GhLEA3 might be mainly localized in vacuoles and small vesicles. GhLEA3 was up-regulated in leaves after low temperature treatment. The germination rate of transgenic Arabidopsis thaliana of T₃ generation at low temperature was significantly higher than that of wild type, and its electrical conductivity of leaves after low temperature treatment was significantly lower than that of wild type. [Conclusion] GhLEA3 belonged to the member of LEA3 family. Phylogenetic analysis showed that GhLEA3 had the closest relationship with AtLEA3. GhLEA3 was induced by low temperature stress and may play an important role in improving cold resistance.     

马铃薯甲基转移酶基因StDRM2的克隆及表达分析

DNA甲基化对植物的生长发育至关重要,DNA甲基转移酶建立和维持着DNA甲基化,其中结构域重排甲基转移酶DRM2催化非对称位点的从头甲基化。为了初步探究马铃薯StDRM2基因的功能,本研究利用同源克隆基因技术从马铃薯‘青薯9号’中克隆了StDRM2基因,利用Gateway技术构建过表达载体,农杆菌遗传转化马铃薯‘大西洋’,获得5株转基因马铃薯苗。利用qRT-PCR技术测定StDRM2基因在转基因马铃薯及其不同组织(根,茎,叶)中的表达量。结果表明,StDRM2基因CDS序列全长1812 bp,编码603个蛋白质氨基酸。系统发育进化树分析表明,StDRM2与茄科作物的番茄亲缘关系最近;qRT-PCR表明转基因马铃薯中的StDRM2基因表达量显著上调,最高相对表达量是野生型马铃薯的6.77倍。StDRM2基因在转基因马铃薯根、茎、叶中均有表达,其表达量不同且差异显著(P<0.05),其中根中的表达量最高,茎中的表达量最低。本研究中转基因马铃薯的获得为研究StDRM2功能提供试验材料,组织表达模式分析为进一步了解StDRM2基因功能和作用机制提供理论依据。     

Cloning and Functional Analysis of Low Temperature Response Gene,GhZAT10, in Upland Cotton at Seedling Stage

[Objective] The aim of this study is to identify chilling tolerant genes which can provide a basis for breeding upland cotton cultivars with tolerance to chilling. [Method] The GhZAT10 (Zinc finger of Arabidopsis thaliana 10) gene was cloned, and its expression in roots, stems, and leaves was analyzed with cold treatment by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Then we analyzed the structural characteristics of GhZAT10, protein properties and constructed the phylogenetic tree by bioinformatics methods. Next, we constructed subcellular localization vector 35S::GhZAT10-GFP by Gateway technology. Finally, we studied the effect of GhZAT10 in chilling response by virus induced gene silencing of cotton. [Result] The Open reading frame(ORF) length of GhZAT10 gene is 813 bp (base pair), encoding 270 amino acid residues. The expression of GhZAT10 in roots was higher than that in stems and leaves, and up-regulated after chilling stress in these tissues. GhZAT10 does not possess signal peptides or transmembrane helices; its activity is closely related to the phosphorylation regulation. GhZAT10 has homology with the ZAT10 of Theobroma cacao, Arabidopsis thaliana and Citrus sinensis. GhZAT10 protein is located in the nucleus. The GhZAT10-silenced cotton plants were more sensitive to low temperature than wild type. [Conclusion] GhZAT10 belongs to C₂H₂ zinc finger protein, and plays a positive role to response the chilling stress in upland cotton.     

CRISPR/Cas9介导的拟南芥TT1基因的敲除

在菜油品质上黄籽相较于褐籽更为优良,且更易于合成高质量的生物柴油。已有研究表明TT1(TRANSPARENT TESTA 1)基因是类黄酮代谢途径中的关键基因,为了通过CRISPR/Cas9基因编辑载体验证TT1基因在白菜型油菜中的功能,本研究先在拟南芥中进行了TT1基因的编辑。构建了CRISPR/Cas9 TT1基因编辑载体,通过农杆菌介导侵染拟南芥花序的遗传转化方式将编辑载体引入拟南芥Columbia生态型,通过表型观察发现T1代12株阳性苗中产生了11株表型株,其中1株表现为褐籽,2株表现为黄籽,9株表现为黄籽和褐籽的嵌合。测序检测分析其突变型结果发现,TT1靶位点处有单碱基缺失、单碱基插入、多个碱基缺失、碱基缺失后插入以及两个靶位点之间多个碱基缺失的多种突变类型。T2代获得一株纯合突变体,TT1两个靶位点之间产生79 bp的碱基缺失,且全株表现为黄籽。本研究为CRISPR/Cas9载体在白菜型油菜中TT1基因功能验证提供借鉴,并为其它作物TT1同源基因的功能验证提供了新的突变体材料。