表达禽流感病毒NP和M2融合基因重组乳酸菌的构建及鉴定

为了在乳酸菌中表达H9N2亚型禽流感病毒（AIV）NP和M2基因并检测其反应原性,先以pMD19-T-M2质粒作为模板,采用PCR方法克隆M2全长基因,然后将M2基因亚克隆入pSIP409-pgsA′-NP质粒中,构建重组质粒pSIP409-pgsA′-NP-M2。并将重组质粒pSIP409-pgsA′-NP-M2通过电转化的方法转入植物乳杆菌Lb.plantarum NC8中,制备重组菌NC8-pSIP409-pgsA′-NP-M2。诱导表达NC8-pSIP409-pgsA′-NP-M2重组乳酸菌,并通过流式细胞术、免疫荧光和免疫印迹技术验证。结果表明,重组菌NC8-pSIP409-pgsA′-NP-M2能够经诱导表达NP-M2融合蛋白,并且与兔源NP单克隆抗体和抗M2的小鼠血清具有反应原性。这为后续研究禽流感广谱口服疫苗奠定基础。     

表达鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原TATA4与鸡IL-IL-2的侵入型乳酸菌构建及鉴定

为探究鸡柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)表面抗原TA4在植物乳杆菌NC8的表达情况,使用PCR扩增TA4片段,同时使用细胞因子ChIL-2作为免疫佐剂,应用猪圆环病毒2A肽(P2A)序列使抗原与免疫佐剂共表达,连接有金黄色葡萄球菌的纤连蛋白结合蛋白A(FnBPA)的409载体,构建两株重组侵入型乳酸菌NC8 pSIP 409-FnBPA-pgsA′-TA4和NC8 pSIP 409-FnBPA-pgsA′-TA4-IL2。使用自制多克隆抗体通过Western blot检测重组菌的蛋白表达情况。结果表明,两种侵入型目的蛋白TA4和IL-2使用多克隆抗体检测均可成功检测到蛋白表达,为后期动物试验及益生菌口服疫苗的制备奠定了基础。     

表达A亚群禽白血病病毒Gp85蛋白的乳酸菌的构建

本研究旨在构建乳酸菌表达载体以研制A亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup A,ALV-A）的活菌疫苗,用于预防禽白血病。使用锚定表达载体构建2株分别表达gp85和gp85-DCpep基因的重组植物乳杆菌,以感染ALV-A的DF-1细胞的基因组DNA为模板,使用PCR方法扩增ALV-A Gp85蛋白的编码基因gp85,将树突状细胞靶向肽（DC-targeting peptide,DCpep）编码基因与gp85基因进行融合,获得gp85-DCpep基因;使用乳酸菌锚定表达载体pSIP409-pgsA’通过同源重组的方法构建重组质粒pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和pSIP409-pgsA’-gp85;经测序正确后将上述质粒分别电转化植物乳杆菌NC8感受态细胞,获得重组植物乳杆菌;使用SppIP诱导重组植物乳杆菌的表达,收集处于对数生长期的菌体,通过反复冻融获取细胞膜的蛋白样,采用Western blotting技术检测pgsA’-gp85-DCpep和pgsA’-gp85蛋白的表达情况。结果显示,试验成功获得基因片段gp85和gp85-DCpep,构建的重组质粒pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和pSIP409-pgsA’-gp85测序无突变和丢失情况,并成功电转到植物乳杆菌NC8感受态细胞中,使用SDS-PAGE和Western blotting技术在细胞膜蛋白样中检测到蛋白的表达,大小分别为48.3（pgsA’-gp85-DCpep）和47 ku （pgsA’-gp85）。本试验成功构建了重组质粒pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和pSIP409-pgsA’-gp85,获得的重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和NC8-pSIP409-pgsA’-gp85中的蛋白均成功表达,且具有反应原性,为后期深入研究重组植物乳杆菌在抗ALV-A感染中的保护机制奠定良好的基础。     

饲用芽孢乳酸菌的生物学特性研究

试验研究了芽孢乳酸菌的生长特性、泌酸能力、高温耐受性、耐酸性、胆盐耐受性和抑菌能力,旨在为微生态饲料添加剂的研发提供试验依据。结果表明,芽孢乳酸菌在30 h时菌体质量浓度达到最高值,在32 h时产酸量最高,最后在pH 3.80左右趋于稳定;芽孢乳酸菌经90℃处理10 min后存活率达到73.47%,pH 2.0及1.0%胆盐处理3 h后存活率分别为54.69%、24.36%;芽孢乳酸菌对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均具有较好的抑菌性能,抑菌圈直径分别为18.38、19.76、17.42 mm。结果说明,芽孢乳酸菌具备良好的生物学特性,是一株优异的益生菌株。     

乌鸡肠道中一株乳酸菌的分离鉴定及生物学特性研究

本试验采用添加碳酸钙的MRS培养基作为筛选培养基，从乌鸡肠道中筛选乳酸菌，并对分离到的菌种进行16S rDNA基因序列鉴定以及益生性能研究，测定其生长速率、产酸能力、耐酸和耐胆盐性能、抑菌能力及抗生素敏感性。试验结果表明：分离到的溶钙圈较好的菌株N为乳酸菌，分离菌株N产酸能力强，达到对数期的时间短，在低pH、高胆盐浓度时，仍具有较好生长活性。 [关键词] 乳酸菌|乌鸡|益生性能     

一株高产酸乳酸菌的分离、鉴定及高密度发酵研究

为获取产酸能力强、发酵性能好、具有强抑菌能力的乳酸菌,本试验以35日龄断奶健康仔猪粪便为菌源,对其乳酸菌进行筛选、分离、鉴定,并对分离菌株进行发酵性能研究。从35日龄断奶健康仔猪粪便中分离得到6株目标菌株,经产酸测试及抑菌试验后,得到一株产酸能力强、抑菌效果良好的筛选菌株,命名为RSJ-5。通过对RSJ-5菌株的菌落与菌体形态观察、生理生化鉴定试验、糖醇发酵试验,确定其为嗜酸乳杆菌。利用50 L发酵罐接种RSJ-5菌株厌氧发酵36 h,发酵液活菌数达158 CFU/mL,乳酸钙含量为85 mg/mL,pH4.2,发酵液对大肠杆菌、沙门氏菌有较强抑菌作用。结果表明RSJ-5嗜酸乳杆菌具备优良乳酸菌发酵剂的性能,探索了发酵工艺的可行性,为液体饲料(乳酸菌发酵液)大规模发酵生产提供参考。     

1株关岭黄牛瘤胃源发酵乳杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析

为了分离具有优良益生特性的牛源乳酸菌，探究其用于畜牧微生态制剂研发的潜力，试验采集健康关岭黄牛瘤胃液，接种于MRS肉汤培养基富集后分离乳酸菌，使用含0.3%胆盐的无菌PBS初步筛选耐胆盐乳酸菌，通过革兰氏染色镜检和16S rRNA测序进行鉴定，并对分离菌的生长特性、产酸能力、耐受特性、药物敏感性、抑菌特性及细胞黏附性进行分析。结果表明：经筛选分离得到1株菌，命名为NCO,经革兰氏染色、镜检和16S rRNA测序鉴定为发酵乳杆菌；该菌具有良好的生长和产酸能力，培养4 h后进入对数生长期，16 h后达到稳定期，培养28 h的菌液pH值为4.43;对低pH值、胆盐、胃液和肠液环境具有耐受能力；该分离菌对万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素耐药；其培养上清液对金黄色葡萄球菌和鸡白痢沙门氏菌具有极强的抑制作用；该分离菌对Caco-2细胞的黏附数量为43.5 cfu/个，具有一定黏附性。说明分离菌NCO具有优良的生物学特性，有潜力作为优良微生态制剂的候选菌株。     

羊瘤胃源乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性分析

本研究旨在探寻益生特性优良、可作为抗生素替代品的乳酸菌,并为后续应用于畜禽养殖提供理论依据。本试验以青海黑藏羊和西藏白绒山羊瘤胃内容物为菌株分离来源,采用含有碳酸钙的MRS固体培养基分离纯化乳酸菌,经生理生化和16S rRNA测序鉴定及产酸产气试验分离得到22株同型发酵乳酸菌,测定并评价其生长速率、产酸能力、耐酸和耐胆盐性能、抑菌能力、自凝集率及抗生素敏感性。综合比较不同菌株之间的生物学特性,分别在片球菌属、肠球菌属、乳杆菌属中筛选获得2株戊糖片球菌、1株海氏肠球菌、2株戊糖乳杆菌。结果表明:2株戊糖片球菌均在4 h后进入对数生长期,16 h达到稳定期,24 h后菌液pH达到4.0以下,能耐受pH 3.0和0.3%的胆盐环境;1株海氏肠球菌在2 h后进入对数生长期,12 h达到稳定期,24 h后pH达到4.5以下,能耐受pH 4.0和0.3%的胆盐环境;2株戊糖乳杆菌均在2 h后进入对数生长期,16 h达到稳定期,16 h后pH达到4.0以下,能耐受pH 3.0和0.3%的胆盐环境,5株乳酸菌自凝集率、抑菌能力及安全性均表现优良。综上所述,本试验筛选获得的5株不同种属乳酸菌生物学特性良好,可作为后续开发微生物发酵饲料及动物微生态制剂的菌种来源。     

一株鱼源植物乳杆菌的部分生物学特性研究

为了从实验室现有的3株乳酸菌中筛选出对维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌抑菌效果较好的乳酸菌,并对其部分生物学特性进行研究,试验采用打孔方法从3株菌中筛选出抑菌效果较好的菌株,并对该菌株在不同胆盐浓度、不同pH值、高温环境下的生长情况以及对胰蛋白酶的耐受能力和生长能力进行测定。结果表明:3株乳酸菌中,仅植物乳杆菌C20015对致病菌均有抑制作用,其余两株菌对其无抑制作用;C20015在抗逆性试验中,随胆盐浓度的增加,其活菌数下降,但活菌数均达到1.0×10~5cfu/m L以上;在pH值为2时,C20015的活菌数明显下降,当pH值大于3时,活菌数均达到1.0×10~6cfu/m L以上;在耐高温试验中,50℃时C20015活菌数下降不明显,但60℃以上几乎无菌生长;胰蛋白酶对活菌数无影响;植物乳杆菌C20015在0~10 h内快速增长,从10小时开始进入生长稳定期,直到20小时细菌数达到最大值3.6×10~9cfu/mL。说明植物乳杆菌C20015对水产类致病菌有一定的抑制作用,且对低pH值、高浓度胆盐、胃蛋白酶具有一定的耐受能力,有望应用于水产养殖饲料。     

酸驼乳中益生乳酸菌的分离筛选

旨在评价酸驼乳中乳酸菌的益生特性。采用常规方法从内蒙古阿拉善牧区采集的酸驼乳中分离乳酸菌;利用16S r DNA PCR及序列分析法对分离到的乳酸菌进行种水平鉴定;通过体外抑菌试验和耐酸、耐胆盐试验评价乳酸菌的益生特性。结果表明,从酸驼乳中分离到的1株疑似乳酸菌被鉴定为短乳杆菌,将其命名为Lactobacillus breris LT;该菌株的代谢产物对4种常见肠道性致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、单增李斯特菌)均表现出良好的抑菌特性,且抑菌特性不受胃蛋白酶和胰蛋白酶的影响;该菌株能够在低p H值(2.0、3.0)和高胆盐含量(0.1%~0.3%)的MRS培养基上生长。该研究结果为酸驼乳中优质乳酸菌资源的开发利用提供了科学依据。     

优良抑菌活性乳酸菌对玉米青贮及有氧暴露期微生物数量和pH的影响

为了探讨乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露后青贮饲料中乳酸菌、好氧细菌、酵母菌和霉菌数量及其pH的影响,进一步筛选出可提高青贮饲料品质和有氧稳定性的乳酸菌接种剂,将实验室前期从甘肃各地玉米秸秆青贮饲料中分离筛选获得的5株产酸快、多且具有抑菌活性的优良乳酸菌分别添加全株玉米进行青贮,分析青贮过程和有氧暴露后青贮饲料中乳酸菌、好氧细菌、酵母菌和霉菌数量的动态变化及pH。结果显示,在青贮过程和有氧暴露后,分别添加肠膜明串珠菌肠膜亚种B1-7、戊糖片球菌B2-3、植物乳杆菌B3-1、屎肠球菌B5-2和发酵乳杆菌E2-3的各处理组乳酸菌总数均显著高于对照组,而好氧细菌、酵母菌和霉菌数量均显著低于对照组,pH亦低于对照组。其中B1-7和B5-2处理组在青贮初期乳酸菌总数最多,从青贮第7天开始到有氧暴露的30 d内,始终是B3-1处理组乳酸菌总数最多,好氧细菌、酵母菌和霉菌数量最少、pH最低。以上结果表明这5株乳酸菌具有提高青贮饲料品质和有氧稳定性的潜力,其中植物乳杆菌B3-1的效果最好。     

苜蓿青贮饲料中优良乳酸菌菌株的筛选

本研究从苜蓿（Medicago sativa L.）青贮饲料中分离得到若干株乳酸菌,对所有菌株进行生长曲线和产酸速率测定,发现其中8个菌株产酸速率较快,能于24h内将培养基pH值降至4.0以下。根据形态、生化鉴定及16S rDNA同源性序列分析,鉴定4株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）,2株为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）,1株为类植物乳杆菌（Lactobacillus paraplantarum）,1株为副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）。通过适当的工艺处理其有望作为乳酸菌添加剂单独或混合添加入青贮中以提高青贮饲料品质。     

玉米秸秆和白菜尾菜混贮料的乳酸菌多样性及耐高温优良菌株筛选

通过形态特征、生理生化特性及16S rRNA序列分析方法对玉米(Zea mays)秸秆和白菜(Brassica pekinensis)尾菜混贮料中的乳酸菌多样性进行分析,并以温度和p H为限制因素筛选优良乳酸菌菌株。结果表明,分离得到的12株乳酸菌分属于乳杆菌属(Lactobacillus)和片球菌属(Pediococcus)。其中,1株(LB-1)为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),6株(LB-2、LB-4、LB-7、LB-8、LB-9和LB-11)为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus),3株(LB-5、LB-6和LB-12)为短乳杆菌(Lactobacillus brevis),2株(LB-3和LB-10)为类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。菌株LB-3和LB-8表现出优良的耐高温、耐酸碱特性,且具有较强的产乳酸能力,二者可作为青贮饲料的乳酸菌添加剂。     

1株鲤鱼源植物乳杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析

【目的】筛选具有优良益生特性的鲤源乳酸菌作为水产养殖用微生态制剂候选菌株。【方法】以鲤鱼肠道内容物及黏膜为菌株的分离来源，采用MRS培养基进行菌株分离纯化，经16S rRNA测序鉴定后，对分离菌株生长特性、产酸能力、耐酸、耐胆盐、抑菌特性、药物敏感性及安全性等生物学特性进行分析。【结果】试验成功分离到1株植物乳杆菌，将其命名为YY001，该分离株在MRS培养基上菌落形态为圆形、表面光滑、边缘整齐、呈乳白色，革兰氏染色为阳性、无芽孢、两端钝圆的短小杆菌；4 h后进入对数期生长，12 h后生长达到稳定期；具有较强的产酸能力，产酸曲线显示，0~12 h pH迅速下降，培养16 h的菌液pH达3.8；在pH 3.0和0.3%胆盐的条件下具有一定耐受性；该分离株对水产常见致病菌柱状黄杆菌、维气氏单胞菌和嗜水气单胞菌均具抑菌效果，且对柱状黄杆菌的抑菌效果最显著，抑菌圈直径达34.19 mm；药物敏感性试验结果显示，分离株对卡那霉素、链霉素和万古霉素耐药；每天一次连续1周灌胃10⁸CFU分离菌株对小鼠无毒害作用。【结论】本研究分离到的菌株YY001具有优良的生物学特性，可作为水产养殖用微生态制剂候选菌株，为后续制备鲤鱼用微生态制剂奠定基础。     

自然青贮多花黑麦草优良乳酸菌的筛选及对多花黑麦草青贮品质的影响

为了筛选出适用于多花黑麦草青贮发酵的优良乳酸菌菌株,从自然青贮多花黑麦草中分离乳酸菌,筛选并鉴定生长快速且产酸效率高的菌株,分析其生理生化特征以及对多花黑麦草青贮品质的影响。利用传统的平板培养法,从自然青贮多花黑麦草中分离获得180株乳酸菌。其中,5株乳酸菌生长快速且产酸能力强,均能够在NaCl浓度为3.0%,温度为15~35 ℃,pH为3.5~7.0的MRS液体培养基中良好生长。经16S rRNA基因序列比对鉴定,菌株PR_LAB_9、PR_LAB_34、PR_LAB_67和PR_LAB_86为植物乳杆菌,PR_LAB_76为戊糖片球菌。对菌株进行生长曲线和产酸性能测定,该5株乳酸菌均能够在12 h内快速繁殖和产酸,菌株PR_LAB_76在24 h内生长速率和产酸效率均优于其他4株乳酸菌。进一步分析添加该5株乳酸菌对多花黑麦草青贮发酵品质、营养成分、微生物数量的影响,发现该5株乳酸菌均能提高多花黑麦草的青贮品质,包括显著降低青贮料pH和氨态氮含量,减少干物质损失,提高可溶性碳水化合物含量。其中,菌株PR_LAB_76处理组多花黑麦草青贮品质最优,干物质含量、粗蛋白含量、乳酸含量、乳酸菌数量显著高于其他4株乳酸菌处理组,且pH值、酵母菌数量显著低于其他4株乳酸菌处理组。综上,戊糖片球菌PR_LAB_76可作为多花黑麦草青贮的备选菌株。     

猪源乳酸菌抑制致病性大肠埃希菌研究

为筛选能够抑制猪源致病性大肠埃希菌的优势乳酸菌,采集不同日龄的健康仔猪新鲜粪便,分离纯化得到35株疑似乳酸菌。应用牛津杯法对3株致病大肠埃希菌抑制作用进行研究,筛选出2株有抑菌作用的疑似乳酸菌(11号和14号)。利用生化鉴定和16SrDNA序列同源性分析,该两株菌被鉴定为乳杆菌属唾液乳杆菌;综合牛津杯法和生长曲线、pH的测定结果,筛选出产酸性能和抑菌效果好的14号菌株,为研制仔猪用微生态制剂奠定了基础。     

青藏高原燕麦附着耐低温乳酸菌的筛选与鉴定

为筛选出能改善燕麦低温青贮发酵品质的潜力乳酸菌菌株,对青藏高原不同海拔地区种植的燕麦表面附着乳酸菌资源进行了采集,通过限制性培养方法筛选耐低温菌株,对其耐酸性和耐盐性、产酸速率和生长速度进行分析比较,并用16S rDNA序列分析方法进行了鉴定。结果表明：从不同海拔地区的燕麦植株上初步分离到232株乳酸菌,经进一步革兰氏染色、镜检观察和过氧化氢酶试验筛选,获得56株菌株,对其进行低温筛选,共得到18株耐低温乳酸菌资源,均能在5~20 ℃、3.0%和6.0% NaCl以及pH为3.0~5.0条件下生长,其中14株为同型发酵乳酸菌,4株为异型发酵乳酸菌。14株同型发酵乳酸菌中,OCPP₃、OL₃、OL₈、OL₂₅、OL₃₆、OL₅₄、OL₇₇和OL₁₂₂的产酸和生长速率较高,3株（OCPP₃、OL₃₆和OL₇₇）为戊糖片球菌,2株（OL₃和OL₅₄）为戊糖乳杆菌,3株（OL₈、OL₂₅和OL₁₂₂）为植物乳杆菌。在培养25 h后,菌株OL₇₇的OD值在所有培养菌株中最高（2.52）,其次为OL₅₄（2.50）。从耐低温、产酸速率和生长速率及多样性角度综合考虑,戊糖片球菌OL₇₇、戊糖乳杆菌OL₅₄和植物乳杆菌OL₁₂₂适宜作为青藏高原地区燕麦低温青贮的备选添加菌株。     

青贮饲料中乳酸菌的分离鉴定及优良菌株筛选

为研究青贮饲料中乳酸菌的分类及形态学与生理生化特性,从苜蓿(Medicago sativa L.)及玉米(Zea maysL.)青贮饲料中分离得到5株乳酸菌。经16S rRNA序列分析,2株(GI7,GI24)为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici),其余3株(GI11,GI44,GI62)分别为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum);5株菌均为同型发酵乳酸菌,除弯曲乳杆菌GI44在pH3.0,4.0,8.0等条件下不能生长外,其余菌株均可在5,10,40,45℃等不同温度条件下、pH3.0~8.0等环境下以及3.0%和6.5%NaCl溶液中良好生长或微弱生长。同时,通过产酸速率和生长曲线等指标筛选出产酸较快、生长迅速的GI62可作为制备乳酸菌青贮饲料添加剂的优良菌株。     

红茶菌中乳酸菌的筛选及其生长特性

红茶菌又名海宝,是一种由酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等多种微生物发酵而成的传统酸性茶饮料。实验从红茶菌中对乳酸菌进行分离和纯化,然后对纯化所得乳酸菌进行鉴定。结果表明：从红茶菌中分离出的4 株菌（分别编号为XC、XD、XL和XQ）均为植物乳杆菌,且在培养14 h时达到稳定期;在4 株乳酸菌的生长过程中,pH值和滴定酸度均呈下降趋势;菌株XC、XD、XQ的最适接种量均为4%,菌株XL的最适接种量为6%;4 株乳酸菌的最适生长温度均为30 ℃,且均不耐盐;4 株乳酸菌对胆盐和酸度均有不同程度的耐受性,其中菌株XQ对