甘蔗谷胱甘肽硫转移酶基因SoGST-1a的克隆与表达分析

克隆甘蔗谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferase,GST)基因,并分析其序列特征和表达谱,为甘蔗抗旱育种提供基因来源。本研究采用电子克隆和RT-PCR技术从甘蔗品种‘新台糖22号’中克隆到一个甘蔗GST基因,命名为SoGST-1a。通过生物信息学软件分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR检测其表达谱。序列分析表明该基因cDNA全长702 bp,编码224个氨基酸,预测的蛋白分子式为C₁₁₁₇H₁₇₅₀N₃₀₀O₃₂₈S₆,蛋白分子量为24.82 kDa,等电点为5.96。蛋白疏水性分析推测其为亲水性蛋白。保守结构域预测表明SoGST-1a蛋白具有2个GST结构域。系统进化树分析表明该基因与玉米Zeta类GST蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,干旱胁迫下SoGST-1a基因下调表达。研究结果表明,SoGST-1a基因可能在甘蔗干旱胁迫中并不发挥一定作用。这些结果为深入了解SoGST-1a基因的生物学功能奠定了基础。     

陆地棉光合系统Ⅱ GhPsbS基因的克隆及其表达分析

以拟南芥光合系统Ⅱ PsbS蛋白序列为探针,采用电子克隆与同源克隆结合的方法得到陆地棉光合系统Ⅱ PsbS基因的cDNA序列(GenBank No.ANS53414),进行序列分析,并对其在不同处理下的表达水平进行研究。结果表明:该基因开放阅读框全长837 bp,编码278个氨基酸,蛋白分子量大小为22 kD,为疏水性蛋白,含有两个典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域,属于典型的叶绿素a/b结合蛋白家族中的成员。qRT-PCR分析表明,强光、弱光、干旱、高盐、低温胁迫处理后,该基因的表达量整体均呈下降趋势,推测该基因不仅能响应不同光照处理,还能够响应干旱、高盐和低温胁迫,尤其受弱光、高盐和干旱胁迫的诱导表达较为明显。该研究为进一步了解GhPsbS基因对陆地棉高光效育种及抗逆机制的研究提供帮助。     

绿竹cab-BO2基因的克隆及其表达载体的构建

捕光叶绿素a/b结合蛋白基因是绿色植物光合系统中的重要基因,其编码的蛋白与色素所形成的蛋白复合体在光化学反应、光保护等方面都起着重要的作用.采用RT-PCR技术和与RACE-PCR技术,从绿竹中克隆到捕光叶绿素a/b结合蛋白基因的全长cDNA编码区,命名为cab-BO2(GenBank登记号:EF088668).该基因编码区长为792 bp,编码263个氨基酸.通过加酶切位点的方法,将基因的编码区直接构建到载体pBI121多克隆位点.经过酶切检测,获得了包含35S启动子、cab基因、GUS报告基因和NOS终止区域的植物表达载体.     

甘蔗S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(ScSAM)的克隆及表达

利用RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号(ROC 22)中克隆获得SAM基因的cDNA序列,命名为ScSAM,GenBank登录号为KC172558。用生物信息学方法预测分析其序列,cDNA全长1466 bp,含有1个1191 bp的完整开放阅读框(ORF),编码396个氨基酸,与高粱和玉米等植物的SAM蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScSAM与高粱的SAM蛋白亲缘关系较近。Real-time PCR分析表明ScSAM为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的3.6倍。其在黑穗病菌胁迫和低温(4℃)、聚乙二醇(PEG)、NaCl非生物胁迫下均被诱导表达,但表达模式不同;在H₂O₂胁迫下其表达被抑制。推测其可能参与甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱、抗盐和抗氧化等胁迫过程中也起某种作用。     

碱胁迫对水稻叶绿素及叶片脯氨酸和可溶性糖含量的影响

通过对沙培的4.5叶龄水稻幼苗进行5个浓度的Na₂CO₃+NaHCO₃碱胁迫处理,胁迫20d后,调查顶端叶片相对含水量、叶绿素、脯氨酸和可溶性糖含量。结果表明,随碱浓度增加叶片相对含水量先升后降;叶绿素a、b含量及叶绿素a/b为下降趋势;脯氨酸、可溶性糖含量先降后升;可溶性糖与脯氨酸含量二者具有显著相关性。碱胁迫后,对叶绿素a含量的影响较大,叶绿素b含量相对稳定;水稻通过可溶性糖含量的变化调节顶端叶片含水量及脯氨酸含量,以提高自身的抗逆性和保持新生叶片的活性。     

藻类响应缺铁胁迫的光合机制研究进展

为了深入了解缺铁胁迫对藻类光合作用的影响,本文归纳了铁在光合电子传递链中的重要作用,总结了铁缺乏对藻类光合原件的破坏作用以及藻类的光合响应机制。围绕光合电子传递链,对容易受到铁缺乏影响的叶绿素、光系统、捕光天线等光合元件进行了归纳总结。研究得出,缺铁胁迫严重破坏藻类叶绿素的生物合成,影响光系统I(PSI)、光系统II(PSII)及其外周捕光天线的含量、活性和蛋白稳定性。藻类通过在光系统周围产生新的铁诱导蛋白或功能替代蛋白,调整光系统与捕光天线之间的结构与功能,应对缺铁胁迫。     

甘蔗Rieske Fe/S蛋白前体基因ScPetC的克隆及表达分析

细胞色素b6f复合体还原型铁硫蛋白前体(Cytochrome b6f complex Rieske Fe/S precursor protein, PetC)是由细胞核PetC基因编码的蛋白,其成熟蛋白参与构成细胞色素b6f复合体,是电子传递的重要元件。基于前期构建的受高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus, SrMV)侵染的甘蔗转录组数据库,从主栽甘蔗品种‘新台糖22号’叶片中成功克隆到该基因,并命名为ScPetC (GenBank登录号为MH333037.1)。生物信息学分析发现, ScPetC基因cDNA全长824bp,包含了一个678bp的开放阅读框,编码226个氨基酸。ScPetC属于PRK13473超家族,其C末端具有典型的Rieske保守结构域;蛋白理论等电点为8.19,属于稳定的、亲水性蛋白;二级结构多为无规则卷曲,三级结构预测其比其他植物PetC多出一段α螺旋结构。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达中, ScPetC定位于叶绿体、细胞质和细胞膜。尽管前人研究表明, ScPetC的表达量会受SrMV侵染的影响,不同于半夏(Pinellia ternata) PetC与大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV) P1蛋白之间的互作, ScPetC不能与SrMV-P1蛋白互作,但能与甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus, SCYLV) P0蛋白互作。实时荧光定量PCR分析表明, ScPetC基因在甘蔗不同组织中均有表达,但在叶片中的表达量最高。甘蔗受脱落酸胁迫3 h时, ScPetC表达量显著上调,但是随着处理时间的延长,表达受到抑制;在茉莉酸甲酯、水杨酸、氯化铜、氯化镉和氯化钠胁迫下,ScPetC表达量均显著下调。本研究通过对ScPetC生物学功能、环境外源激素与重金属等胁迫下的表达模式及其与甘蔗病原病毒蛋白互作的初步探究,增加了对甘蔗PetC的了解,也为深入研究其在甘蔗受黄叶病毒侵染中的作用奠定基础。     

不同品种小麦灌浆期旗叶光合特性及光合基因表达对臭氧浓度升高的响应

利用开放式臭氧(O₃)浓度升高平台,以不同小麦品种(烟农19和扬麦16)为供试作物,研究了O₃浓度升高条件下不同品种灌浆期叶片光合特性和光合基因表达的差异。结果表明,与对照处理相比,O₃浓度升高处理达75d导致小麦灌浆期叶片光合响应参数表观量子效率、最大净光合速率和叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量下降,使得小麦灌浆期叶片总可溶性糖、蔗糖、果糖、葡萄糖含量增加。通过荧光定量PCR测定发现, O₃浓度升高还引起小麦叶片叶绿体编码基因psaA、psbA和rbcL基因表达下调。不同小麦品种光合生理指标和叶绿体基因表达水平的变化幅度不同,烟农19的响应幅度均大于扬麦16。该研究结果可为O₃污染环境下不同小麦品种光合响应差异机制和小麦耐性品种的选育提供理论依据。     

高温胁迫对水稻光合PSII系统伤害及其与叶绿体D1蛋白间关系

以水稻结实期的人工控温试验测定不同温度处理下水稻旗叶光合速率、叶绿素荧光参数的动态变化,并结合Western印迹与胶体金标记技术对叶肉细胞类囊体膜中D1蛋白的表达检测与活性定位,探讨了高温胁迫对D1蛋白存在形态与活性分布的影响,以及D1蛋白表达与叶片光合速率、PSII荧光参数的联系。结果表明,高温处理下叶片净光合速率下降、PSII潜在活性(F_v/F_o)和PSII光能转化效率(F_v/F_m)降低,且随着高温胁迫时间的持续和叶片功能的衰退,类囊体膜结构损伤越严重,光能转化效率越低;在D1蛋白的两类存在形态中,非磷酸化D1蛋白和磷酸化D1蛋白在高温胁迫下的表达量均有所下降,但前者下降更明显;高温处理下控制D1蛋白表达的叶绿体psbA基因在转录水平呈下调表达,使D1蛋白合成及周转过程受到抑制,进而类囊体膜PSII反应中心的功能受损与叶绿体光合效率下降,揭示高温胁迫对叶片PSII系统的伤害受D1蛋白磷酸化过程和psbA基因表达变化的共同作用,进而影响不同水稻品种在高温胁迫下的光合速率和耐热性。     

甘蔗磷脂酰肌醇转运蛋白基因ScSEC14响应干旱和盐胁迫

Sec14-like磷脂酰肌醇转运蛋白(Sec14-like phosphatidylinositol transfer proteins, PITPs), 广泛存在于真核生物细胞中, 参与肌醇磷酸代谢、膜运输、极性生长、信号转导、逆境胁迫等多种重要的生命过程。甘蔗中响应干旱和盐胁迫的Sec14-like基因尚未见报道。本研究从甘蔗受黑穗病胁迫的转录组数据库中获得一条SEC14基因序列, 并利用RT-PCR技术克隆得到甘蔗SEC14基因cDNA全长序列, 命名为ScSEC14 (GenBank登录号为MG571103)。生物信息学分析显示, ScSEC14基因全长1617 bp, 包含一个1008 bp的完整开放阅读框, 编码335个氨基酸; ScSEC14为不稳定的亲水性蛋白, 不存在信号肽; 蛋白二级结构元件多为α-螺旋, 具有典型的SEC14结构域和CRAL_TRIO_N结构域。此外, 系统进化树分析揭示, 该蛋白属于Sec14-like蛋白家族的SSH (soybean Sec14 homolog group)亚家族。亚细胞定位结果表明, ScSEC14蛋白主要定位于细胞膜。实时荧光定量PCR分析发现, ScSEC14基因在甘蔗中组成型表达, 在蔗皮中的表达量最低, 蔗叶中的表达量最高, 约为蔗皮的4.9倍; 该基因在PEG、NaCl、CaCl₂和水杨酸(SA)胁迫下的表达量均上调。因此, 甘蔗ScSEC14基因可能参与Ca ²⁺和SA介导的抗逆信号通路, 积极响应逆境胁迫, 尤其调节了干旱和高盐环境下的抗逆性。     

甘蔗ABA信号转导关键酶SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶(SnRK)是植物体内ABA信号转导途径的关键调控酶, 在植物的抗逆境生长过程中发挥着重要的作用。本研究通过RT-PCR和RACE-PCR技术克隆出编码甘蔗SnRK2蛋白的基因SoSnRK2.1。该基因cDNA序列全长为1385 bp, 包含一个1002 bp的开放阅读框(ORF)。根据氨基酸序列预测SoSnRK2.1基因编码333个氨基酸残基, 与其他高等植物中相关蛋白的氨基酸具有高度的相似性, 尤其是与禾本科的玉米和水稻。构建该基因的原核表达载体pET-SoSnRK2.1, 在IPTG诱导下可得到38 kD 左右的蛋白, 与理论值一致。实时荧光定量PCR分析表明, SoSnRK2.1基因在ABA、干旱(PEG)+ABA、干旱(PEG)、NaCl、低温(4℃)和H₂O₂外源胁迫下均呈诱导表达的趋势。推测该基因参与调控干旱、高盐和低温等胁迫过程, 在甘蔗抗逆境胁迫中起重要作用。     

拟南芥低叶绿素荧光LCF3基因的克隆与功能分析

叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用。本研究借助叶绿素荧光成像仪, 从拟南芥EMS诱变突变体库中筛选到一株低叶绿素荧光突变体lcf3-1 (lower chlorophyll fluorescence 3-1)。遗传分析表明lcf3-1突变体为单基因隐性突变。突变基因图位克隆结果显示LCF3是PsbW的等位基因。另外, LCF3基因的T-DNA插入突变体及功能回补转基因植物的叶绿素荧光分析结果, 均证明LCF3基因突变导致拟南芥叶绿素荧光F_v/F_m值降低。进一步实验证明LCF3蛋白定位于叶绿体, 且LCF3基因在植株中普遍表达。PsbW蛋白可能细微调整PSII-LHCII超复合体的组装及稳定。     

猪HK2基因的克隆及序列分析

为克隆猪己糖激酶2基因,分析其生物功能,采用已报道的人及小鼠HK2的cDNA序列为依据,利用电脑克隆策略获得的ESTs设计引物,扩增新的猪HK2基因cDNA序列。将PCR产物克隆测序,分析获得的核苷酸序列及其编码蛋白的特性,分离的开放阅读框全长2754bp,编码917个氨基酸,与人和小鼠的核苷酸序列同源率分别为90%和87%,与人和小鼠的氨基酸序列同源率分别为96%和94%,利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其蛋白结构,为进一步开展猪HK2基因的结构功能、表达调控的相关研究奠定了基础。     

香蕉MuMA DS2的克隆、序列分析和表达分析

根据抑制缩减文库获得的一个MADS-box基因片段,从香蕉果实cDNA文库中,采用RT-PCR技术分离获得一个全长cDNA,经序列测定和同源性分析表明,该cDNA含705bp的完整的开放阅读框,编码234个氨基酸残基的MADS-box蛋白,将其命名为MuMADS2。MuMADS2具有植物MADS-box基因家族中特有的M、I、K和C四个结构域,与芦笋、风信子、蝴蝶兰和百合的MADS-box基因的氨基酸序列存在很高的一致性（82%、78%、77%和75%）。将MuMADS2与其它植物来源的MADS-box基因进行序列比较发现,MuMADS2属于MADS-box基因的AGAMOUS亚族的D世系。RT-PCR分析表明,MuMADS2仅在生殖器官（花和果）中表达,在营养器官（根、茎和叶）中不表达。进一步分析发现MuMADS2仅在雄花和雌花的子房、由雌花发育而成的果实中表达,而在雄花和和雌花的柱头和花柱都不表达。推测MuMADS2可能在果实的发育和成熟过程中起作用。     

圆果黄麻纤维素合成酶基因CcCesA1的克隆、反义载体构建及转化拟南芥

以圆果黄麻(Corchorus capsularis L.) “179”茎部韧皮为材料,利用同源克隆和RACE技术,克隆黄麻纤维素合成酶基因CcCesA1 5¢端500 bp序列外的全部cDNA。其序列长度为2529 bp,编码627氨基酸残基,经Blast基因比对和蛋白质结构分析,确定是黄麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析表明,CcCesA1在植株不同部位表达量具组织差异性,依次为茎部韧皮>根>叶>顶芽>麻骨。利用CcCesA1基因部分cDNA序列和3¢UTR区,构建黄麻CcCesA1基因反义载体,用测序验证的阳性质粒转化模式植物拟南芥。Southern结果表明,外源基因以单拷贝方式整合进入基因组,转基因拟南芥生长严重受阻,植株变得矮小且茎部易弯曲倒伏,角果数量变少,长度变短,纤维素含量有不同程度的降低,本研究结果表明,所克隆的黄麻CcCesA1基因除了参与植物其他生理代谢过程外,还参与纤维素的生物合成。     

两种苎麻纤维素合酶基因cDNA序列的克隆及表达

从苎麻转录组数据出发, 利用Blast工具从中分析出与多种植物纤维素合酶高度相似的片段CL789和Unigene20360。根据片段信息设计特异性引物, 从苎麻[Boehmeria nivea (Linn.)Gaud.]栽培种湘苎3号中克隆纤维素合酶核心片段, 并利用5'及3'RACE技术获得2个片段的全长cDNA。两者都具有典型的纤维素合酶特征结构域, 表明为2个苎麻纤维素合酶基因CesA的cDNA序列, 分别命名为BnCesA2和BnCesA3。BnCesA2基因编码区全长度3240 bp, 编码1 079氨基酸多肽; BnCesA3基因编码区全长3120 bp, 编码1039氨基酸多肽。对BnCesA2和BnCesA3基因在湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻苎麻品种木质部和韧皮部荧光定量PCR分析显示, 2个基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部都有表达, 但表达量存在着一定差异, 整体而言BnCesA2具有更高的表达水平, 其木质部和韧皮部的表达都为BnCesA3的2~5倍。推测BnCesA2和BnCesA3都参与了苎麻细胞壁的次生合成。     

籽粒苋AhNAD-ME的序列特征与表达

NAD(P)-苹果酸酶催化苹果酸氧化脱羧,产生丙酮酸和CO₂,伴随NAD(P)的还原。在C₄植物中,苹果酸酶参与了C₄光合作用。本研究对克隆的双子叶C₄植物籽粒苋NAD-苹果酸酶基因(AhNAD-ME)编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析,结果表明, AhNAD-ME具有苹果酸酶的完整功能域,包括苹果酸N端结构域和苹果酸酶的NAD结合结构域;进化树表明, 该序列属于NAD-ME的α亚基,该亚基定位于线粒体基质中。半定量RT-PCR分析表明,该基因主要在叶片和茎中表达,表达量随光照时间延长而增加。将AhNAD-ME基因重组到原核表达载体pEASY-E1中,电击法转化到大肠杆菌Transette (DE3)菌株中,IPTG诱导其高效表达,表达的融合蛋白的分子量与预期相符,主要以包涵体形式存在。     

燕麦葡聚糖合酶基因AsCSLH的克隆及特征分析

β-葡聚糖是燕麦发挥保健作用的重要功能因子,分离其合成关键基因有助于解析燕麦β-葡聚糖积累的分子机制。以高β-葡聚糖燕麦地方品种夏莜麦为材料, 通过RACE和染色体步移的方法克隆了燕麦β-葡聚糖合酶基因AsCSLH及其基因组序列并分析其序列结构特征,采用半定量RT-PCR方法研究该基因组织表达特性。分离出的燕麦CSLH基因包含6个内含子, 内含子剪接方式均符合GT/AG剪接规则,编码区全长2 277 bp,在序列上与水稻CSLH基因的编码区序列相似性最高并且所预测的编码蛋白含有相关多糖合成酶保守结构域。AsCSLH基因在燕麦各组织中均有表达,在灌浆期籽粒中表达水平最高。推测AsCSLH基因在燕麦籽粒的β-葡聚糖合成中起重要作用。     

Complementary DNA (cDNA) cloning and functional verification of resistance to head smut disease (<Emphasis Type="Italic">Sphacelotheca reiliana</Emphasis>) of an NBS–LRR gene <Emphasis Type="Italic">ZmNL</Emphasis> in maize (<Emphasis Type="Italic">Zea mays</Emphasis>)

The nucleotide-binding site (NBS)-leucine-rich repeat (LRR) gene family comprises the largest number of known disease resistance (R) genes and is one of the largest gene families in plants. In the present study, the full-length cDNA of ZmNL (GenBank Accession Number KF765443) was isolated using Rapid Amplification of cDNA Ends. The nucleotide sequence of ZmNL contains an open reading frame of 3156 bp that encodes the ZmNL protein, which is comprised of 1051 amino acid residues. This putative protein has high homology to other known resistance proteins (84% to Triticum aestivum LR10) and belongs to the CC–NBS–LRR type R gene family. The ZmNL gene was introduced into the maize inbred line of Huangzao4 which was highly susceptible to head smut under the control of the maize ubiquitin promoter by Agrobacterium-mediated transformation. The head smut disease incidence of 3 T₂ transgenic lines was significantly reduced (by 18.38–29.40%) compared with the wild type, which indicated that the overexpression of ZmNL gene in maize enhanced the resistance to the fungus Sporisorium reilianum (Kühn) Clint of these plants.     

水稻极矮突变体s2-47对赤霉素的响应及基因定位研究

通过EMS诱变日本晴获得1个极端矮化突变体s2-47,其表型为极度矮化、叶色深绿、不能抽穗结实。对水稻胚乳的α-淀粉酶诱导实验表明s2-47突变体与GA的信号传导途径无关,外源活性GA₃对水稻幼苗株高的促进实验显示s2-47应与赤霉素的生物合成有关。利用s2-47和Dular构建F₂群体并精细定位表明,s2-47的表型与水稻OsCPS1基因紧密连锁,其编码的柯巴焦磷酸合成酶是赤霉素生物合成途径的第一个关键酶。序列分析发现,s2-47突变体的OsCPS1基因编码区发生了单个碱基缺失导致移码突变。OsCPS1基因在植株地上部都有表达,在节中表达最高。OsCPS1基因的表达受外源GA₃抑制,但在s2-47突变体中表达上调。