降解氨基甲酸乙酯酿酒酵母的筛选及其应用

以宁夏5个产区的酿酒葡萄为原料筛选可以降解氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate,EC）且具有优良酿酒特性的红葡萄酒和白葡萄酒酿酒酵母。初筛试验获得了10株酵母,复筛试验以EC作为唯一氮源筛选出6株EC降解能力较好的酵母菌株,最后通过产气试验和耐受性试验筛选出了2株发酵性能较好的菌株。经过18S rDNA分子生物学鉴定后确定这2个菌株为酿酒酵母。使用筛选出的2个菌株发酵红葡萄酒和白葡萄酒,并以商业酵母作为对照,测定其理化指标及EC含量;再通过GC-MS分析其香气物质并结合感官评价最终筛选出具有优良酿酒特性和降解EC功效的红葡萄酒酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）NXSC2和白葡萄酒酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）NXSC1。     

凉州熏醋中高产乙偶姻菌株的分离筛选及发酵特性初探

本试验以凉州熏醋酿造醋醅为材料,以经典的微生物分离纯化技术,从醋醅材料中分离筛选芽孢杆菌和酵母菌。通过应用Voges-Proskauer(V-P)反应和分光光度法对筛出菌株发酵产乙偶姻能力进行考察以得到高产乙偶姻的功能菌株,结合菌落形态及生理生化定性试验确定菌株类别。对高产菌株进行发酵动态跟踪,以获得其发酵特性。结果表明,从醋醅中共筛选获得了5株芽孢杆菌和8株酵母菌,其中芽孢杆菌和酵母各有5株和7株可以发酵产乙偶姻,以酵母J2产量最高,为8.55 g/L。经鉴定得知该菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。动态跟踪该菌株的发酵特性,其在发酵40 h时乙偶姻产量最高。     

鸡粪好氧发酵高效同程硝化-反硝化菌筛选及其生物学特性研究

为验证鸡粪好氧发酵过程同程硝化-反硝化细菌的存在,全程进行了高效同程硝化-反硝化菌株的分离、筛选,并对筛选的高效菌株进行鉴定和生物学特性研究.筛选到1株高效同程硝化-反硝化细菌JY45-2,鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.,为兼性化能自养型菌株.JY45-2菌株生物学特性为:当有机物质量浓度1 360 mg/L、氨态氮质量浓度212 mg/L、pH8、C/N为3.54和培养温度45℃时,氨态氮利用效率最高.JY45-2菌株的有机物耐受范围宽,有机物质量浓度为680～2 040 mg/L时,作用3 d后的氨态氮利用率可达30%以上.在鸡粪好氧发酵过程中分离、筛选到1株高效同程硝化-反硝化细菌,证明了该固态发酵体系中存在同程硝化-反硝化细菌.     

猕猴桃果酒酵母的筛选及发酵工艺优化

【目的】筛选猕猴桃果酒发酵优势菌株,优化果酒发酵工艺。【方法】以猕猴桃果皮为材料,通过分离、纯化和筛选获得适合猕猴桃果酒发酵的酵母菌菌株;以果酒酒精度和VC含量为指标,系统分析了酵母接种量、初始SO2质量浓度、初始糖度、发酵温度和初始pH值5个因素对猕猴桃果酒品质的影响,然后通过Box-Behnken响应面试验设计对猕猴桃果酒的发酵工艺条件进行优化,并在此基础上建立猕猴桃果酒发酵的数学模型。【结果】筛选获得2株酵母菌株1-21和1-31,菌株1-21发酵活力强,发酵得到果酒的VC含量高,适合作为猕猴桃果酒发酵的主发酵菌株;菌株1-31发酵得到的果酒香气独特,香气组分含量高,适合作为猕猴桃果酒发酵的辅助菌株。猕猴桃果酒发酵的最优工艺条件为:选用1-21纯菌株发酵,种子液接种量8.0%,初始SO2质量浓度119.73mg/L,初始糖度240g/kg。据此工艺条件发酵所得猕猴桃果酒的酒精度预测值为14.14°,实测值为14.08°;VC含量预测值为1.18g/L,实测值为1.09g/L。【结论】筛选所获的野生酵母菌株1-21发酵力强,用其发酵得到的猕猴桃果酒VC含量高,发酵工艺可靠。     

高产酒精的番茄酿酒酵母的选育研究

[目的]筛选出产酒能力高、发酵速度快的番茄酿酒酵母突变株。[方法]以从番茄表面分离筛选的产酒酵母HBF-2为出发菌株,分别利用紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)进行诱变,通过测定吸光度和致死率绘制出发菌株的生长曲线与致死曲线,根据诱变后菌落形态特征对菌种初筛,根据发酵酒的酒精度、残糖和总酸检测对菌种进行复筛,并对目的菌株进行遗传稳定性试验。[结果]研究表明,出发菌株HBF-2生长周期为24 h,培养10 h后进入对数生长期;利用20 W紫外灯,在照射距离为40 cm条件下,照射时间为90 s,筛选出产酒能力比HBF-2提高了18.2%的突变株UV-8;UV-8连续传代5次,番茄发酵试验结果显示该菌株有良好的遗传稳定性。[结论]研究可为番茄酒的酵母选育提供理论基础与参考。     

新疆酸马奶中优良乳酸菌的分离鉴定及发酵特性分析

从新疆地区自然发酵酸乳中分离到25株乳酸细菌,通过在牛乳中的传代发酵试验筛选出3株遗传性状稳定、凝乳状态好、风味独特乳酸菌菌株,其中杆菌1株,球菌2株,经形态特征、生理生化特性和16 Sr DNA序列同源性分析,将菌株5-3鉴定为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides),菌株6-7鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),菌株1-6鉴定为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus),同时对3株菌进行发酵性能测定及感官综合评价,结果表明:3株菌都具有较好的发酵性能和良好的发酵风味.     

无曲液态米酒酿酒酵母筛选

米酒作为我国传统酿造饮品,因其独特口味广受消费者喜爱.利用酶制剂和纯种酿酒酵母完全替代米曲作无曲液态发酵米酒,具有能量消耗少,效率高,易于机械化生产,提高批次间风味稳定性等优点.为筛选适合无曲酿造液态法酿造米酒的酵母菌株,研究从实验室保藏菌株和米酒米曲中筛选得到198株潜在米酒发酵菌株,分析其发酵性能和发酵产品中挥发性风味化合物组成等,获得1株发酵性能优良且具有优良香气特征的酿酒酵母菌株NO.26,使用该菌株发酵初始含糖量16％糯米汁,发酵周期为10 d,发酵结束后米酒酒精度为7.19％V/V,具有较为明显的米酒特征,酒体协调,香味馥郁,且含有较高香气强度的苯乙醇(玫瑰、花香)、芳樟醇(薰衣草、花香)、十六酸乙酯(果香、奶油香)等挥发性风味化合物.利用研究筛选得到酿酒酵母菌株NO.26进行无曲液态发酵对提高米酒质量、加快无曲液态法米酒产品发展具有重要参考价值和应用前景.     

酿酒酵母菌株的筛选与发酵特性分析

对河南本地苹果园土壤、果实及表皮中的酿酒酵母菌株进行分离、筛选、鉴定,并进行酒精、柠檬酸、葡萄糖和SO_2的耐受性测定,最后对发酵条件进行优化,以期选育出适合果酒发酵的优良酿酒酵母菌株。结果表明,共分离得到36株酿酒酵母,对其进一步进行发酵试验获得发酵性能较优的8株酿酒酵母,对这8株酿酒酵母进行耐受性试验发现,菌株Y-2和F-3在400 g/L葡萄糖下能够快速启动发酵,同时能够耐受酒精体积分数16%、柠檬酸质量浓度20 g/L和SO_2质量浓度200 mg/L。对Y-2、F-3菌株进行理化指标和感官评定,确定其最优发酵条件为:葡萄糖质量浓度200 g/L、温度25℃、pH值4.0。菌株Y-2和F-3酿造的苹果酒具有清新的果香味和浓郁的酒味,酒精度适中,口感清爽,这2株酵母发酵性能优良可以作为酿造果酒的开发菌株。     

枸杞酒酵母菌的筛选及特性研究

为筛选酿造枸杞酒的优良酵母菌种,从枸杞发酵醪中分离得到47 个酵母菌株,乙醇发酵试验初筛后得到5个性能较好的菌株.通过进一步的生理生化试验及性能测定,Y9和Y33菌株是发酵性能优良的菌株,尤以Y9菌株性能最好,其发酵酒含乙醇15% ,可耐15%～17%的酒精,可在60%的糖液中发酵.     

优选发酵毕赤酵母与酿酒酵母混合发酵增香酿造爱格丽干白葡萄酒

【目的】研究优选发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合发酵对‘爱格丽’（Ecolly）干白葡萄酒的增香作用,优化干白葡萄酒的酿造工艺。【方法】将发酵毕赤酵母菌株H5Y-28与酿酒酵母菌株F5以10﹕1、4﹕1、1﹕1、1﹕4、1﹕10比例接种,进行模拟葡萄汁的混合发酵,并以酿酒酵母纯发酵为对照,发酵过程中监测酵母的活菌数、总菌数,建立菌体生长动力学模型。按相同接种比例进行爱格丽干白葡萄酒的发酵应用,以酿酒酵母纯发酵和添加发酵毕赤酵母胞外酶处理作为对照,酿造次年4月,对所酿葡萄酒酒样进行香气的感官分析和GC-MS分析。【结果】菌体生长动力学表明,随着发酵毕赤酵母接种比例的升高,其存活数量和存活时间明显增加,但优选菌株H5Y-28的高比例（10﹕1、4﹕1）接种处理会降低酿酒酵母的最大生长数量。感官分析结果表明,混合发酵有利于增强‘爱格丽’葡萄酒的果香和花香,尤其是热带水果香气,但高发酵毕赤酵母接种比例（10﹕1）会给葡萄酒带来较强的生青味,而酒样1﹕1、4﹕1仅引入较弱的生青味。挥发性香气成分分析结果表明,品种香气成分的含量随着发酵毕赤酵母接种比例的升高而增加,尤其是萜烯类和C13-去甲类异戊二烯化合物。此外,添加胞外酶能显著提高葡萄酒品种香气的含量,尤其是C13-去甲类异戊二烯化合物的含量（高于纯酿酒酵母发酵酒样90%）。混合发酵显著增加了酒样中发酵香气中的乙酸酯、C6-C12脂肪酸及其酯类、异戊醇与苯乙醇的含量。与单一酿酒酵母发酵酒样相比,1﹕1接种比例有助于提高酒样中26%品种香气成分和39%发酵香气成分的含量,尤其是显著地提高了中链脂肪酸乙酯的含量（40%）。【结论】毕赤酵母与酿酒酵母1﹕1接种处理不影响酿酒酵母生长,且具有较强的增香酿造潜力。     

Identification and characterization of Pichia membranifaciens Hmp-1 isolated from spoilage blackberry wine

The pellicle-forming yeast could cause the quality deterioration of wine. In this study, a pellicle-forming strain Hmp-1 was isolated from the spoilage blackberry wine, and identified as Pichia membranifaciens based on the morphology and partial nucleotide sequence of 26S rDNA. The effects of fermentation conditions (ethanol, sulfur dioxide, sugar, and temperature) on the growth of P. membranifaciens strain Hmp-1 and Saccharomyces cerevisiae strain FM-S-115 (a strain used for the blackberry wine fermentation) were investigated, respectively. The results indicated that Hmp-1 had lower resistance to these factors compared to FM-S-115, and the growth of Hmp-1 was completely inhibited by 10% (v/v) or 50 mg L^–1 SO₂ during the fermentation of blackberry wine. These results suggested that Hmp-1 could effectively be controlled by increasing ethanol or SO₂ concentration during the fermentation and storage of blackberry wine. Furthermore, the analysis based on gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) showed that Hmp-1 remarkably decreased kinds of volatile compounds in blackberry wine, especially aldehydes and esters. In addition, some poisonous compounds were detected in the blackberry wine fermented by FM-S-115 and Hmp-1. These results suggested that Hmp-1 was a major cause leading to the quality deterioration of blackberry wine.     

油菜菌核病拮抗细菌筛选及菌株BX-7的生防作用研究

从油菜根围土壤中分离出156株细菌,通过对峙实验的初步筛选,有10株细菌对油菜菌核病菌有一定的拮抗作用。菌株BX-7对油菜菌核病菌的菌丝生长有明显的抑制作用,对峙培养的油菜菌核病菌菌丝边缘由白色变为淡黄色,经过显微镜观察发现菌丝发生断裂、肿大或畸形等。菌株BX-7的挥发性产物和无菌发酵液均对油菜菌核病菌菌丝的生长有抑制作用。挥发性产物对菌丝生长的抑制率最高为74.09%。无菌发酵液随培养时间的不同其抑制效果有显著差异,在培养96 h时达到最佳。油菜叶片离体测定和盆栽试验结果表明,菌株BX-7的菌悬液和无菌发酵液均对油菜菌核病有较好的抑制作用,菌悬液处理的防效优于无菌发酵液。     

蜂巢珊瑚共生真菌的分离、鉴定及其抗氧化活性

为从蜂巢珊瑚中寻找具有高抗氧化活性的共生真菌,采用组织研磨法分离蜂巢珊瑚共生真菌,通过对DPPH、ABTS自由基清除及对高价铁离子的还原能力的测定筛选高抗氧化活性的菌株,通过形态学特征观察,18S rDNA序列分析对高抗氧化活性菌株进行鉴定。从蜂巢珊瑚中共分离9株共生真菌;抗氧化活性测定结果表明,9株真菌发酵液均具有较好的抗氧化活性,其中S-1-5菌株的抗氧化活性最好,其对DPPH和ABTS自由基清除率分别为70.60%和67.18%,对高价铁离子还原能力强。依据S-1-5菌株的形态学特征和18S rDNA序列分析结果,将菌株S-1-5鉴定为球孢枝孢(Cladosporium sphaerospermum)。该菌株具有进一步开发应用的潜在价值。     

苹果树腐烂病生防链霉菌A144的鉴定及其代谢产物的抑菌活性

旨在明确菌株A144的分类地位及其代谢产物的抑菌活性。基于形态学观察、生理生化特征以及16S rDNA序列分析将菌株A144鉴定为娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)。采用含药平板法测定菌株A144的抑菌谱,结果表明其发酵滤液对苹果树腐烂病菌(Valsamali var.mali)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)以及番茄早疫病菌(Alternaria solani)均有抑菌活性,抑菌率分别为68.15%±2.62%、28.90%±1.79%、33.77%±2.59%和11.43%±0.81%。以苹果树腐烂病菌为指示菌,从12种不同培养基中筛选出ISP2培养基为菌株A144的最佳发酵培养基,其发酵滤液的抑菌率达85.06%±0.86%。平板涂抹法和平板对扣法试验结果表明,其脂肽粗提物、蛋白粗提物和挥发性物质对苹果树腐烂病菌均有抑菌活性,抑菌率分别为81.44%±0.92%、47.92%±2.25%和22.87%±4.40%。可见,菌株A144在苹果树腐烂病的生物防治中具有良好的开发潜力。     

油菜内生拮抗细菌SF4对油菜菌核病菌的抑制作用研究

从油菜幼苗中分离出110个内生细菌。采用平板对峙法进行筛选,有4株菌对核盘菌有不同程度的抑制作用。经连续传代10次后,菌株SF4仍具有较高的生防活性。该菌株对核盘菌的菌丝生长发育有显著的抑制效果。在显微镜的观察下,被抑制的菌丝发生畸形,内含物分布不均匀。菌株SF4的挥发性产物及无菌发酵液都能抑制核盘菌的菌丝生长。挥发性产物对菌丝的最高抑制率为33.13%。无菌发酵液的抑制效果随培养时间的不同而有显著差异,96 h的无菌发酵液抑制效果最好。菌株SF4的无菌发酵液可推迟核盘菌菌核形成的时间,减少菌核数目,也可推迟菌核的萌发。在油菜叶片离体实验中,该菌株的菌悬液及无菌发酵液对发病有明显的抑制作用。     

具有高胱硫醚β-裂解酶活性的葡萄酒酵母工程菌株的构建

【目的】构建具有较高胱硫醚β-裂解酶活性的葡萄酒酵母工程菌株,用于提高葡萄酒的香气品质。【方法】利用质粒pAUR123将大肠杆菌tnaA基因在中国本土酿酒酵母菌株LFP525中进行表达,得到的转化子进行酶活测定,并通过模拟汁和干白的发酵,评价其酿酒特性和产生硫醇类物质的能力。【结果】成功获得酵母工程菌株TH1和TH2,其胱硫醚β-裂解酶活性与受体菌比提高了32.25%-59.44%。模拟葡萄汁发酵显示,工程菌株中硫醇类物质的产量显著提高,是受体菌的2.8-4.3倍。工程菌株的发酵时间比受体菌略长,残糖和挥发酸显著高于宿主菌,但其含量处于正常范围。在长相思干白发酵试验中,该工程菌株的主要酿酒特性与受体菌相差不大,且硫醇类物质的产量提高了1.22倍。【结论】通过基因改造可以提高酿酒酵母胱硫醚β-裂解酶活性,应用改良菌株可进一步提高葡萄酒的香气品质。     

饲用芽孢杆菌的筛选鉴定及固态发酵培养基的优化

为了筛选鉴定供试菌株,对其固态发酵培养基组分进行优化。从8株供试菌株中筛选出两株优良菌株B02和B06,采用形态特征和生理生化鉴定方法、16SrDNA序列测定和系统发育分析对B02和B06进行鉴定;以活菌含量为指标,通过L9(34)正交试验,对固态发酵培养基组分的不同配比进行优化。结果表明,B02为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),B06为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。B02和B06最佳培养基配比分别为麦麸695.6g/kg、豆粕87.0g/kg、玉米粉87.0g/kg、米糠130.4g/kg和麦麸761.9g/kg、豆粕95.2g/kg、玉米粉95.2g/kg、米糠47.7g/kg。B02和B06在麦麸、豆粕等发酵物料中生长良好,在优化后的培养基中培养最高活菌含量分别可以达到1013 cfu/g和1010 cfu/g以上,具有很大的开发利用潜力。     

mleA基因在酿酒酵母中的整合型表达

 【目的】进行中国自行筛选的专利菌种酒酒球菌 SD-2a（Oenococcus oeni SD-2a）的苹果酸－乳酸酶基因在酿酒酵母中的整合型表达,使葡萄酒生产过程中的酒精发酵和苹果酸－乳酸发酵（malolactic fermentation,MLF）同时进行。【方法】克隆Oenococcus oeni SD-2a的苹果酸－乳酸酶基因mleA,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以酵母整合型质粒YIp5为载体,构建重组表达质粒pYILmleA,并转化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YS59,经筛选鉴定获得酵母转化子YS59/pYILmleA。进行转化子的营养缺陷型和交配型鉴定、菌落PCR鉴定、SDS-PAGE检测及斑点杂交检测,并对酵母转化子培养上清液进行L-苹果酸及L-乳酸含量的HPLC分析,检测目的基因的功能性表达。【结果】转化子的营养缺陷型和交配型鉴定、菌落PCR鉴定表明获得了阳性转化子;SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了目标蛋白,斑点杂交检测表明目的基因整合到受体菌中。模拟发酵表明mleA基因整合到受体菌中后进行了功能性表达,将培养基中的L-苹果酸转化成L-乳酸,使得培养液中的L-苹果酸含量极显著降低。转化子YS59/pYILmleA在添加5 648 mg?L-1 L-苹果酸和10%葡萄糖的SD/-Ura培养基中培养4 d,培养液上清中L-苹果酸的剩余含量与空载体转化子YS59/YIp5（对照）差异极显著,苹果酸的相对降低率为20.18%～20.85%。供试的转化子L-乳酸生成量为1 278～1 312 mg?L-1,对照未检出乳酸的生成。【结论】中国自主筛选的专利菌种O.oeni SD-2a的mleA基因的整合型表达质粒构建成功并在酿酒酵母中进行了功能性表达。     

混菌发酵体系中异常汉逊酵母生长抑制机制研究

为揭示异常汉逊酵母(Hansenula anomala)早期衰亡的特征及机制,建立酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)与异常汉逊酵母混合发酵体系,研究酿酒酵母产酸、有氧混菌发酵、无氧添加新鲜培养基发酵、混菌发酵上清液及活、死酿酒酵母细胞添加对异常汉逊酵母生长的影响。结果表明,酵母产酸对异常汉逊酵母有抑制作用;有氧混菌和无氧添加新鲜培养基混菌发酵处理中,异常汉逊酵母的活菌数均高于无氧混菌发酵;而混菌发酵上清液添加后异常汉逊酵母的活菌数低于其纯培养;高浓度活酿酒酵母细胞的加入导致异常汉逊酵母的早期死亡,而死酿酒酵母细胞对异常汉逊酵母无抑制作用。因此,异常汉逊酵母早期衰亡,一方面是由酿酒酵母产酸及营养竞争造成,另一方面酿酒酵母的代谢产物及高密度活酿酒酵母细胞也会有促进作用。上述结果有助于加深对非酿酒酵母在果酒发酵中早于酿酒酵母衰亡的理解。